针刺“足三里”对脾虚小鼠脑组织中NO和NOS影响的实验研究
朱兆洪等
朱兆洪 1丁 柱 2汤希孟 3丁克祥(广州中医药大学,510405;1广州海军医院;2江西中医学院;3海军抗衰老研究中心)
摘 要 本实验旨在观察针刺“足三里”穴对脾虚模型小鼠脑组织中一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。实验以大黄灌胃造成小鼠脾虚模型,同时针刺“足三里”穴。结果表明,针刺“足三里”能够降低脾虚动物脑组织中NO含量及NOS的活性,提高红细胞SOD活性和肾组织中总抗氧化能力(T-AO),减少心肌组织丙二醛(MDA)的生成。提示针刺“足三里”能够改善脾虚动物机体内自由基代谢。
主题词 穴,足三里 一氧化氮/代谢 一氧化氮合酶 脾虚/针灸疗法足三里为足阳明胃经之合穴,是对胃腑有直接作用的腧穴。早在金元时代,李东垣就提倡“以胃合三里穴推而扬之以伸元气”,认为刺激足三里穴能起到补益脾胃元气之功,故此,足三里历来就被推崇为健脾补虚培元之要穴。在以往足三里的研究中以艾灸多见,本实验观察了针刺“足三里”对实验性脾虚小鼠机体自由基相关代谢的影响,并将之与中药四君子汤的治疗作用进行了比较,着重探讨了NO和NOS在治疗前后变化的可能机制。
1 材料与方法1.1 实验动物用1.5月龄健康的雌性昆明种小白鼠,体重为24±2g,共90只,由中山医科大学实验动物中心提供。
1.2 分组与实验方法(1)针刺和中药对脾虚模型小鼠脑组织中NO和NOS的影响将40只小鼠随机分为4组,正常对照组(Ⅰ)、脾虚模型组(Ⅱ)、针刺“足三里”组(Ⅲ)、中药四君子汤组(Ⅳ),每组10只。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组先造模[1],每日均以100%大黄煎剂0.6ml灌胃,连续7天;Ⅰ组予等体积生理盐水灌胃;Ⅲ组于造模之日起,以32号0.5寸毫针针刺小鼠膝关节外侧腓骨小头下3.5mm“足三里”穴[1],直刺3.5mm,持续捻转2min,留针3min,每日1次,共持续20天;Ⅳ组以100%四君子汤(人参、茯苓、白术、甘草各等份)水煎剂0.6ml灌胃,每天1次,持续20天。以上4组均于第21天处死,迅速取出脑组织备用。
(2)针刺足三里对自由基相关代谢的影响将50只小鼠随机分为脾虚模型组、针刺2次/日组、针刺1次/日组、针刺1次/2日组、针刺1次/4日组,共为5组,每组各10只。每组均同前法造模,并于造模之日起,除脾虚模型组外,分别以2次/日、1次/日、1次/2日、1次/4日的治疗方案针刺“足三里”穴,针刺方法同前。以上5组于第21天取血、处死并取心、肾两脏器备用。
1.3 检测项目将取出的脏器组织以生理盐水冲洗、拭干、称重、匀浆,制成10%的组织匀浆液,离心取上清液,用于各项检测。
NO试剂盒由军事医学科学院放射医学研究所提供;NOS、MDA、和T-AO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;红细胞SOD试剂盒由海军抗衰老研究中心提供。
1.4 统计方法两组均用t检验。
2 实验结果
2.1 针刺“足三里”对脾虚小鼠脑组织中NO含量和NOS活性的影响(见表1)
由表1结果显示,脾虚模型组与正常对照组相比,NO的含量和NOS的活性均显著升高(P<0.05);针刺“足三里”组和中药四君子汤组脑组织中NO含量和NOS活性较模型组显著下降(P<0.05,P<0.01),且针刺“足三里”组与中药四君子汤组两组间比较差异无显著意义(P>0.05)。
2.2 针刺“足三里”对自由基相关代谢的影响(1)针刺“足三里”对脾虚小鼠肾组织中T-AO的影响(见表2)由表2结果显示,针刺1次/日组和针刺2次/日组与脾虚模型组比较,小鼠肾组织中T-AO显著升高(P<0.01)。
