赛黑桦组织培养技术研究
蒋祥娥 西川浩已
摘 要： 以赛黑桦休眠枝萌发的腋芽为外植体，研究了不同种类和不同浓度植物激素对赛黑桦外植体诱导、愈伤组织诱导、不定芽增殖和生根等环节的影响。结果表明：①外植体芽的诱导培养以WPM +6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1为最佳培养基； ②愈伤组织诱导以WPM+6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1为最佳培养基；③在芽增殖培养中以WPM+6-BA0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1增殖效果最好，增殖系数达4.0；④生根培养以WPM+NAA0.05 mg·L-1效果最佳，生根率91.7%；⑤生根苗移栽成活率达90%以上。
关键词： 中图分类号：S792.189 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2018）04-0006-04
Abstract： The axillary buds sprouting from dormant shoots were used as explants to study the effects of plant hormones on explant induction， callus induction， adventitious proliferation and rooting. Results showed that： ①The medium of WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1was the best initiation culture medium： ②The medium of WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1 was the best callus induction medium. ③The medium of WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+ NAA0.02 mg·L-1 with propagation coefficient 4.0 was the best proliferation culture medium. ④The medium of WPM+NAA 0.05 mg·L-1 with rooting rate 91.7% was the best rooting culture medium. ⑤The survival rate of transplants was higher than 90%.
Key words： Betula schmidtii； tissue culture； regeneration
赛黑桦（Betula schmidtii）为桦木科（Betulaceae）桦木属（Betula）的落叶乔木树种，又名辽东桦、铁桦木、赤榆，主要分布在中国东北部、日本本州中部以北，朝鲜、俄罗斯等地方。其生长缓慢，材质致密，厚重坚硬，被称为“比钢铁还要硬的树”（世界之最：植物分册），力学强度大，气干密度为0.835～0.996 g·cm-3，适合做家具、地板及诸多特殊构件及特殊工艺产品（铁桦树树种与资源分布的考证）。目前有关赛黑桦的研究以分类学为主，涉及的内容多是对赛黑桦与属内其他种间亲缘关系的探讨（桦树ISSR—PCR反应体系的优化、Discussions OU taxonomy of genus Betula in northeast China、利用RAPD标记技术对桦树种间亲缘关系的分析、Phylogenetic relationships of Betula species（Betulaceae）based on nuclear ADH and chloroplast matK sequences、Chemical evaluation of Betula species in Japan），其次是其木材构造及物理力学性质方面的研究（赛黑桦的构造特征和物理力学性质）。有关赛黑桦生长、良种选育、繁殖及其与环境关系的系统研究应是今后研究的主要方向，本文首次揭示了植物激素对赛黑桦组织培养效果的影响，以期为赛黑桦的良种无性繁殖做些基础工作。
