小反刍兽疫病原学及疫苗研究进展

    卯岭+张靖+潘庆庆

    摘要:小反刍兽疫(PPR)是一种急性病毒性传染病,2013年12月份以来,我国多个省(区)相继发生小反刍兽疫疫情,严重影响了养羊业生产发展和羊肉产品有效供给,充分认识小反刍兽疫研究进展具有十分重要的意义。文章综述了小反刍兽疫病原学和疫苗的研究进展,为小反刍兽疫防控机理提供参考。

    关键词:小反刍兽疫;病毒;疫苗

    中图分类号:S851.2 文献标识码:B 文章编号:1007-273X(2014)07-0063-02

    收稿日期:2014-06-14

    作者简介:卯 岭(1988-),男,贵州威宁人,助理兽医师,主要从事农业技术推广工作。

    小反刍兽疫(Pestedes petits ruminants,PPR) 俗称羊瘟,是由小反当兽疫病毒Pestedes petits ruminantsvirus,PPRV)引起的一种急性病毒性传染病,主要感染小反刍动物,以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征[1]。羊高度易感,牛、猪等动物也可以感染带毒,野生动物偶有发生。该病具有高发病率和死亡率,对畜牧业构成严重的威胁。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病,在我国列为一类动物疫病。

    1 病原学研究

    1.1 病毒的生物学特性

    小反刍兽疫病毒(PPRV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属,该病毒属于囊膜病毒,病毒颗粒外被厚约8.5~14.5 nm的囊膜,囊膜上有两种纤突糖蛋白。病毒核衣壳由核蛋白(N)和磷蛋白(P)组成,呈螺旋对称,螺旋直径约为18 nm,螺距为5~6 nm,总长度约为1 000 nm。另外还有囊膜基质蛋白(M)、纤突糖蛋白(F)和H蛋白[2]。PPRV可以在MDBK、BHK21、Vero细胞上繁殖,同时也可以在山羊或绵羊的胎肾、人羊膜、犊牛肾和猴肾的原代或传代细胞上生长繁殖,并且会出现细胞病变(CPE),一般会在接种细胞后1~2周才会看到病变。

    1.2 病毒分子生物学特性

    PPRV的基因组为不分节段的单股负链RNA, 分别编码 6 种结构蛋白和 2 种非结构蛋白,依次是核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(HN)、大蛋白(L)和 C、V 非结构蛋白。

    N 蛋白由 N 基因含有的惟一1个开放阅读框编码的 525 个氨基酸残基组成,分子质量大小约为 57.7 kU,在病毒中含量最高,是核衣壳的主要组成蛋白。N蛋白有4个主要的区域:氨基末段和蛋白中部I、Ⅲ的保守区以及易变异的Ⅱ区、Ⅳ区(C端)。N蛋白的主要作用是保护病毒RNA免受核糖核酸酶I的破坏,与RNA结合作为病毒转录的模板,被认为在病毒的复制和转录中起主要的作用[3]。

    P 基因含有 3 个开放阅读框,编码的蛋白分子质量约为 54.9 kU,含有 509 个氨基酸, 它能与 N 和 L 蛋白连接,作为分子伴侣使 N 蛋白保持可溶状态与 RNA 相连,同时是转录复合物的辅助因子。由于 P 蛋白属于酸性蛋白并且具有较多的苏氨酸和丝氨酸,能为转录后磷酸化提供较多的潜在位点,而这种磷酸化作用能增加整个分子的负电荷和分子大小,因此会造成 P 蛋白在聚丙烯凝胶电泳中的异常迁移。

    M 蛋白位于病毒囊膜的内侧,序列具有高度的保守性,分子质量约为 38 kU。M 蛋白在成熟病毒粒子从细胞内释放的过程中起着关键性的作用,病毒缺失 M蛋白后就失去了感染细胞的能力。有研究表明 M 蛋白是以蛋白中部的 C 端和病毒囊膜相结合的.

    F 蛋白又称融合蛋白,是病毒表面的一种糖蛋白,属于一型糖蛋白,含有 546个氨基酸,分子质量约为 59.31 Ku。F 蛋白能够诱导细胞病变,导致细胞产生溶血素、细胞融合和启动病毒感染,决定病毒感染的成功与否。

    H 蛋白又称吸附蛋白,是 PPRV 表面的另一种糖蛋白,由 609 个氨基酸组成,分子质量为 70 Ku,是最不保守的蛋白。H 蛋白具有血凝素,含有 T 细胞决定簇,与宿主细胞的特异性有关。

    L 蛋白主要是通过 P 蛋白与病毒的转录、复制模板复合体 N-RNA 相互作用,从而构成核蛋白复合体,用来形成病毒的mRNA。

    C 和 V的形成是由于 P 基因的阅读框经移码后造成的非结构蛋白。C 蛋白是最小的蛋白,V 蛋白可在干扰素通路和转录过程中发挥作用。

    1.3 病毒致病机理

    该病毒先通过口、咽上呼吸道上皮或扁桃体进入体内,在局部淋巴结增殖,减弱淋巴细胞的免疫力,进而扩散到淋巴组织中,之后经血液循环到达全身各处淋巴结、肠黏膜、呼吸道黏膜 ,导致淋巴组织坏死,免疫功能下降,最终引起继发感染和支气管肺炎。病毒粒子在 H 和 F 蛋白的协助下将核衣壳注入靶细胞,最终使病毒粒子与靶细胞融合。在病毒复制过程中需要多种聚合酶和复制酶,这些复制酶对病毒自身的 L 蛋白或其他多种新的蛋白有依赖作用,同时病毒的复制过程还包括 mRNA翻译病毒多肽或蛋白的过程[4]。

