一例禽多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2023.06.08

党媛

摘要：禽多杀性巴氏杆菌是引起各种禽类巴氏杆菌病的病原菌。禽巴氏杆菌病（即禽霍乱、禽出血性败血症）是一种急性、败血性、接触性传染病，该病的流行具有发病快、病程短、发病率和死亡率高等特点。禽多杀性巴氏杆菌为条件性致病菌，当饲养管理突变、气候突变、长途运输等外界诱因出现时容易暴发，当前禽巴氏杆菌病常呈地方流行或散发流行，尤以成年鸡最为常见。笔者对采集的一例疑似禽巴氏杆菌病的病料，通过病原菌分离培养、实验室鉴定及药敏试验等研究，对疫情的诊治提供了科学的依据，并针对当前多杀性巴氏杆菌临床上的药物滥用、耐药性严重等问题进行简要分析，旨在为各养殖单位健康发展提供参考。

关键词：禽;多杀性巴氏杆菌病;分离;鉴定

中图分类号：S831文献标识码：B文章编号：2095-9737（2019）10-0030-02

1?样品来源与试剂

病料采自青海省西宁市某规模化养鸡场疑似禽多杀性巴氏杆菌感染的病死鸡肝脏组织。培养基及试剂主要有胰蛋白大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）培养基、新生牛血清、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker、革兰氏染色液、细菌药敏纸片等。

2?实验室检测

2.1?细菌分离培养

将采集的肝脏组织划线接种于含2%新生牛血清的TSA平板、麦康凯平板上，37℃培养18 h后，观察菌落形态，在TSA平板上出现淡灰白色、圆形、表面光滑、边缘整齐、湿润、半透明菌落，麦康凯平板上无菌落。挑取TSA平板上可疑单菌落传代培养，并对典型的疑似菌落进行革兰氏染色，油镜下观察细菌染色特点及形态，镜下可见两端钝圆、两极浓染、革兰阴性小杆菌。

2.2?生化试验

根据说明书，取分离菌株纯培养物分别接种葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、VP、硫化氢、赖氨酸和鸟氨酸、尿素酶等生化管。生化试验结果显示该分离株可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇，不发酵麦芽糖、乳糖、甘露醇、肌醇，VP、硫化氢、赖氨酸和鸟氨酸反应均为阴性，这与多杀性巴氏杆菌生化特征相符。

2.3?PCR鉴定

根据禽多杀性巴氏杆菌特异性基因kmt1设计引物进行PCR扩增鉴定。引物序列如下，P1：5'-AT CCGCTATTTACCCAGTGG-3'，P2：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'，扩增片段为456bp;挑取单个疑似菌落于100 μL无菌的ddH2O中，沸水中煮沸10 min，8000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR模板;PCR体系为：2×Taq PCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL，补灭菌水至20 μL，同时设立阴阳性对照，阳性对照选用标准株C48-2株（CVCC44802），反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。反应结束后用1%的琼脂糖凝胶板电泳，电泳结束后，取出凝胶板用凝胶成像仪进行成像分析，目的条带的大小与预期相符，由此可以确定该场养鸡场感染了禽多杀性巴氏杆菌。

2.4?药敏试验

采用Kirby-Bauer纸片扩散法对该分离多杀性巴氏杆菌株进行药敏试验，选择包括青霉素、氨苄西林、阿奇霉素、阿莫西林克拉维酸、头孢噻呋、头孢克洛、氟苯尼考、恩诺沙星、大观霉素、红霉素、庆大霉素、克林霉素、阿米卡星、多西环素和多黏菌素B共计15种临床常用的药敏片。首先将纯化后的分离菌均匀涂布到含2%新生牛血清的TSA平板上，再将15种药敏片均匀分布到平板上，37℃培养18 h后，观察并测量各药敏纸片的抑菌圈直径，进而对该多杀性巴氏桿菌分离株的药物敏感性进行判定。结果显示该分离菌对头孢噻呋、头孢克洛、氟苯尼考呈现高度敏感，对大观霉素和多黏菌素B中敏，对阿奇霉素、多西环素低敏，其余耐药。

3?讨论

禽多杀性巴氏杆菌是禽霍乱的重要致病原，属于条件致病菌，该菌可长期存在于禽鼻腔、呼吸道等处，当禽类机体抵抗力降低时感染发病，鸡群一旦出现带菌鸡或染病鸡，可通过被污染的饲料、饮水及环境等快速传播，导致较高的发病率和死亡率，造成极其严重的经济损失。本研究从疑似感染禽多杀性巴氏杆菌的规模化养鸡场，随机采集疑似病料，通过分离培养、染色镜检、生化试验、PCR鉴定等，最终确定了该鸡场感染了禽多杀性巴氏杆菌。并通过药敏试验对该分离株药物敏感情况进行了鉴定，已将试验结果反馈给相关养殖单位，通过及时的、科学的诊治，疫情得到了很好的控制，现已完全恢复正常生产。

养殖过程中应坚持防优于治的原则，加强饲养管理工作，不断提高动物机体的免疫力，积极正确进行疫苗免疫，发挥疫苗的预防作用。多杀性巴氏杆菌根据荚膜抗原的不同可分为A、B、D、E、F五个血清型，且不同血清型之间缺乏交叉保护作用，目前多杀性巴氏杆菌病的预防多以灭活苗免疫为主，但因不同区域流行菌株之间血清型的差异，使得疫苗免疫效果不理想，常出现免疫动物仍感染发病。本次实验涉及的养殖单位虽然管理规范，也实施开展了定期疫苗免疫，分析发病的原因可能是由于该株多杀性巴氏杆菌与免疫的灭活苗疫苗株有所差异，导致免疫失败，确诊后该养殖场用分离的多杀性巴氏杆菌株进行了自家苗的研制，并进行了免疫，取得了理想的预防效果。