1 材料与方法
1.1 材料的处理
供试品种为日本山梨县赛黑桦优良无性系，剪取长有饱满腋芽及顶芽的休眠枝，用清水反复冲洗后，枝条上端要用锡纸包住，以防水分散失，放在恒温室里进行水培。水培期间，每天换水1次并进行清洗，适时将水培枝条基部减掉一点，以免枝条分泌物将导管堵塞，导致枝条因缺水干枯。约2周左右，腋芽萌发出嫩枝。
1.2 试验方法
（1）培养基及培养条件。以WPM为基本培养基，蔗糖浓度为25%，琼脂为7 g·L-1，pH值5.7。培养基在121 ℃、131 kPa的条件下灭菌15 min。培養室温度25±1 ℃，光照强度5 000 Lx，光周期16 h光照/8 h黑暗。
（2）无菌材料获得。当腋芽长到3～4 cm时，在清水中滴入1～2滴洗涤剂，将芽放入清洗约5 min，再用清水反复漂洗干净。在超净工作台内，先用75%酒精浸泡30 s，然后在用3%的次氯酸钠溶液消毒15 min，再用无菌水清洗3次，放在无菌滤纸上吸干水分，将两头切去1～2 mm后接入芽诱导培养基中。
（3）芽的诱导培养。将处理好的外植体接种于添加6-BA0.1、0.5、1.0 mg·L-1和NAA0.02、0.1、0.2 mg·L-1组合的诱导培养基中（表1），每瓶接一个外植体，每个处理重复15次，将接种好的培养瓶放入培养室里培养，每隔一周观察生长情况，四周后统计芽诱导和愈伤组织产生情况。
（4）茎段愈伤组织诱导。将6-BA0、0.1、1 mg·L-1和NAA 0、0.02、0.2 mg·L-1及2，4-D 0.2、2.0 mg·L-1三种激素组合的15种处理的培养基中（表2）每个处理接种12个茎段，放培养室培养，20 d后调查愈伤组织生长情况，然后将诱导产生的愈伤组织接种到愈伤组织分化的培养基里。
（5）芽增殖培养。
将诱导的无菌苗切下，切成1.5 cm左右茎段，每段至少一个腋芽，转接到添加6-BA0、0.1、1.0 mg·L-1和NAA0、0.02、0.2 mg·L-1、GA3 0、0.5、1.0 mg·L-1组合的15种处理的增殖培养基中（表3），5周后观察试管苗生长情况。
（6）生根培养。
选取2 cm左右长、长势好的无菌苗，接种到添加NAA0.05、0.1、0.2 mg·L-1和IBA0.1、0.5、1.0 mg·L-1的生根培养基中（表4），2周后可诱导出不定根，4周后开始观察根的生长情况，统计生根率。
（7）炼苗移栽。
当幼苗在培养瓶中生根后，即可进行炼苗移栽。先将生根瓶苗连瓶拿到温室内炼苗1周，炼苗后将健壮的生根苗取出，用清水洗去根上附着的培养基，移栽到消毒准备好的蛭石∶珍珠岩=3∶1基质的营养钵中，淋透水，盖上薄膜，置于温室，注意遮荫保湿，湿度控制在90%左右。10 d后逐渐揭开薄膜至完全过渡到自然条件。移栽后1周用消毒液进行1次杀菌，2周喷1次营养液。1 d喷2～3次水。
2 结果与分析
2.1 不同浓度植物激素对芽诱导的影响
由表1可见，在所设9个处理组合中，处理5培养条件为WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1时，芽的诱导率最高为86.7%，其次是处理4和7处理，诱导率达80.0%，但芽苗叶色发黄，从芽苗生长情况来看，处理5的芽苗长势最好，苗高色绿。萌芽率最低的是处理9，仅为40.0%。在不同浓度激素配比的培养基中出现了不同程度的愈伤组织，除9号处理愈伤组织量少颜色是棕褐色外，其它处理颜色浅绿或深绿色、松散。由此得出适合赛黑桦芽的诱导最佳培养条件为WPM+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。
2.2 不同浓度植物激素对茎段愈伤组织诱导的影响
由表2可见，在培养基中不添加植物激素，不能诱导出愈伤组织；在所有添加植物激素的处理中均能诱导出愈伤组织，诱导率最低为50%，最高为100%。随着激素6-BA浓度的升高，愈伤组织诱导率也随之升高。6-BA+NAA与6-BA+2，4-D对赛黑桦茎段愈伤组织的诱导效果基本相同，因此适合赛黑桦愈伤组织诱导的最佳培养基为WPM+6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1。