    2 小反当兽疫疫苗研究进展

    目前该病尚无有效治疗方法,发现病例应严密封锁疫区,扑杀患畜,隔离消毒。对PPR的控制主要依靠疫苗,现有疫苗及免疫方法很多,效果差异也很大。

    2.1 牛瘟弱毒疫苗

    由于 PPRV 和牛瘟病毒(RPV) 之间的抗原相关性很强[5],可用牛瘟 (RP) 组织培养的弱毒疫苗对绵羊、山羊进行免疫,产生的抗 RP 抗体能够很好的抵抗 PPR 野毒株的攻击,但是这种方法不利于全球牛瘟消灭计划的实施。其主要缺点是:免疫动物仅产生抗 RPV 的中和抗体,而没有抗 PPRV 的中和抗体。RPV和 PPRV H 基因序列分析表明,两种病毒 H 蛋白氨基酸的同源性不足 60%,而相对比较保守的 F 蛋白同源性为 80%。因此,RPV 弱毒疫苗抗 PPR 的保护作用,可能由 F 蛋白提供,而该蛋白主要诱导细胞免疫应答。此外,RPV 弱毒疫苗免疫动物,用 PPRV 攻击感染后,抗 PPRV 中和抗体呈升高态势。这表明 PPRV 在免疫动物体内有短暂的复制过程,存在散毒可能性。

    2.2 PPRV 弱毒疫苗

    通过 Vero 细胞的连续传代,成功研制了 Nigeria 75/1 PPR弱毒疫苗,该苗无任何副作用。由于 PPRV 对热高度敏感,致使 Nigeria 75/1 疫苗的稳定性很差,不利于基层的运输和使用。

    2.3 PPR 灭活疫苗

    用感染山羊的病理组织可制备同源的PPR灭活疫苗。但是,甲醛灭活的疫苗效果不佳,而用氯仿灭活制备的疫苗免疫山羊后血清抗体可以持续8个月。

    2.4 重组亚单位疫苗

    利用疹病毒属的表面糖蛋白具有良好的免疫原性,重组杆状病毒表达的 HN 蛋白能刺激机体产生体液和细胞介导的免疫应答,产生的抗体能中和 PPRV 和 RPV。国外学者在大肠杆菌中分别过表达了 PPRV 和 RPV的 N 蛋白,在无病毒 RNA 存在的情况下,能装配成类似于病毒的核衣壳。纯化的重组病毒核衣壳单剂量、无佐剂时即可诱导小鼠产生很强的抗原特异性 CTL免疫应答,而且 PPRV 和 RPV 间可交叉反应。

    2.5 嵌合体疫苗

    应用反向遗传技术制备RP/PPRV嵌合体疫苗,即用PPRV的糖蛋白基因替代RPV疫苗表面相应的糖蛋白基因。这种疫苗不仅对PPRV具有良好的免疫原性,而且免疫动物血清中无特异的RP病毒ELISA抗体。

    2.6 活载体疫苗

    国外学者将 PPRV 的 F 基因插入羊痘病毒的 TK 基因编码区,构建了重组羊痘病毒疫苗 recCapPPR/F,该重组病毒可抵抗 PPRV 强毒的攻击感染,同时也能预防羊痘病毒的感染。重组羊痘活载体疫苗应是小反刍兽疫疫苗新的发展方向。

    2.7 RNA 干涉技术

    通过合成的小干扰 RNA(siRNA)作用于 N 蛋白基因的两个区,导致病毒复制减少了 80%以上,通过实时定量 PCR 检测病毒 RNA、流式细胞仪测定病毒蛋白的产生、CPE 评价病毒粒子的产生和测定病毒滴度评价 siRNA 对PPRV 复制的影响,证明 siRNA 分子有发展为 PPRV 和 RPV 治疗剂的潜力[5]。

    3 小结

    PPRV 主要感染山羊和绵羊等小反刍兽,但是不同品种的羊敏感性有显著差别。山羊比绵羊更易感,幼龄动物易感性较高,哺乳期的动物抵抗力较强。另外,猪和牛也可以感染 PPRV,但通常无临床症状,也不能够将其传染给其他动物。一直以来小反刍兽疫的防治问题都没有得到很好地解决,目前,我国的羊群的疫情监测及防治技术与发达国家相比还有很大的差距,很多疫苗和标准化试剂盒还是沿用国外产品,因此要求加强对PPR免疫机理和PPR疫苗的研究工作,加强PPR的防治与疫情监测技术的研究工作,开发出安全、有效、实用的疫苗及建立快速标准化检测手段显得十分重要。

    参考文献:

    [1] 印春生,支海兵.小反刍兽疫研究进展[J].中国兽药杂志,2007,41(8):22.

    [2] 刘玉洪,徐自忠,花群义,等.小反刍兽疫病毒分子生物学研究进展[J].动物医学进展,2006,27(12): 1-6.

    [3] 井 波,赵玉军,袁 远.小反当兽疫病毒研究进展[J].畜牧与兽医,2004,36(6): 40-43.

    [4] 李井春,赵凤菊,赵玉军.小反刍兽疫[J].黑龙江畜牧兽医,2004(12):63-64.

    [5] SERVAN DE ALMEIDAl R,KEITA D,Libeau G,et al.Control of ruminant morbilli- virus replication by small interfering RNA[J].General Virology,2007,88(8):2307-2311.

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