兔病毒性出血症DNA疫苗研究进展
付强 郭广君 程立坤 王艳
摘要：兔病毒性出血症是养兔业最重要的疾病之一，其发病急，致死率高，可对养兔业造成巨大的经济损失，在疫苗研究方面，由于传统组织灭活疫苗存在诸多缺点，迫切需要研制新型疫苗。本文主要从兔病毒性出血症DNA疫苗的构建、免疫佐剂、临床免疫途径以及临床使用的效果等方面进行简要介绍。
关键词：兔瘟；DNA疫苗；甲病毒复制子载体疫苗；免疫
中图分类号：S858.291 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）08-0082-03
兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD），俗称兔瘟，是由兔出血症病毒（RHDV）引起的一种高度接触性、致死性传染病，该病毒属杯状病毒科、兔病毒属。1984年中国第一次报道了该病，一年后韩国也有了报道，随后在1987～1989年间，该病迅速在欧洲蔓延，给养兔生产造成了巨大的经济损失。感染兔通常48～72 h死亡，表现出以肝变性坏死和肺出血为典型特征的组织病变，1989年OIE将该病正式列为“国际动物保健编目” B类传染病，我国将该病划分至二类动物传染病[1]。衣壳蛋白VP60为RHDV惟一的结构蛋白，在诱导宿主免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原，在新型诊断制剂、疫苗的研制中具有十分重要的应用价值。在疫苗研制方面除了组织灭活苗外，还出现多种新型疫苗，其中DNA疫苗因其安全、稳定、高效而得到广泛研究。目前，DNA疫苗已在病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫免疫、抗肿瘤免疫、预防变态反应中发挥了巨大的作用，目前在国外已有4种兽用DNA疫苗获得批准上市，分别为传染性造血器官坏死病毒DNA疫苗、西尼罗河病毒DNA疫苗、犬黑色素瘤DNA疫苗和生长激素释放激素DNA产品[2]，标志着DNA疫苗开始真正步入了产业化应用阶段。本文主要从DNA疫苗在兔病毒性出血症的应用研究方面作简要介绍。
1 兔瘟疫苗研发动态
在兔瘟的防治中，目前广泛应用的兔病毒性出血症灭活疫苗，系用兔病毒性出血症病毒接种易感家兔，收获含毒组织制成乳剂，经甲醛溶液灭活后制成[3]。在制备过程中，如果兔舍卫生状况、肝脾摘取、病毒灭活等环节控制不严，会造成散毒、染菌，疫苗物理性状为组织颗粒悬浮液，免疫时易堵塞针头，此外，生产每批次疫苗需要攻毒上百只兔子，成本高，也不符合动物福利要求。细胞灭活苗制备工艺简单，培养方便快捷，成本较低，污染及散毒都易控制，科研人员曾以RHDV 感染 IBRS-2 细胞、兔睾丸细胞、兔肾细胞和Vero细胞，均已失败告终，至今还没有一种能够使其长期稳定传代的细胞系[4]。但RHDV的血清型比较单一，衣壳蛋白VP60在诱导宿主免疫反应中的重要作用及其相对比较保守的氨基酸序列为基因工程苗的研制提供了方便。据报道，在某些系统中，表达的重组蛋白可自发聚合成病毒样颗粒（VLPs）的衣壳蛋白，并且该产物在物理形态和免疫原性上与完整的自然野毒株相似，但该VLPs不含病毒RNA，不存在散毒的危险，并且可以通过口服途径进行免疫[5]。近年来，RHDV新型疫苗的研究正是以病毒衣壳蛋白VP60为基础，目前国内外学者已在大肠杆菌[6]、酵母[7]、昆虫细胞[8]、腺病毒[9]、羊口疮病毒[10]以及植物[11]等多种表达系统中成功表达了VP60蛋白，所有表达产物都可以诱导机体产生免疫保护抵抗RHDV的致死量攻击。但从目前RHDV基因工程疫苗的研究来看，仍然存在一些问题，比如：不可溶性及免疫效果相对较差的缺点，生物的安全以及生产成本的问题[12]，目前均未能实现疫苗产业化。
2 DNA疫苗概述
