2个山西地方猪种MX2基因组织表达谱分析
孙奴奴 白慧慧
摘要：MX2是由干扰素分泌的一个MX亚型的蛋白，该蛋白具有广泛的抗病毒作用以及GTP酶活性。本次实验采用3头晋汾白猪和3头新山西黑猪的皮肤、肌肉、脾脏、支气管淋巴结等18种组织的总RNA，通过RT-PCR方法对MX2基因在晋汾白猪与新山西黑猪的不同组织中的表达情况进行检测。然后通过SPSS 19软件对晋汾白猪与新山西黑猪的肺泡巨噬细胞、脾脏、白细胞与支气管淋巴结这四种免疫组织中MX2基因进行方差比较及多重检测分析。结果显示：晋汾白猪的脾与支气管淋巴结间的表达呈显著差异（0.01 关键词：猪;MX2基因;RT-PCR 中图分类号：S828 ?文献标识码：A文章编号：2095-9737（2019）09-0005-04 Abstract：MX2 is a MX subunit protein secreted by interferon， which has a wide range of antiviral effects and GTP enzyme activity. In this experiment， the total RNA of skin， muscle， spleen and lymph nodes from 3 Jinfen white pigs and 3 new Shanxi black pigs were used. The expression of MX2 gene in different tissues of Jinfen white pig and new Shanxi black pig was detected by RT-PCR. The macrophage， spleen， leukocyte and lymph node of Jinfen white pig and new Shanxi black pig were further analyzed by IBM SPSS Statistics 19 software. The results showed that the expression of MX2 gene was significant different between the spleen of Jinfen white pig and lymph nodes （0.01 Key words：The pig; MX2 gene; RT-PCR 晋汾白猪集合了马身猪、太湖猪、长白、大白猪等优良品种的优异基因，形成的新品种不仅能滿足猪生产业化发展的需求，同时还保持了国内优秀猪种、繁殖力强、肉质好等特点[1]，新山西黑猪拥有乌黑的毛色，适应环境能力好，抵抗病毒性能强，生产幼崽多、肉质鲜嫩等优良特点[2]。 MX2蛋白是MX蛋白的一个亚型，是由干扰素分泌的蛋白，艾滋病病毒的复制能被MX2基因抑制[3]。MX2蛋白具有很强的抗病毒能力，由于许多动物传染性疾病的发病机制受单基因或者多基因的控制，所以许多动物对一些传染性的疾病存在部分或完全抗性[4]。MX2基因对细胞系中表达有抑制作用，因此，不在细胞系中的病毒可以连续不断的复制和扩散[5]。位于细胞系中的病毒由于MX2基因会充分表达，病毒则丧失了复制的能力，新病毒不会再产生[6]。由此可推出MX2基因具有广谱的抗病毒功效，可以使多种类型的RNA病毒有抑制作用。活化了的MX2基因可以对水解病毒核衣壳起到重要的作用，目的是为了阻止病毒吸附与穿入细胞[7]。已经有一些科学研究证明，MX2在体外对VSV有明显的抑制作用。此外，MX2抑制VSV和其他慢性病毒，包括小鼠白血病病毒。之前，有报道称MX2基因是减少MX2KA而不是GTP-binding突变K131A GTP-hydrolysis或者突变T151A。根据这一现象，有研究表明，MX2基因限制不减少MX2KA，但在MX2 K127A和T147A，分别对应于MXB K131A和T151A。因此，MX2可能通过一种不同于MX2的新机制抑制逆转录病毒复制[8]。当猪被携带有乙型脑炎病毒的蚊子叮咬后，猪种就会被感染上乙型脑炎病毒，该病毒首先会在皮肤表面的上皮细胞、支气管淋巴结和血管的内皮细胞内部增殖，紧接着进入血液中随血液感染，造成局部的病毒血症状[9]。有研究表明，MX2基因能抑制JEV Mx-independent途径感染[10]。 本实验以晋汾白猪和新山西黑猪的MX2基因为理论基础，在组织水平上初步探索MX2基因在晋汾白猪与新山西黑猪不同组织气管中的表达情况，明确在晋汾白猪与新山西黑猪猪种中的各个组织气管中分别表达的情况，为研究MX2基因在晋汾白猪与新山西黑猪的生物学功能提供一些基础材料，同时也为猪抗病育种的研发提供指导和依据。 1?材料与方法 1.1?实验动物与材料 本实验通过采集山西省运城市盐湖区新龙丰畜牧有限公司健康的46日龄新山西黑猪和49日龄的晋汾白猪各3头。分别采取每头猪的免疫系统（脾脏、支气管淋巴结、白细胞、肺泡巨噬细胞），消化系统（胃、盲肠、肝），呼吸系统（肺、支气管），泌尿系统（肾），神经系统（大脑、小脑），生殖系统（子宫、卵巢），心、肌肉、皮肤、脂肪等18种组织，在液氮中速冻并转入-80℃冰箱进行保存，用Trizol法提取RNA，并反转录为cDNA。 