(2)针刺“足三里”对脾虚小鼠心肌组织MDA含量的影响(见表3)由表3结果表明,脾虚小鼠心肌组织中MDA的含量在1次/4日、1次/2日、1次/日和2次/日针刺组与脾虚模型组比较,均有明显下降(P<0.001)。
(3)针刺“足三里”对脾虚小鼠红细胞SOD活性的影响(见表4)由表4结果显示,针刺1次/日组和针刺2次/日组与脾虚模型组比较,脾虚小鼠红细胞SOD活性显著上升(P<0.05)。
3 讨论脾为“气血生化之源”,五脏六腑四肢百骸均有赖于脾所化生的气血津液。张仲景早在《金匮要略》中即提出了“四季脾旺不受邪”的观点,认为脾气健旺,脏腑功能才能正常,一旦脾胃功能出现生理性或病理性减退,无以化生气血,不仅本脏本腑功能失常,也影响到其它脏腑,最终使机体抵抗力下降,不足以抗御病邪的侵袭,引发疾病或导致衰老,这也即所谓“百病皆由脾胃衰而生也”。调补脾胃,使脾气充盛,生化之源不竭,则正气内存,祛病延年。近年来的文献资料表明,脾虚时机体存在自由基代谢的异常,如脾虚动物有SOD、过氧化氢酶和GSH-PX活性的下降[2,3],通过健脾益气可以改善脾虚机体自由基相关代谢状况[4,5]。本实验观察到针刺“足三里”穴能够提高心肌组织SOD活性、降低心肌组织中MDA的生成。
本研究还观察了针刺“足三里”和中药四君子汤对脾虚小鼠脑组织中NO和NOS的影响。大量研究表明,NO是脂溶性极高的小分子气体自由基,在机体中发挥多种生理功能,如作为信使、参与神经传导、血液循环,影响细胞的发生、分化、生长和死亡等等,并且可能参与介导了许多病理生理过程。NOS是NO合成过程中的限速酶[6,7]。针刺“足三里”治疗脾虚小鼠,能够降低脑组织中NOS活性和NO含量,究其机理,可以从以下几个方面来考虑:(1)针刺可以通过调低NOS的活性来减少NO的生成。(2)NO作为一种自由基,它与氧极易生成二氧化氮(NO2),而NO一旦生成又能与超氧阴离子自由基(O2)迅速生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。而后很快分解成羟自由基OH·和NO2·,它们还能相互反应,在机体内生成一系列自由基。大量的自由基可以攻击生物大分子,损害组织细胞结构和功能。针刺“足三里”可能直接或间接地抑制了NO所产生的自由基联级反应过程。(3)在中枢神经系统中,NO还作为信使物质,参与介导了由兴奋性氨基酸所引起的环磷酸鸟苷(cGMP)的结构变化,激活cGMP,从而通过调节离子通道、依赖性cGMP蛋白激酶和磷酸二酯酶发挥作用。NO含量的减少可以减轻由于兴奋性氨基酸介导的神经元损伤,起到保护神经元功能的作用。针刺“足三里”降低NOS和NO的作用与四君子汤组相似,这可能是针刺“足三里”发挥健脾益气作用的病理生理学基础之一。于临床而言,与服用中药汤剂相比,针刺具有操作简便、无毒副作用等优点,因而具有更为广阔的应用前景。
4 参考文献
1 李辞容,华兴邦,宋大鲁,等.小鼠常用针灸穴位.见实验动物和动物实验,1992;(2):85
2 刘艳明,李德新,王晓明,等.脾阳虚证大白鼠模型脂质过氧化速率和抗氧化能力的实验研究.辽宁中医杂志,1994;21(1):13
3 王晓明,李德新,易杰,等.“脾后天之本”的分子生物学基础.辽宁中医杂志,1994;15(4):139
4 刘健,刘春丽,李平,等.110例老年脾虚证的临床研究.安徽中医学院学报,1996;15(4):17
5 张麟贵,杨启清.脾虚与超氧化物歧化酶关系探讨.福建中医学院学报,1994;4(1):13
6 Synder.SH.BiologicalRolesofNitricOxide.Sci.Am,1992;266(5):28
7 Lipton.SA.AredoxbasedMerchanismforNeuropro-tectiveandNeurodestructiveEffectsofNitricOxideandItsVompounds.Nature,1993;364:636