DNA 疫苗又称为核酸疫苗、基因疫苗，是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗，采用某种方法直接导入动物细胞内，然后通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而使被接种动物获得相应的免疫保护，以达到预防和（或）治疗疾病的目的[13]。与其他类型的基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有自身的优点：核酸疫苗只采用病毒的部分核酸序列，不存在散毒或返强的危险；不存在病毒活苗的安全性问题；在动物体内进行表达，不存在一般原核表达系统中蛋白翻译后的糖基化问题[12]。鉴于RHDV核酸疫苗研究的必要性以及核酸疫苗本身具有的诸多优点，开发RHDV核酸疫苗存在很大的发展前景。但目前常规DNA疫苗还存在几点不足：比如DNA疫苗导入细胞和机体的效率差，表达水平低；存在遗传毒性、致瘤反应等理论上的安全隐患，基因疫苗的免疫尚未达到预期的理想效果。这些局限促使研究者们去寻找一种高表达、安全性好、能引起较强免疫效果的DNA疫苗载体来克服常规DNA疫苗的不足。
“自杀性”DNA疫苗（suicidal DNA vaccine）就是基于常规DNA疫苗和“自主复制型”RNA疫苗（self-replicating RNA vaccine）基础上发展起来的一种新型疫苗，不仅具有常规DNA疫苗易制备、运输、保存等方面的优点，而且还有“自主复制型”RNA疫苗的安全性与有效性[14]。该疫苗是以甲病毒（Alphaviruses） 尤其是Semliki森林病毒（Semliki Forest virus，SFV） 和Sindbis病毒（SINV） 衍生的DNA/RNA载体，被广泛用于外源基因的表达，在安全性上，自杀性DNA疫苗在动物体内一过性表达外源基因后，随细胞凋亡而被机体清除，避免了DNA质粒可能整合到宿主细胞染色体或可能造成免疫耐受等隐患，自杀性DNA疫苗可通过激活天然的抗病毒途径而打破免疫耐受。在免疫效率方面，自杀性DNA疫苗诱导的免疫反应比传统DNA疫苗高，用低于传统DNA疫苗1/100～1/1 000的剂量免疫，可获得与传统DNA疫苗相当的免疫应答[15]。因此相对于传统DNA疫苗，自杀性DNA疫苗更具备安全、高效的优点。在实际应用中，DNA疫苗的免疫效果跟载体、佐剂、疫苗递送途径等因素密切相关。
3 DNA疫苗的载体
DNA疫苗载体质粒作为编码抗原目的基因表达抗原的工具，其组成与结构特征对DNA疫苗免疫原性有显著影响。用作DNA疫苗的载体必须具备以下特点：在机体细胞内能高水平地表达目的基因；本身不复制；不会整合到宿主染色体中。哺乳动物表达载体能使重组质粒获得高水平表达的重组蛋白。
原冬伟等[16]克隆RHDV WHNRH株的VP60基因，并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中，成功构建了分泌型和细胞内型的重组质粒pcDNA-VP60，可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫，至于VP60 DNA疫苗的实际效果，还需要进一步研究其在兔体内表达及其免疫应答情况。程英杰等[17]通过RT-PCR的方法扩增RHDV衣壳蛋白VP60，将其重组到甲病毒复制子载体pSCA1上，构建了包含RHDV衣壳蛋白VP60的重组复制子载体pSCA1/VP60，借助脂质体将纯化的重组质粒转染BHK-21细胞，该重组质粒在BHK-21细胞中可以表达具有反应原性的RHDV衣壳蛋白，ELISA检测表明该重组质粒在试验兔体内可诱导产生RHDV特异性抗体，淋巴细胞增殖和细胞因子检测表明该重组质粒在试验兔体内可以诱导细胞免疫，与对照组相比，差异性显著。
4 佐剂在兔瘟DNA疫苗中的应用
应用佐剂也是提高DNA疫苗免疫原性有效策略之一。随着对DNA疫苗研究的深入，人们逐渐认识到直接注射裸DNA进行免疫所诱导产生的免疫应答和免疫记忆都不够理想，为了提高DNA疫苗的免疫效果，研究者们选用了不少免疫佐剂来提高DNA疫苗的免疫原性。细胞因子是基因佐剂的一种，为一类可溶性的小分子多肽或蛋白质，通过与细胞膜表面受体相互作用发挥其生理活性。细胞因子在体内能激活和调节免疫细胞，通过不同的作用环节调节或增强DNA疫苗的免疫效应而发挥佐剂作用。多种细胞因子如IL-2、IL-4、IL-12、IL-15、IL-18、GM-CSF及INF-γ等已成功地成为病毒DNA疫苗的免疫佐剂，通过增强机体的细胞和体液免疫应答，从而增强了DNA疫苗的特异性免疫反应[18]。张夏兰[19]为研究分子佐剂pcDNA-IL-6对家兔免疫应答的影响，构建了真核表达质粒pcDNA-IL-6，并将其与pcDNA-VP60、兔瘟组织灭活苗分别共同免疫家兔，用血凝抑制试验检测家兔RHDV特异性抗体水平。结果表明，在免疫后的7～70 d，无论是核酸疫苗pcDNA-VP60或是兔瘟组织灭活苗，与真核重组质粒pcDNA-IL-6共注射免疫组抗体水平均高于未注射pcDNA-IL-6质粒免疫组。结果表明，真核重组质粒pcDNA-IL-6对重组质粒pcDNA-VP60和组织灭活苗的免疫均具有免疫增强作用。