1.2?引物的设计与合成 根据GenBank上已经发表的猪ACTB基因的序列（XM-003124280.2），以及猪ACTB基因mRNA的序列和猪MX2基因的序列为引物模板设计引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下表1。 1.3?RT-PCR 取三头晋汾白猪与三头新山西黑猪的每种组织的cDNA各1 μL，混合于1.5 mL的灭菌离心管中，为制备的cDNA池，以混合的cDNA池为模板进行PCR扩增;再分别以3头晋汾白猪与3头新山西黑猪中的各四种免疫组织（脾、肺泡巨噬细胞、白细胞、支气管淋巴结）cDNA为模板，进行PCR扩增。 采用10 μL反应体系，即cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.2 μL（10 μmol/L），2×Taq PCR Master Mix 5 μL，补ddH2O至总反应体系为10 μL。PCR反應条件为：预变性：94℃ 5 min，（变性：94℃ 30 s，退活：50℃ 30 s延伸：72℃ 30 s）35个循环，后延伸：72℃ 5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照保存。 2?结果与分析 2.1?RT-PCR检测结果 以3头猪相同组织的cDNA混合的cDNA池为模板，对MX2和ACTB基因进行PCR扩增，扩增后的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳。晋汾白猪结果如图1、新山西黑猪结果如图2所示： 由图1所示，晋汾白猪MX2基因在各组织中表达水平不一致。晋汾白猪的MX2基因在心、肝、脾、肺泡巨噬细胞、白细胞、支气管淋巴结、子宫、胃、卵巢、皮肤、脂肪、大脑、小脑、支气管、盲肠中有表达，在肌肉中不表达。 由图2可得，新山西黑猪的MX2基因在心、脾 、肺、肺泡巨噬细胞、白细胞、肾、支气管淋巴结、胃、肌肉、脂肪、大脑、小脑、支气管、盲肠中有表达。MX2基因在肝、子宫、卵巢、皮肤、肌肉中不表达。 2.2?晋汾白猪差异比较结果 通过IBM SPSS Statistics 19软件对MX2基因在晋汾白猪的四种免疫器官（脾、白细胞、肺泡巨噬细胞、支气管淋巴结）的表达进行方差分析比较及Duncan（D）多重检验，结果如表2所示。 由表2可得，MX2基因在晋汾白猪四种免疫组织（脾脏、肺泡巨噬细胞、白细胞、支气管淋巴结）间表达差异显著（F =3.036，P=0.043<0.05），然后再进行方差分析比较及多重检验得出，晋汾白猪的脾与白细胞、肺泡巨噬细胞，白细胞与肺泡巨噬细胞、支气管淋巴结无显著差异（P>0.05）;脾与支气管淋巴结呈显著差异（0.01 2.3?新山西黑猪差异比较结果 通过IBM SPSS Statistics 19软件对MX2基因在新山西黑猪的四种免疫器官（脾、白细胞、肺泡巨噬细胞、支气管淋巴结）的表达进行方差分析比较及Duncan（D）多重检验，结果如表3所示。 由表3可得，MX2基因在新山西黑猪四种免疫组织（脾脏、肺泡巨噬细胞、白细胞、支气管淋巴结）间表达差异显著（F=0.362，P=0.032<0.05），然后再进行多重检验分析得出，晋汾白猪的脾与白细胞、肺泡巨噬细胞，白细胞与肺泡巨噬细胞、支气管淋巴结无显著差异（P>0.05）;脾与支气管淋巴结呈显著差异（0.01 2.4?晋汾白猪和新山西黑猪间差异比较结果 采用IBM SPSS Statistics 19.0软件对MX2基因在晋汾白猪和新山西黑猪中的相同免疫组织的表达进行独立T检验分析，结果如图3所示。 根据图3结果显示，MX2基因在晋汾白猪与新山西黑猪的脾（P=0.1432>0.05）、肺泡巨噬细胞（P=0.6222>0.05）、白细胞（P=0.6148>0.05）间表达无显著差异，在支气管淋巴结（0.01 3?结论 比较晋汾白猪与新山西黑猪的表达情况，MX2基因在不同组织中都有表达，但表达情况不同。此外，同一种组织在不同猪种中的表达有明显的差异。经过对两个猪种中的肺泡巨噬细胞，脾脏，支气管淋巴结，白细胞进行比较分析得出：晋汾白猪中脾与白细胞、肺泡巨噬细胞、支气管淋巴结，白细胞与支气管淋巴结呈极显著差异（P<0.01）;肺泡巨噬细胞与白细胞、支气管淋巴结无显著差异（P>0.05）。新山西黑猪中支气管淋巴结与白细胞、肺泡巨噬细胞、脾呈极显著差异（P<0.01）;脾与白细胞、肺泡巨噬细胞呈显著差异（0.01 根据基因在不同组织中的表达模式推测，MX2基因在不同组织中的表达差异可能与猪各组织对病原的识别和抵抗能力不同有关。 本实验的结果为MX2在免疫方面发挥作用提供了一些佐证，也为今后晋汾白猪和新山西黑猪的抗病育种提供了新的思路。但是MX2具有复杂的生物学功能，其实际的作用机制还需要进行更多的研究。 参考文献： [1] 高鹏飞，王效京，张敏.晋汾白猪育肥性能与胴体品质的研究[J].山西农业大学学报，2013，33（4）： 277-279. 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