反向模式—强阳离子交换—反向模式二维色谱法测定人血浆中甲氨蝶呤浓度
盛阳昊+刘丹琦+王萍+周伯庭
摘 要 建立了反向模式-强阳离子交换-反向模式（Reversed phase-strong cation exchange-reversed phase）二维色谱平台测定人血浆中甲氨蝶呤浓度的方法。样品经三氯醋酸沉淀蛋白后，在ASTON C8一级柱（100 mm × 4.6 mm， 5 μm）上完成初分离，通过六通阀切换，经ASTON SCX中间级（20 mm×4.6 mm， 5 μm）二次分离和储存，在SAC C8二级柱（100 mm × 4.6 mm， 5 μm）上完成最后分离， 并测定。一级柱流动相为10 mmol/L醋酸铵-乙腈（90∶10， V/V， 以醋酸调至pH 3.8），流速为1.0 mL/min;中间级流动相为10 mmol/L H3PO4溶液（pH 3.0）;二级柱流动相为50 mmol/L醋酸铵-乙腈（87∶13， V/V， 以醋酸调至pH 5.2），流速为1.2 mL/min，检测波长 306 nm。单次分析时间4 min，线性范围0.09～5.1 μmol/L，检出限为0.005 ?μmol/L，日内RSD小于1.8%，日间RSD小于3.5%，相对回收率99.1%～101.25%，绝对回收率85.7%～86.4%。本方法简便、准确，适合日常血药浓度监测和药代动力学研究。
关键词 二维色谱; 甲氨蝶呤; 高效液相色谱法
1 引 言
甲氨蝶呤（MTX）为二氢叶酸还原酶抑制剂，通过竞争性抑制二氢叶酸还原酶，阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸，推迟和阻碍DNA 和RNA 的合成，发挥抗肿瘤作用，被广泛用于治疗急性淋巴细胞白血病等恶性肿瘤疾病。临床上采用大剂量甲氨蝶呤联合甲酰四氢叶酸钙（ Calcium folinate，CF） 解救疗法治疗儿童急性淋巴细胞性白血病，由于该疗法都是超常规大剂量静脉滴注， 易产生严重的甚至致命的毒性反应， 例如肾衰竭﹑骨髓抑制、肝损害、胃肠道反应、皮肤黏膜反应等， 且剂量与血药浓度个体差异大，必须开展MTX血药浓度检测[1]。测定甲氨蝶呤的方法现主要有荧光偏振免疫法（FPIA）[2]和高效液相法[3～8]。荧光偏振免疫法需要进口免疫试剂盒，因价格高而限制了在临床使用;高效液相具有专一性强、准确度高的特点，大多数文献都是基于一维色谱与不同的检测器联用，如紫外[3～5]、荧光[6]、质谱[7，8]等，其中，液相色谱-质谱联用法灵敏度高，分析速度快，但预处理过程复杂，且购置仪器成本较高。本研究采用二维色谱平台，加上压缩控制流路抑制大体积进样和二维色谱死体积大而造成的峰展宽，运用SCX中间级对色谱网络进行串联修改，实现了样品的大通量快速检测，显著减少了人为干预度和单次分析时间，适用于大样本临床药物浓度测定和药代动力学研究。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
RP-SCX-RP二维色谱平台：3个LC-20A泵、CBM-20A色谱控制器、SIL-20A自动进样器（改装500μL进样环）、DGU-20A自动脱气机、SPD-20A紫外检测器、2个FCV-12AH六通阀，以上各组成单元均购自日本岛津公司;FLC2420柱温箱、ASTON C8一级色谱柱 （100 mm×4.6 mm， 5 μm）、ASTON SCX中间级 （20 mm×4.6 mm， 5 μm）、SAC C8二级柱为 （100 mm×4.6 mm， 5 μm），均购自长沙ANAX分析仪器有限公司;电子天平;PHS-3S PH计（上海精科），XW-80A涡旋混合器（上海青浦西仪器厂）;高速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）。
MTX对照品（中国药品生物制品检定所）;甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）;乙酸铵（美国TEDIA公司）;乙二醇、三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;去离子水由美国Millipore 纯水机制备;患者血清取自中南大学湘雅医院小儿科。
2.2 对照品溶液和质控血清样品的制备