2.3 不同浓度植物激素对芽增殖的影响
由表3可见，不添加任何植物激素的WPM培养基中其基部不产生不定芽。添加一定浓度6-BA、NAA和GA3的培养基均有不同程度的不定芽产生，增殖系数最低为1.2，最高为4.0。随着6-BA激素浓度增加，芽增殖系数呈上升趋势；当添加NAA后，芽长势情况较好，茎杆壮实，但随着NAA浓度的增加，增殖系数呈现下降趋势，说明6-BA、NAA的配比浓度对芽增殖及长势影响较大。在6-BA、GA3配比中，芽生长情况一般，植株偏矮，茎秆偏细，不利于炼苗移栽。综合考虑，赛黑桦在增殖过程中的最佳培养条件为WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，增殖系数4.0，瓶苗长势情况好，生长健壮，有利于后续炼苗移栽。
当最佳增殖培养基筛选出来后，根据多年经验，直接将诱导产生的愈伤组织接种到最佳增殖培养基中进行愈伤组织分化培养，没有进行不同植物激素配比对愈伤组织分化的影响进行对比试验。培养15 d后，脱分化产生绿色芽点，进一步分化产生不定芽。颜色浅的愈伤组织生长快、芽数多，而颜色深的愈伤组织生长缓慢，芽的诱导率低。棕褐色的愈伤组织芽的诱导率最低，有的根本就没芽诱导出来，甚至最后褐化死亡。
2.4 不同植物激素对生根的影响
由表4可见，随着NAA浓度的增加，生根率出现下降的趋势，当NAA的浓度为0.05 mg·L-1时，生根率为91.7%，根粗壮且长势较强，NAA为0.20 mg·L-1时，生根率为66.7%，且根细弱，表明较高浓度的NAA不利于根的生长。IBA的作用效果与NAA相似，也是随着浓度的增加生根率呈下降趋势，IBA浓度降为0.1 mg·L-1时，生根率最高为 83.3 %；IBA浓度增加至1.0 mg·L-1时，生根率仅为58.3%，且茎段切口有愈伤组织产生。综合判断，赛黑桦的最佳生根培养基为WPM+ NAA0.05 mg·L-1。
2.5 炼苗移栽
瓶苗生根后，炼苗1周，洗净培养基，移栽在准备好的育苗基质中进行炼苗，结果表明只要在前期对水分和温度管理好，其成活率可以达到90%以上，并且后期长势旺盛。
3 结论与讨论
通过对赛黑桦腋芽的培养，探索出适宜腋芽诱导的培养基为 WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，在培养过程中，产生了愈伤组织，愈伤组织的产生在一定程度上影响了诱导系数，应注意植物激素的浓度配比。芽增殖最适培养基为WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，增殖系数为4.0，茎段愈伤组织诱导的培养基为WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，颜色浅的愈伤组织质地较疏软、突起较明显，生长快、芽数多。在生根培养中，NAA比IBA对生根更有利，最佳生根培养基为WPM+ NAA0.05 mg·L-1，生根率达91.7%。在生根培養中，为了提高炼苗成活率，在可能的情况下生根培养尽可能放到温度与外界一样的环境中，这样瓶苗逐步适应了外界环境温度变化，有利于叶表面蜡质层的恢复。移栽时采用蛭石∶珍珠岩=3∶1为炼苗基质，并在前期注意保持炼苗湿度，可以获得赛黑桦组培苗90%以上的成活率。
参 考 文 献
[1]戚继忠，孙耀星，张立平.铁桦树树种与资源分布的考证[J].南京林业大学学报（自然科学版），2009（6）：132-134.
[2]孙耀星，戚继忠，杨庚，等.赛黑桦的构造特征和物理力学性质[J].林业科学，2012（2）：180-181.
[3]陶静，詹亚光，由香玲，等.白桦组培再生系统的研究（Ⅲ）[J].东北林业大学学报，1998，26（5）：6-9.
[4]张学英，刘艳萌，胡淑明，等.白桦组织培养技术研究[J].北方园艺，2008（8）：176-178.
[5]陈正华.木本植物组织培养及应用[M].北京：高等教育出版社，1986：24-27.
[6]户田忠雄.木本植物的繁殖和育种[M].日本：农业图书出版社，1989.
[7]蔡桁，蒋祥娥，汪建亚，等.鹅掌楸组织培养技术研究[J].安徽农业科学，2005（4）：624-626.