5 疫苗效力检测
疫苗效力检测是评价疫苗是否合格的主要标准，合理有效的免疫途径与接种方式对提高DNA疫苗的免疫效率十分关键，DNA疫苗的免疫途径主要是肌肉注射和皮下注射，其中肌肉注射使用较多，但皮下注射可将抗原更好地传递给提呈细胞，特别是树突状细胞。此外采用菌影[20]、减毒胞内菌[21， 22]通过黏膜自然感染途径运送DNA疫苗成为近年来研究的热点。
Qiu等[23]使用减毒沙门氏菌作为载体通过口服方式递送DNA疫苗来预防RHDV，结果显示减毒沙门氏菌能够有效转导兔腹腔巨噬细胞，重组菌株SL/pcDNA3-VP60能够有效的在兔体内诱导VP60特异性免疫反应，并且可以为攻毒提供约67%的免疫保护，虽然未能全保护，但口服方式最为简便，值得继续优化提高。Yuan等[24]制备DNA疫苗pcDNA-VP60，为评价疫苗的效果，用pcDNA3.1 （+）疫苗与商用灭活疫苗分别免疫兔子，免疫后攻毒试验表明，用DNA疫苗免疫的兔子和商用灭活疫苗具有同等保护效果，均经受住强毒的攻击。Cheng 等[25]构建了一种基于兔病毒性出血症衣壳蛋白优势抗原区域的一种“自杀性”DNA疫苗pSCA/VP60，为评价重组质粒作为DNA疫苗对动物的免疫效果，通过肌肉注射免疫试验兔，并以空载体pSCA1、PBS为试验对照组，以ELISA检测血清RHDV特异性抗体变化，以MTT法检测其外周血淋巴细胞（PBL）的增殖反应活性，以干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）ELISA试剂盒检测体内细胞因子IFN-γ、IL-4水平，以攻毒保护试验评价其诱导的免疫反应抵抗强毒攻击的能力。攻毒保护试验结果表明该DNA疫苗可以抵抗RHDV强毒攻击。
6 小结
DNA疫苗作为第三代疫苗，具有广阔的发展前景，在畜禽传染病方面与猪瘟、猪口蹄疫、禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、传染性支气管炎等相关的DNA疫苗正在研究探索中。虽然还存在一些缺点，如转染效率比较低，这可能是影响其诱导足够的免疫保护力和向临床应用发展的主要因素之一。因此，对质粒载体的进一步改造和提高转染效率的研究，以及在佐剂等方面的研究仍是今后研究的重点。相信在广大科研工作者的共同努力下，一种安全、经济、高效的新型DNA疫苗将早日获得产业化发展。
参考文献：
[1] 高景鹏. 兔出血症病毒亚基因组在昆虫细胞中的表达及其免疫原性研究[D]. 呼和浩特：内蒙古农业大学，2012.
[2] GONALVES G A PRATHER， K L MONTEIRO G A et al. Engineering of Escherichia coli strains for plasmid biopharmaceutical production： Scale-up challenges[J]. Vaccine， 2014：
[3] 中国兽用生物制品规程（兔病毒性出血症灭活疫苗制造及检验规程），2000版
[4] ABRANTES J W Rabbit haemorrhagic disease （RHD） and rabbit haemorrhagic disease virus （RHDV）： a review[J]. Veterinary research， 2012， 43（1）：2879-2981.
[5] CRISCI E， BARCENA J， MONTOYA M Virus-like particles： The new frontier of vaccines for animal viral infections[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology， 2012， 148（3-4）： 211-215.
[6] 张大鹏， 吕 宁， 符容婕， 等. 兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2012， 40（3）： 18-28.