取MTX对照品适量，准确称定，用甲醇溶解和少量DMF助溶，并定容至25 mL， 制成51.54 μmol/L贮备液。取上述标准品储备溶液适量，分别加乙二醇稀释，制成各标准工作溶液。用空白血清和MTX贮备液分别配制浓度为0.0879， 0.2474， 0.6185， 1.546， 3.092和5.154 μmol/L的MTX系列标准血清样品。同法配制浓度为0.2474和3.092 μmol/L的质控血清样品，分装于1.5 mL塑料离心管中，置 Symbolm@@ 20 ℃保存，备用。
2.3 血清样品预处理
取200 μL血清样品，加入10%三氯乙酸溶液600 μL，涡旋混合30 s，14500 r/min高速离心10 min，取上清液200 μL进样分析。
2.4 RP-SCX-RP二维色谱平台测定流程及条件
本二维色谱平台一级柱与二级柱之间通过中心切割作为传输模式，具体采用间接传递技术，并用中间级作为二次分离和储存、转运的场所。
图1为具体运行原理图，PUMP1所对应的一级柱流动相为10 mmol/L醋酸铵-乙腈（90∶10， V/V， 以乙酸调至pH 3.8），流速为1.0 mL/min;PUMP2辅助流路流动相为10 mmol/L H3PO4溶液（pH 3.0）; PUMP3所对应的二级柱流动相为流动相为50 mmol/L乙酸铵-乙腈（87∶13， V/V， 以乙酸调至pH 5.2），〖TP<07091.tif>，+59mm＼.100mm，Y#〗[TS（][HT5”SS] 〖ZK（〗图1 反向模式-强阳离子交换-反向模式二维色谱平台工作原理图
Fig.1 Schematic diagram of reversed phase-strong cation exchange-reversed phase （RP-SCX-RP） two-Dimensional liquid chromatography platform 〖ZK）〗[HT5][TS）]流速为为1.2 mL/min，检测波长为306 nm。
如图1所示，六通阀1和2在图中状态均为On（阀中实线表示相连通），其切换另一状态为Off。在被测组分进样时，六通阀1和2均为On，同时Pump 2启动，运用模拟梯度压缩技术来解决二维色谱平台死体积大和大体积进样时峰展宽问题;然后被测组分在一级柱中分离，同时停止Pump 2，六通阀1和2分别为Off和On;接着通过切换阀切换流路，六通阀1和2均为Off，此时一级柱与中间级相连，转移被测组分，并再一次用启动Pump 2，进一步减少峰展宽，改善峰型。最后通过再一次的阀切换流路，六通阀1和2均为On，将中间级中的被测组分转移到二级柱，完成最后的分离与检测。
3 结果与讨论
3.1 二维色谱网络构建和时间复杂度分析
医院药学部门的大通量药物分析二维色谱平台构建，需重点考察耐久度、经济性、时间复杂度3个重要评估要素。
在复杂生物基质中小分子药物的测定中，二级色谱柱之间常用的传递技术为反冲和中心切割[9]，反冲模式去杂质能力较中心切割模式差，使一级柱头上的强保留物质反冲入二级柱，造成二级柱压力升高，降低耐久度，同时也会增加二级柱的分离难度以及增加二级柱的负载，造成二级柱寿命降低，于是本实验选择中心切割作为平台的传递技术。
运用RAM（Restricted access media）柱和贯流色谱柱直接进样已成为发展趋势，但商品RAM柱成本较高，耐久性不好，不适合医院药学部门的大通量样本检测。而贯流色谱柱粒径较大，柱效低，中心切割范围增大一倍以上，因此本研究采用C8柱与沉淀蛋白取上清进样，样品相对干净，对不同药物的平均柱寿命比RAM相比有较大提高，经济性良好，相比于离线固相萃取和液液萃取，人为干预程度明显减少，能得到更好的准确度与精确度。
医院药学部门因日常TDM监测样品种类多，通量大，必须减少单次分析的时间。基于自动进样器增加通量的方法是对色谱网络进行并联修改[10，11]，但此种方式并不适合中心切割，因为两根并联柱不同，多次进样后损坏程度也不同，切割时间窗口不易制定，且当样品通量较大时，自动进样器的批处理表容易出错。据此，本研究对色谱网络进行串联修改，引入了SCX中间级，将被测组分储存在中间级，使一级柱进下次样品时，中间级的组分被转移到二级柱并同时进行分析，缩短单次循环的时间，使大通量的样品检测时间复杂度大大降低。中间级除担负减少时间复杂度的任务外，还可以进一步分离杂质，净化了到达二级柱的组分，减小二级柱负载。具体原理为通过调整辅助压缩流路的pH值，使MTX保留在SCX柱上。通过观察不同pH值对色谱峰面积的影响。发现在pH 3.0～5.5之间，随着pH值增加，保留量减少，故调整辅助压缩流路pH=3。
3.2 大体积进样和峰展宽控制
大体积进样可以根据分析物质的灵敏度要求提高进样量（常规进样量0～500 μL，最大可改装1000 μL的进样环），获得更低的定量限，扩大了紫外检测器的应用范围，满足日常TDM和药代动力学中代谢物的检测要求.