（责任编辑：夏剑萍）
摘 要： 以赛黑桦休眠枝萌发的腋芽为外植体，研究了不同种类和不同浓度植物激素对赛黑桦外植体诱导、愈伤组织诱导、不定芽增殖和生根等环节的影响。结果表明：①外植体芽的诱导培养以WPM +6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1为最佳培养基； ②愈伤组织诱导以WPM+6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1为最佳培养基；③在芽增殖培养中以WPM+6-BA0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1增殖效果最好，增殖系数达4.0；④生根培养以WPM+NAA0.05 mg·L-1效果最佳，生根率91.7%；⑤生根苗移栽成活率达90%以上。
关键词： 中图分类号：S792.189 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2018）04-0006-04
Abstract： The axillary buds sprouting from dormant shoots were used as explants to study the effects of plant hormones on explant induction， callus induction， adventitious proliferation and rooting. Results showed that： ①The medium of WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1was the best initiation culture medium： ②The medium of WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1 was the best callus induction medium. ③The medium of WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+ NAA0.02 mg·L-1 with propagation coefficient 4.0 was the best proliferation culture medium. ④The medium of WPM+NAA 0.05 mg·L-1 with rooting rate 91.7% was the best rooting culture medium. ⑤The survival rate of transplants was higher than 90%.
Key words： Betula schmidtii； tissue culture； regeneration
赛黑桦（Betula schmidtii）为桦木科（Betulaceae）桦木属（Betula）的落叶乔木树种，又名辽东桦、铁桦木、赤榆，主要分布在中国东北部、日本本州中部以北，朝鲜、俄罗斯等地方。其生长缓慢，材质致密，厚重坚硬，被称为“比钢铁还要硬的树”（世界之最：植物分册），力学强度大，气干密度为0.835～0.996 g·cm-3，适合做家具、地板及诸多特殊构件及特殊工艺产品（铁桦树树种与资源分布的考证）。目前有关赛黑桦的研究以分类学为主，涉及的内容多是对赛黑桦与属内其他种间亲缘关系的探讨（桦树ISSR—PCR反应体系的优化、Discussions OU taxonomy of genus Betula in northeast China、利用RAPD标记技术对桦树种间亲缘关系的分析、Phylogenetic relationships of Betula species（Betulaceae）based on nuclear ADH and chloroplast matK sequences、Chemical evaluation of Betula species in Japan），其次是其木材构造及物理力学性质方面的研究（赛黑桦的构造特征和物理力学性质）。有关赛黑桦生长、良种选育、繁殖及其与环境关系的系统研究应是今后研究的主要方向，本文首次揭示了植物激素对赛黑桦组织培养效果的影响，以期为赛黑桦的良种无性繁殖做些基础工作。