[7] ERLINDA F， R. Conformational and thermal stability improvements for the large-scale production of yeast-derived rabbit hemorrhagic disease virus-like particles as multipurpose vaccine[J]. PloS One， 2013， 8（2）：56417.
[8] CHEN， M， SONG Y FAN Z， et al. Immunogenicity of different recombinant rabbit hemorrhagic disease virus-like particles carrying CD8+ T cell epitope from chicken ovalbumin （OVA）[J]. Virus Research， 2014， 183.
[9] FERNANDEZ E， TOLEDO J R， ChIONG M， et al. Single dose adenovirus vectored vaccine induces a potent and long-lasting immune response against rabbit hemorrhagic disease virus after parenteral or mucosal administration[J]. Vet Immunol Immunopathol， 2011， 142（3-4）： 179-188.
[10] ROHDE J， SCHIRMEIER H， GRANZOW， H， et al. A new recombinant Orf virus （ORFV， Parapoxvirus） protects rabbits against lethal infection with rabbit hemorrhagic disease virus （RHDV）[J]. Vaccine， 2011， 29（49）： 9256-9264.
[11] MIKSCHOFSKY H， SCHIRRMEIER， H， KATZEL A， et al. Expression of truncated CTB：：VP60 in tobacco exhibited no immunogenicity in rabbits[J]. Plant Sci， 2011， 180（2）： 246-250.
[12] 张夏兰， 王红宁， 张昌菊， 等. 兔病毒性出血症基因工程疫苗的研究进展[J]. 中国预防兽医学报， 2007， 29（10）： 821-824.
[13] 郭 杨， 方 刚. DNA疫苗研究进展[J]. 微生物学免疫学进展， 2013， 41（5）： 64-68.
[14] LEITNER W W， YING H， DRIVER， D A， et al. Enhancement of tumor-specific immune response with plasmid DNA replicon vectors[J]. Cancer Res， 2000， 60（1）： 51-55.
[15] 熊海林. 斑点叉尾鮰病毒（CCV）ORF6基因“自杀性”DNA疫苗的构建与免疫效果研究[D].武汉： 华中农业大学， 2011.
[16] 原冬伟， 刘家森， 郭东春， 等. 兔出血症病毒TP株VP60基因DNA免疫小鼠的实验研究[J]. 中国预防兽医学报， 2011， （8）： 653-657.
[17] 程英杰. 兔病毒性出血症基因工程疫苗研究[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2013.
[18] KIM J J， YANG J S， MANSON K H， et al. Modulation of antigen-specific cellular immune responses to DNA vaccination in rhesus macaques through the use of IL-2， IFN-gamma， or IL-4 gene adjuvants[J]. Vaccine， 2001， 19（17-19）： 2496-2505.
[19] 张夏兰， 杨 鑫， 周英顺， 等. 兔IL-6真核表达质粒的构建及其分子佐剂效应的初步研究[J]. 草食家畜， 2012， （3）： 72-75.
[20] MUHAMMAD A， CHAMPEIMONL J， Mayr U B， et al. Bacterial ghosts as carriers of protein subunit and DNA-encoded antigens for vaccine applications[J]. Expert Review of Vaccines， 2012， 11（1）： 97-116.
[21] KONG W BROVOLD M， KOENEMAN B A， et al. Turning self-destructing Salmonella into a universal DNA vaccine delivery platform[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2012， 109（47）： 19414-19419.
[22] JUAREZ-RODRIGUEZ M D， YANG J， KADER R， et al. Live Attenuated Salmonella Vaccines Displaying Regulated Delayed Lysis and Delayed Antigen Synthesis To Confer Protection against Mycobacterium tuberculosis[J]. Infection and Immunity， 2012， 80（2）： 818-831.
[23] QIU L， WANG X， HAO H， et al. Oral administration of attenuated Salmonella typhimurium containing a DNA vaccine against rabbit haemorrhagic disease[J]. J Virol Methods， 2013， 188（1-2）： 108-113.
[24] YUAN D， QU L， LIU J， et al. DNA vaccination with a gene encoding VP60 elicited protective immunity against rabbit hemorrhagic disease virus[J]. Veterinary microbiology， 2013， 164（1）： 1-8.
[25] CHENG Y， CHEN， Z， Li C， et al. Protective immune responses in rabbits induced by a suicidal DNA vaccine of the VP60 gene of rabbit hemorrhagic disease virus[J]. Antiviral Res， 2013， 97（3）： 227-231.