考虑到大体积进样的应用与二维色谱的柱外效应，本研究运用梯度模拟压缩技术，在柱头部控制峰展宽。梯度模拟压缩具体运行为：在进样和被测组分从第一级色谱转移到中间级时，同时开启Pump 2，使Pump 2所控制的流动相（10 mmol/L H3PO4）进入色谱流路，并根据流速和管路长度计算出关泵时间。
如图2所示，当t=0时，被测组分在柱端进口处，由于辅助压缩流路的开启，被测组分后部的一段流动相有机相浓度由φ1减小为φ2，设浓度φ1的流动相洗脱速度为：
u1=u0/1 + k1
浓度φ2流动相洗脱速度为：
u2 =u0/1 + k2
其中， u0为流动相线速度，k1和k2分别为被测组分在不同浓度流动相中的保留因子。由于u1> u2，峰展宽在柱头被压缩，当t=tf 时，有机相浓度较高的流动相头部“追上”了被测组分头部，整个柱头压缩过程结束。
本实验中MTX进样200 μL，峰展宽约为0.6 min，比一般小体积进样（小于50 μL）的文献峰宽明显变窄[3～5]，可看出运用此技术后效果良好。因大体积进样带来的灵敏度提高效果显著，检出限为0.005 μmol/L， 低于普通配备紫外检测器的高效液相，略高于液相色谱-质谱联用法[7，8]，效费比最高。若要得到液-质联用的检出限水平，还可以继续加大进样量（进样环最大可改装到1000 μL）。
3.5 专属性与样品分析
空白血浆色谱图空白血浆加MTX分别见图3a，图3b，空白血浆图谱在MTX出峰处背景干净，无杂峰干扰，治疗常用合并药物（如阿糖胞苷、柔红霉素、地塞米松）不出峰。取本院小儿科病人血浆按照2.3节进样色谱图见图4c。可见经过二维色谱分离后，MTX峰形尖锐且为基线分离，减少了低浓度时的积分误差。
应用本方法对使用大剂量MTX治疗小儿科患者进行血药浓度监测，两名患者均为女性，年龄分别为6岁和10岁，检测时间点为给药后44和68 h，所有的血浆样品采集后立刻测定。44 h检测结果分别为1.525和0.658 μmol/L，其中第一位患者血药浓度超过44 h血药浓度标准（>1 μmol/L），提示需要用四氢叶酸钙解救;68 h继续测定第一位患者，血药浓度为0.058 μmol/L，达到小于0.1 μmol/L的安全浓度。可停止解救。
4 结 论
本方法采用反向模式-强阳离子交换-反向模式（RP-SCX-RP）二维色谱平台测定人血浆中甲氨蝶呤浓度，运用大体积进样提高灵敏度，模拟梯度压缩技术控制峰展宽，并采用串联修改色谱网络，大大减少了单次分析时间复杂度，人为干预度小、简便、准确，适合临床甲氨蝶呤药物浓度检测和药动学研究。
References
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11 Cass R T， Villa J S， Karr D E， Schmidt D E. Rapid Communications in Mass Spectrometry， ?2001， ?15（6）： 406-412〖ZK）〗
Platform of Reversed Phase-Strong Cation Exchange-Reversed
Phase Two-Dimensional High Performance Liquid Chromatography
for Determination of Methotrexat in Plasma
SHENG Yang-Hao1，2， LIU Dan-Qi1，2， WANG Ping1，2， ZHOU Bo-Ting*1，2
1（The Pharmacy Department of Central South University Xiangyang Hospital， Changsha 410008， China）
2（The Pharmacy of Central South University， Changsha 410008， China）