1 材料与方法
1.1 材料的处理
供试品种为日本山梨县赛黑桦优良无性系，剪取长有饱满腋芽及顶芽的休眠枝，用清水反复冲洗后，枝条上端要用锡纸包住，以防水分散失，放在恒温室里进行水培。水培期间，每天换水1次并进行清洗，适时将水培枝条基部减掉一点，以免枝条分泌物将导管堵塞，导致枝条因缺水干枯。约2周左右，腋芽萌发出嫩枝。
1.2 试验方法
（1）培养基及培养条件。以WPM为基本培养基，蔗糖浓度为25%，琼脂为7 g·L-1，pH值5.7。培养基在121 ℃、131 kPa的条件下灭菌15 min。培養室温度25±1 ℃，光照强度5 000 Lx，光周期16 h光照/8 h黑暗。
（2）无菌材料获得。当腋芽长到3～4 cm时，在清水中滴入1～2滴洗涤剂，将芽放入清洗约5 min，再用清水反复漂洗干净。在超净工作台内，先用75%酒精浸泡30 s，然后在用3%的次氯酸钠溶液消毒15 min，再用无菌水清洗3次，放在无菌滤纸上吸干水分，将两头切去1～2 mm后接入芽诱导培养基中。
（3）芽的诱导培养。将处理好的外植体接种于添加6-BA0.1、0.5、1.0 mg·L-1和NAA0.02、0.1、0.2 mg·L-1组合的诱导培养基中（表1），每瓶接一个外植体，每个处理重复15次，将接种好的培养瓶放入培养室里培养，每隔一周观察生长情况，四周后统计芽诱导和愈伤组织产生情况。
（4）茎段愈伤组织诱导。将6-BA0、0.1、1 mg·L-1和NAA 0、0.02、0.2 mg·L-1及2，4-D 0.2、2.0 mg·L-1三种激素组合的15种处理的培养基中（表2）每个处理接种12个茎段，放培养室培养，20 d后调查愈伤组织生长情况，然后将诱导产生的愈伤组织接种到愈伤组织分化的培养基里。
（5）芽增殖培养。
将诱导的无菌苗切下，切成1.5 cm左右茎段，每段至少一个腋芽，转接到添加6-BA0、0.1、1.0 mg·L-1和NAA0、0.02、0.2 mg·L-1、GA3 0、0.5、1.0 mg·L-1组合的15种处理的增殖培养基中（表3），5周后观察试管苗生长情况。
（6）生根培养。
选取2 cm左右长、长势好的无菌苗，接种到添加NAA0.05、0.1、0.2 mg·L-1和IBA0.1、0.5、1.0 mg·L-1的生根培养基中（表4），2周后可诱导出不定根，4周后开始观察根的生长情况，统计生根率。
（7）炼苗移栽。
当幼苗在培养瓶中生根后，即可进行炼苗移栽。先将生根瓶苗连瓶拿到温室内炼苗1周，炼苗后将健壮的生根苗取出，用清水洗去根上附着的培养基，移栽到消毒准备好的蛭石∶珍珠岩=3∶1基质的营养钵中，淋透水，盖上薄膜，置于温室，注意遮荫保湿，湿度控制在90%左右。10 d后逐渐揭开薄膜至完全过渡到自然条件。移栽后1周用消毒液进行1次杀菌，2周喷1次营养液。1 d喷2～3次水。
2 结果与分析
2.1 不同浓度植物激素对芽诱导的影响
由表1可见，在所设9个处理组合中，处理5培养条件为WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1时，芽的诱导率最高为86.7%，其次是处理4和7处理，诱导率达80.0%，但芽苗叶色发黄，从芽苗生长情况来看，处理5的芽苗长势最好，苗高色绿。萌芽率最低的是处理9，仅为40.0%。在不同浓度激素配比的培养基中出现了不同程度的愈伤组织，除9号处理愈伤组织量少颜色是棕褐色外，其它处理颜色浅绿或深绿色、松散。由此得出适合赛黑桦芽的诱导最佳培养条件为WPM+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。
2.2 不同浓度植物激素对茎段愈伤组织诱导的影响
由表2可见，在培养基中不添加植物激素，不能诱导出愈伤组织；在所有添加植物激素的处理中均能诱导出愈伤组织，诱导率最低为50%，最高为100%。随着激素6-BA浓度的升高，愈伤组织诱导率也随之升高。6-BA+NAA与6-BA+2，4-D对赛黑桦茎段愈伤组织的诱导效果基本相同，因此适合赛黑桦愈伤组织诱导的最佳培养基为WPM+6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1。