(收稿日期:1999-05-20,齐淑兰发稿)
朱兆洪 1丁 柱 2汤希孟 3丁克祥(广州中医药大学,510405;1广州海军医院;2江西中医学院;3海军抗衰老研究中心)
摘 要 本实验旨在观察针刺“足三里”穴对脾虚模型小鼠脑组织中一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。实验以大黄灌胃造成小鼠脾虚模型,同时针刺“足三里”穴。结果表明,针刺“足三里”能够降低脾虚动物脑组织中NO含量及NOS的活性,提高红细胞SOD活性和肾组织中总抗氧化能力(T-AO),减少心肌组织丙二醛(MDA)的生成。提示针刺“足三里”能够改善脾虚动物机体内自由基代谢。
主题词 穴,足三里 一氧化氮/代谢 一氧化氮合酶 脾虚/针灸疗法足三里为足阳明胃经之合穴,是对胃腑有直接作用的腧穴。早在金元时代,李东垣就提倡“以胃合三里穴推而扬之以伸元气”,认为刺激足三里穴能起到补益脾胃元气之功,故此,足三里历来就被推崇为健脾补虚培元之要穴。在以往足三里的研究中以艾灸多见,本实验观察了针刺“足三里”对实验性脾虚小鼠机体自由基相关代谢的影响,并将之与中药四君子汤的治疗作用进行了比较,着重探讨了NO和NOS在治疗前后变化的可能机制。
1 材料与方法1.1 实验动物用1.5月龄健康的雌性昆明种小白鼠,体重为24±2g,共90只,由中山医科大学实验动物中心提供。
1.2 分组与实验方法(1)针刺和中药对脾虚模型小鼠脑组织中NO和NOS的影响将40只小鼠随机分为4组,正常对照组(Ⅰ)、脾虚模型组(Ⅱ)、针刺“足三里”组(Ⅲ)、中药四君子汤组(Ⅳ),每组10只。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组先造模[1],每日均以100%大黄煎剂0.6ml灌胃,连续7天;Ⅰ组予等体积生理盐水灌胃;Ⅲ组于造模之日起,以32号0.5寸毫针针刺小鼠膝关节外侧腓骨小头下3.5mm“足三里”穴[1],直刺3.5mm,持续捻转2min,留针3min,每日1次,共持续20天;Ⅳ组以100%四君子汤(人参、茯苓、白术、甘草各等份)水煎剂0.6ml灌胃,每天1次,持续20天。以上4组均于第21天处死,迅速取出脑组织备用。
(2)针刺足三里对自由基相关代谢的影响将50只小鼠随机分为脾虚模型组、针刺2次/日组、针刺1次/日组、针刺1次/2日组、针刺1次/4日组,共为5组,每组各10只。每组均同前法造模,并于造模之日起,除脾虚模型组外,分别以2次/日、1次/日、1次/2日、1次/4日的治疗方案针刺“足三里”穴,针刺方法同前。以上5组于第21天取血、处死并取心、肾两脏器备用。
1.3 检测项目将取出的脏器组织以生理盐水冲洗、拭干、称重、匀浆,制成10%的组织匀浆液,离心取上清液,用于各项检测。
NO试剂盒由军事医学科学院放射医学研究所提供;NOS、MDA、和T-AO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;红细胞SOD试剂盒由海军抗衰老研究中心提供。
1.4 统计方法两组均用t检验。
2 实验结果
2.1 针刺“足三里”对脾虚小鼠脑组织中NO含量和NOS活性的影响(见表1)
由表1结果显示,脾虚模型组与正常对照组相比,NO的含量和NOS的活性均显著升高(P<0.05);针刺“足三里”组和中药四君子汤组脑组织中NO含量和NOS活性较模型组显著下降(P<0.05,P<0.01),且针刺“足三里”组与中药四君子汤组两组间比较差异无显著意义(P>0.05)。
2.2 针刺“足三里”对自由基相关代谢的影响(1)针刺“足三里”对脾虚小鼠肾组织中T-AO的影响(见表2)由表2结果显示,针刺1次/日组和针刺2次/日组与脾虚模型组比较,小鼠肾组织中T-AO显著升高(P<0.01)。