Abstract A two-dimensional HPLC method was developed for the determination of methotrexat （MTX） in human plasma. The samples were treated with trichloroacetate for sedimentation and high speed centrifugation， and the obtained supernatant was taken for analysis. The analytes in sample were separated on the first dimension column （ASTON C8 100 mm × 4.6 mm， 5 μm）， and trapped on the middle column （ASTON SCX 20 mm × 4.6 mm， 5 μm） using valve-switching technique for purification and storage. Finally， the trapped analytes were transferred to the second-dimension column （SAC C8 100 mm × 4.6 mm， 5 μm） for the second separation. The mobile phase used for the first dimension was 10 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile（9∶1， V/V， pH=3.8） with a flow rate of 1 mL/min and the mobile phase used for middle column was 10 mmol/L phosphoric acid （pH=3.0）. The mobile phase used in second-dimension was a mixed solution of 50 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile （87∶10， V/V， pH=5.2）. UV detection was carried out at ?306 nm and completed in 4 min. The calibration curve showed a linearity range from 0.0879 to 5.154 μmol/L （r=0.99998）. The LOQ was 0.005 μmol/L. The intra-and inter-day precisions were lower than 1.5% and 1.8%， respectively. The relative recovery and the absolute recovery were 99.1%-101.2% and 85.67%-86.35%， respectively. The assay is simple， accurate， reproducible， and suitable for the therapeutic drug monitoring of MTX in the hospital and the study on the pharmacokinetics of MTX.
Keywords Two-dimension liquid chromatography; Methotrexat; High performance liquid chromatography
（Received 19 August 2014; accepted 25 September 2014）
摘 要 建立了反向模式-强阳离子交换-反向模式（Reversed phase-strong cation exchange-reversed phase）二维色谱平台测定人血浆中甲氨蝶呤浓度的方法。样品经三氯醋酸沉淀蛋白后，在ASTON C8一级柱（100 mm × 4.6 mm， 5 μm）上完成初分离，通过六通阀切换，经ASTON SCX中间级（20 mm×4.6 mm， 5 μm）二次分离和储存，在SAC C8二级柱（100 mm × 4.6 mm， 5 μm）上完成最后分离， 并测定。