2.3 不同浓度植物激素对芽增殖的影响
由表3可见，不添加任何植物激素的WPM培养基中其基部不产生不定芽。添加一定浓度6-BA、NAA和GA3的培养基均有不同程度的不定芽产生，增殖系数最低为1.2，最高为4.0。随着6-BA激素浓度增加，芽增殖系数呈上升趋势；当添加NAA后，芽长势情况较好，茎杆壮实，但随着NAA浓度的增加，增殖系数呈现下降趋势，说明6-BA、NAA的配比浓度对芽增殖及长势影响较大。在6-BA、GA3配比中，芽生长情况一般，植株偏矮，茎秆偏细，不利于炼苗移栽。综合考虑，赛黑桦在增殖过程中的最佳培养条件为WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，增殖系数4.0，瓶苗长势情况好，生长健壮，有利于后续炼苗移栽。
当最佳增殖培养基筛选出来后，根据多年经验，直接将诱导产生的愈伤组织接种到最佳增殖培养基中进行愈伤组织分化培养，没有进行不同植物激素配比对愈伤组织分化的影响进行对比试验。培养15 d后，脱分化产生绿色芽点，进一步分化产生不定芽。颜色浅的愈伤组织生长快、芽数多，而颜色深的愈伤组织生长缓慢，芽的诱导率低。棕褐色的愈伤组织芽的诱导率最低，有的根本就没芽诱导出来，甚至最后褐化死亡。
2.4 不同植物激素对生根的影响
由表4可见，随着NAA浓度的增加，生根率出现下降的趋势，当NAA的浓度为0.05 mg·L-1时，生根率为91.7%，根粗壮且长势较强，NAA为0.20 mg·L-1时，生根率为66.7%，且根细弱，表明较高浓度的NAA不利于根的生长。IBA的作用效果与NAA相似，也是随着浓度的增加生根率呈下降趋势，IBA浓度降为0.1 mg·L-1时，生根率最高为 83.3 %；IBA浓度增加至1.0 mg·L-1时，生根率仅为58.3%，且茎段切口有愈伤组织产生。综合判断，赛黑桦的最佳生根培养基为WPM+ NAA0.05 mg·L-1。
2.5 炼苗移栽
瓶苗生根后，炼苗1周，洗净培养基，移栽在准备好的育苗基质中进行炼苗，结果表明只要在前期对水分和温度管理好，其成活率可以达到90%以上，并且后期长势旺盛。
3 结论与讨论
通过对赛黑桦腋芽的培养，探索出适宜腋芽诱导的培养基为 WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，在培养过程中，产生了愈伤组织，愈伤组织的产生在一定程度上影响了诱导系数，应注意植物激素的浓度配比。芽增殖最适培养基为WPM+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，增殖系数为4.0，茎段愈伤组织诱导的培养基为WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1，颜色浅的愈伤组织质地较疏软、突起较明显，生长快、芽数多。在生根培养中，NAA比IBA对生根更有利，最佳生根培养基为WPM+ NAA0.05 mg·L-1，生根率达91.7%。在生根培養中，为了提高炼苗成活率，在可能的情况下生根培养尽可能放到温度与外界一样的环境中，这样瓶苗逐步适应了外界环境温度变化，有利于叶表面蜡质层的恢复。移栽时采用蛭石∶珍珠岩=3∶1为炼苗基质，并在前期注意保持炼苗湿度，可以获得赛黑桦组培苗90%以上的成活率。
参 考 文 献
[1]戚继忠，孙耀星，张立平.铁桦树树种与资源分布的考证[J].南京林业大学学报（自然科学版），2009（6）：132-134.
[2]孙耀星，戚继忠，杨庚，等.赛黑桦的构造特征和物理力学性质[J].林业科学，2012（2）：180-181.
[3]陶静，詹亚光，由香玲，等.白桦组培再生系统的研究（Ⅲ）[J].东北林业大学学报，1998，26（5）：6-9.
[4]张学英，刘艳萌，胡淑明，等.白桦组织培养技术研究[J].北方园艺，2008（8）：176-178.
[5]陈正华.木本植物组织培养及应用[M].北京：高等教育出版社，1986：24-27.
[6]户田忠雄.木本植物的繁殖和育种[M].日本：农业图书出版社，1989.
[7]蔡桁，蒋祥娥，汪建亚，等.鹅掌楸组织培养技术研究[J].安徽农业科学，2005（4）：624-626.
（责任编辑：夏剑萍）