(2)针刺“足三里”对脾虚小鼠心肌组织MDA含量的影响(见表3)由表3结果表明,脾虚小鼠心肌组织中MDA的含量在1次/4日、1次/2日、1次/日和2次/日针刺组与脾虚模型组比较,均有明显下降(P<0.001)。
(3)针刺“足三里”对脾虚小鼠红细胞SOD活性的影响(见表4)由表4结果显示,针刺1次/日组和针刺2次/日组与脾虚模型组比较,脾虚小鼠红细胞SOD活性显著上升(P<0.05)。
3 讨论脾为“气血生化之源”,五脏六腑四肢百骸均有赖于脾所化生的气血津液。张仲景早在《金匮要略》中即提出了“四季脾旺不受邪”的观点,认为脾气健旺,脏腑功能才能正常,一旦脾胃功能出现生理性或病理性减退,无以化生气血,不仅本脏本腑功能失常,也影响到其它脏腑,最终使机体抵抗力下降,不足以抗御病邪的侵袭,引发疾病或导致衰老,这也即所谓“百病皆由脾胃衰而生也”。调补脾胃,使脾气充盛,生化之源不竭,则正气内存,祛病延年。近年来的文献资料表明,脾虚时机体存在自由基代谢的异常,如脾虚动物有SOD、过氧化氢酶和GSH-PX活性的下降[2,3],通过健脾益气可以改善脾虚机体自由基相关代谢状况[4,5]。本实验观察到针刺“足三里”穴能够提高心肌组织SOD活性、降低心肌组织中MDA的生成。
本研究还观察了针刺“足三里”和中药四君子汤对脾虚小鼠脑组织中NO和NOS的影响。大量研究表明,NO是脂溶性极高的小分子气体自由基,在机体中发挥多种生理功能,如作为信使、参与神经传导、血液循环,影响细胞的发生、分化、生长和死亡等等,并且可能参与介导了许多病理生理过程。NOS是NO合成过程中的限速酶[6,7]。针刺“足三里”治疗脾虚小鼠,能够降低脑组织中NOS活性和NO含量,究其机理,可以从以下几个方面来考虑:(1)针刺可以通过调低NOS的活性来减少NO的生成。(2)NO作为一种自由基,它与氧极易生成二氧化氮(NO2),而NO一旦生成又能与超氧阴离子自由基(O2)迅速生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。而后很快分解成羟自由基OH·和NO2·,它们还能相互反应,在机体内生成一系列自由基。大量的自由基可以攻击生物大分子,损害组织细胞结构和功能。针刺“足三里”可能直接或间接地抑制了NO所产生的自由基联级反应过程。(3)在中枢神经系统中,NO还作为信使物质,参与介导了由兴奋性氨基酸所引起的环磷酸鸟苷(cGMP)的结构变化,激活cGMP,从而通过调节离子通道、依赖性cGMP蛋白激酶和磷酸二酯酶发挥作用。NO含量的减少可以减轻由于兴奋性氨基酸介导的神经元损伤,起到保护神经元功能的作用。针刺“足三里”降低NOS和NO的作用与四君子汤组相似,这可能是针刺“足三里”发挥健脾益气作用的病理生理学基础之一。于临床而言,与服用中药汤剂相比,针刺具有操作简便、无毒副作用等优点,因而具有更为广阔的应用前景。
4 参考文献
1 李辞容,华兴邦,宋大鲁,等.小鼠常用针灸穴位.见实验动物和动物实验,1992;(2):85
2 刘艳明,李德新,王晓明,等.脾阳虚证大白鼠模型脂质过氧化速率和抗氧化能力的实验研究.辽宁中医杂志,1994;21(1):13
3 王晓明,李德新,易杰,等.“脾后天之本”的分子生物学基础.辽宁中医杂志,1994;15(4):139
4 刘健,刘春丽,李平,等.110例老年脾虚证的临床研究.安徽中医学院学报,1996;15(4):17
5 张麟贵,杨启清.脾虚与超氧化物歧化酶关系探讨.福建中医学院学报,1994;4(1):13
6 Synder.SH.BiologicalRolesofNitricOxide.Sci.Am,1992;266(5):28
7 Lipton.SA.AredoxbasedMerchanismforNeuropro-tectiveandNeurodestructiveEffectsofNitricOxideandItsVompounds.Nature,1993;364:636
(收稿日期:1999-05-20,齐淑兰发稿)