一级柱流动相为10 mmol/L醋酸铵-乙腈（90∶10， V/V， 以醋酸调至pH 3.8），流速为1.0 mL/min;中间级流动相为10 mmol/L H3PO4溶液（pH 3.0）;二级柱流动相为50 mmol/L醋酸铵-乙腈（87∶13， V/V， 以醋酸调至pH 5.2），流速为1.2 mL/min，检测波长 306 nm。单次分析时间4 min，线性范围0.09～5.1 μmol/L，检出限为0.005 ?μmol/L，日内RSD小于1.8%，日间RSD小于3.5%，相对回收率99.1%～101.25%，绝对回收率85.7%～86.4%。本方法简便、准确，适合日常血药浓度监测和药代动力学研究。
关键词 二维色谱; 甲氨蝶呤; 高效液相色谱法
1 引 言
甲氨蝶呤（MTX）为二氢叶酸还原酶抑制剂，通过竞争性抑制二氢叶酸还原酶，阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸，推迟和阻碍DNA 和RNA 的合成，发挥抗肿瘤作用，被广泛用于治疗急性淋巴细胞白血病等恶性肿瘤疾病。临床上采用大剂量甲氨蝶呤联合甲酰四氢叶酸钙（ Calcium folinate，CF） 解救疗法治疗儿童急性淋巴细胞性白血病，由于该疗法都是超常规大剂量静脉滴注， 易产生严重的甚至致命的毒性反应， 例如肾衰竭﹑骨髓抑制、肝损害、胃肠道反应、皮肤黏膜反应等， 且剂量与血药浓度个体差异大，必须开展MTX血药浓度检测[1]。测定甲氨蝶呤的方法现主要有荧光偏振免疫法（FPIA）[2]和高效液相法[3～8]。荧光偏振免疫法需要进口免疫试剂盒，因价格高而限制了在临床使用;高效液相具有专一性强、准确度高的特点，大多数文献都是基于一维色谱与不同的检测器联用，如紫外[3～5]、荧光[6]、质谱[7，8]等，其中，液相色谱-质谱联用法灵敏度高，分析速度快，但预处理过程复杂，且购置仪器成本较高。本研究采用二维色谱平台，加上压缩控制流路抑制大体积进样和二维色谱死体积大而造成的峰展宽，运用SCX中间级对色谱网络进行串联修改，实现了样品的大通量快速检测，显著减少了人为干预度和单次分析时间，适用于大样本临床药物浓度测定和药代动力学研究。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
RP-SCX-RP二维色谱平台：3个LC-20A泵、CBM-20A色谱控制器、SIL-20A自动进样器（改装500μL进样环）、DGU-20A自动脱气机、SPD-20A紫外检测器、2个FCV-12AH六通阀，以上各组成单元均购自日本岛津公司;FLC2420柱温箱、ASTON C8一级色谱柱 （100 mm×4.6 mm， 5 μm）、ASTON SCX中间级 （20 mm×4.6 mm， 5 μm）、SAC C8二级柱为 （100 mm×4.6 mm， 5 μm），均购自长沙ANAX分析仪器有限公司;电子天平;PHS-3S PH计（上海精科），XW-80A涡旋混合器（上海青浦西仪器厂）;高速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）。
MTX对照品（中国药品生物制品检定所）;甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）;乙酸铵（美国TEDIA公司）;乙二醇、三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;去离子水由美国Millipore 纯水机制备;患者血清取自中南大学湘雅医院小儿科。
2.2 对照品溶液和质控血清样品的制备
取MTX对照品适量，准确称定，用甲醇溶解和少量DMF助溶，并定容至25 mL， 制成51.54 μmol/L贮备液。取上述标准品储备溶液适量，分别加乙二醇稀释，制成各标准工作溶液。用空白血清和MTX贮备液分别配制浓度为0.0879， 0.2474， 0.6185， 1.546， 3.092和5.154 μmol/L的MTX系列标准血清样品。同法配制浓度为0.2474和3.092 μmol/L的质控血清样品，分装于1.5 mL塑料离心管中，置 Symbolm@@ 20 ℃保存，备用。
2.3 血清样品预处理
取200 μL血清样品，加入10%三氯乙酸溶液600 μL，涡旋混合30 s，14500 r/min高速离心10 min，取上清液200 μL进样分析。
2.4 RP-SCX-RP二维色谱平台测定流程及条件
本二维色谱平台一级柱与二级柱之间通过中心切割作为传输模式，具体采用间接传递技术，并用中间级作为二次分离和储存、转运的场所。
图1为具体运行原理图，PUMP1所对应的一级柱流动相为10 mmol/L醋酸铵-乙腈（90∶10， V/V， 以乙酸调至pH 3.8），流速为1.0 mL/min;PUMP2辅助流路流动相为10 mmol/L H3PO4溶液（pH 3.0）; PUMP3所对应的二级柱流动相为流动相为50 mmol/L乙酸铵-乙腈（87∶13， V/V， 以乙酸调至pH 5.2），〖TP<07091.tif>，+59mm＼.100mm，Y#〗[TS（][HT5”SS] 〖ZK（〗图1 反向模式-强阳离子交换-反向模式二维色谱平台工作原理图
Fig.1 Schematic diagram of reversed phase-strong cation exchange-reversed phase （RP-SCX-RP） two-Dimensional liquid chromatography platform 〖ZK）〗[HT5][TS）]流速为为1.2 mL/min，检测波长为306 nm。
如图1所示，六通阀1和2在图中状态均为On（阀中实线表示相连通），其切换另一状态为Off。在被测组分进样时，六通阀1和2均为On，同时Pump 2启动，运用模拟梯度压缩技术来解决二维色谱平台死体积大和大体积进样时峰展宽问题;然后被测组分在一级柱中分离，同时停止Pump 2，六通阀1和2分别为Off和On;接着通过切换阀切换流路，六通阀1和2均为Off，此时一级柱与中间级相连，转移被测组分，并再一次用启动Pump 2，进一步减少峰展宽，改善峰型。最后通过再一次的阀切换流路，六通阀1和2均为On，将中间级中的被测组分转移到二级柱，完成最后的分离与检测。
3 结果与讨论
3.1 二维色谱网络构建和时间复杂度分析
医院药学部门的大通量药物分析二维色谱平台构建，需重点考察耐久度、经济性、时间复杂度3个重要评估要素。
在复杂生物基质中小分子药物的测定中，二级色谱柱之间常用的传递技术为反冲和中心切割[9]，反冲模式去杂质能力较中心切割模式差，使一级柱头上的强保留物质反冲入二级柱，造成二级柱压力升高，降低耐久度，同时也会增加二级柱的分离难度以及增加二级柱的负载，造成二级柱寿命降低，于是本实验选择中心切割作为平台的传递技术。
运用RAM（Restricted access media）柱和贯流色谱柱直接进样已成为发展趋势，但商品RAM柱成本较高，耐久性不好，不适合医院药学部门的大通量样本检测。而贯流色谱柱粒径较大，柱效低，中心切割范围增大一倍以上，因此本研究采用C8柱与沉淀蛋白取上清进样，样品相对干净，对不同药物的平均柱寿命比RAM相比有较大提高，经济性良好，相比于离线固相萃取和液液萃取，人为干预程度明显减少，能得到更好的准确度与精确度。
医院药学部门因日常TDM监测样品种类多，通量大，必须减少单次分析的时间。基于自动进样器增加通量的方法是对色谱网络进行并联修改[10，11]，但此种方式并不适合中心切割，因为两根并联柱不同，多次进样后损坏程度也不同，切割时间窗口不易制定，且当样品通量较大时，自动进样器的批处理表容易出错。据此，本研究对色谱网络进行串联修改，引入了SCX中间级，将被测组分储存在中间级，使一级柱进下次样品时，中间级的组分被转移到二级柱并同时进行分析，缩短单次循环的时间，使大通量的样品检测时间复杂度大大降低。中间级除担负减少时间复杂度的任务外，还可以进一步分离杂质，净化了到达二级柱的组分，减小二级柱负载。具体原理为通过调整辅助压缩流路的pH值，使MTX保留在SCX柱上。通过观察不同pH值对色谱峰面积的影响。发现在pH 3.0～5.5之间，随着pH值增加，保留量减少，故调整辅助压缩流路pH=3。
3.2 大体积进样和峰展宽控制
大体积进样可以根据分析物质的灵敏度要求提高进样量（常规进样量0～500 μL，最大可改装1000 μL的进样环），获得更低的定量限，扩大了紫外检测器的应用范围，满足日常TDM和药代动力学中代谢物的检测要求.
考虑到大体积进样的应用与二维色谱的柱外效应，本研究运用梯度模拟压缩技术，在柱头部控制峰展宽。梯度模拟压缩具体运行为：在进样和被测组分从第一级色谱转移到中间级时，同时开启Pump 2，使Pump 2所控制的流动相（10 mmol/L H3PO4）进入色谱流路，并根据流速和管路长度计算出关泵时间。
如图2所示，当t=0时，被测组分在柱端进口处，由于辅助压缩流路的开启，被测组分后部的一段流动相有机相浓度由φ1减小为φ2，设浓度φ1的流动相洗脱速度为：
u1=u0/1 + k1
浓度φ2流动相洗脱速度为：
u2 =u0/1 + k2
其中， u0为流动相线速度，k1和k2分别为被测组分在不同浓度流动相中的保留因子。由于u1> u2，峰展宽在柱头被压缩，当t=tf 时，有机相浓度较高的流动相头部“追上”了被测组分头部，整个柱头压缩过程结束。
本实验中MTX进样200 μL，峰展宽约为0.6 min，比一般小体积进样（小于50 μL）的文献峰宽明显变窄[3～5]，可看出运用此技术后效果良好。因大体积进样带来的灵敏度提高效果显著，检出限为0.005 μmol/L， 低于普通配备紫外检测器的高效液相，略高于液相色谱-质谱联用法[7，8]，效费比最高。若要得到液-质联用的检出限水平，还可以继续加大进样量（进样环最大可改装到1000 μL）。
3.5 专属性与样品分析
空白血浆色谱图空白血浆加MTX分别见图3a，图3b，空白血浆图谱在MTX出峰处背景干净，无杂峰干扰，治疗常用合并药物（如阿糖胞苷、柔红霉素、地塞米松）不出峰。取本院小儿科病人血浆按照2.3节进样色谱图见图4c。可见经过二维色谱分离后，MTX峰形尖锐且为基线分离，减少了低浓度时的积分误差。
应用本方法对使用大剂量MTX治疗小儿科患者进行血药浓度监测，两名患者均为女性，年龄分别为6岁和10岁，检测时间点为给药后44和68 h，所有的血浆样品采集后立刻测定。44 h检测结果分别为1.525和0.658 μmol/L，其中第一位患者血药浓度超过44 h血药浓度标准（>1 μmol/L），提示需要用四氢叶酸钙解救;68 h继续测定第一位患者，血药浓度为0.058 μmol/L，达到小于0.1 μmol/L的安全浓度。可停止解救。
4 结 论
本方法采用反向模式-强阳离子交换-反向模式（RP-SCX-RP）二维色谱平台测定人血浆中甲氨蝶呤浓度，运用大体积进样提高灵敏度，模拟梯度压缩技术控制峰展宽，并采用串联修改色谱网络，大大减少了单次分析时间复杂度，人为干预度小、简便、准确，适合临床甲氨蝶呤药物浓度检测和药动学研究。
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Platform of Reversed Phase-Strong Cation Exchange-Reversed
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for Determination of Methotrexat in Plasma
SHENG Yang-Hao1，2， LIU Dan-Qi1，2， WANG Ping1，2， ZHOU Bo-Ting*1，2
1（The Pharmacy Department of Central South University Xiangyang Hospital， Changsha 410008， China）
2（The Pharmacy of Central South University， Changsha 410008， China）
Abstract A two-dimensional HPLC method was developed for the determination of methotrexat （MTX） in human plasma. The samples were treated with trichloroacetate for sedimentation and high speed centrifugation， and the obtained supernatant was taken for analysis. The analytes in sample were separated on the first dimension column （ASTON C8 100 mm × 4.6 mm， 5 μm）， and trapped on the middle column （ASTON SCX 20 mm × 4.6 mm， 5 μm） using valve-switching technique for purification and storage. Finally， the trapped analytes were transferred to the second-dimension column （SAC C8 100 mm × 4.6 mm， 5 μm） for the second separation. The mobile phase used for the first dimension was 10 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile（9∶1， V/V， pH=3.8） with a flow rate of 1 mL/min and the mobile phase used for middle column was 10 mmol/L phosphoric acid （pH=3.0）. The mobile phase used in second-dimension was a mixed solution of 50 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile （87∶10， V/V， pH=5.2）. UV detection was carried out at ?306 nm and completed in 4 min. The calibration curve showed a linearity range from 0.0879 to 5.154 μmol/L （r=0.99998）. The LOQ was 0.005 μmol/L. The intra-and inter-day precisions were lower than 1.5% and 1.8%， respectively. The relative recovery and the absolute recovery were 99.1%-101.2% and 85.67%-86.35%， respectively. The assay is simple， accurate， reproducible， and suitable for the therapeutic drug monitoring of MTX in the hospital and the study on the pharmacokinetics of MTX.
Keywords Two-dimension liquid chromatography; Methotrexat; High performance liquid chromatography
（Received 19 August 2014; accepted 25 September 2014）
