油茶叶绿素提取方法的比较研究
程贵文+龚洪恩+颜送宝+陈传松+罗嘉东+袁小平+吴建国
摘要：为寻求油茶葉绿素提取效果最好的方法，以长林4号油茶叶片为试材，研究5种不同提取方法对油茶叶片叶绿素提取效果的影响。结果表明：不同提取方法提取效果差异显著，提取效果最好的是丙酮∶乙醇=2∶1的混合液，其次是丙酮∶乙醇=1∶1的混合液，然后是丙酮∶乙醇∶水=45∶45∶1的混合液，80%丙酮和95%乙醇提取效果相对较差。丙酮∶乙醇2∶1混合液法比较适合油茶叶绿素的提取。
关键词：油茶；叶绿素；提取方法
中图分类号：S7223文献标识码：A文章编号：1004-3020（2017）06-0011-04ComparisonofChlorophyllExtractionMethodsinCamelliaoleiferaChengGuiwenGongHongenYanSongbaoChenChuansongLuoJiadongYuanXiaopingWuJianguo
（TheExperimentalCentreofSubtropicalForestry，CAFXinyu336600）
Abstract：InordertofindoutthebestextractionmethodofchlorophyllinCamelliaoleifera，theeffectsoffivedifferentextractionmethodsontheextractionofchlorophyllwerestudied，withCamelliaoleiferaleavesofChanglin4asexperimentalmaterial.Theresultsshowedthatdifferentextractionmethodsshowedsignificantdifferencethe，mixedreagentofacetoneandethylalcoholinratioof2∶1hadthebesteffect，followedbythemixedreagentofacetoneandethylalcoholinratioof1∶1，thenthemixedreagentofacetone，ethylalcoholandwaterinratioof45∶45∶1，80%acetoneand95%ethanolhadrelativelypooreffect.Themixtureofacetoneandethanolinratioof2：1issuitablefortheextractionofchlorophyllfromCamelliaoleifera.
Keywords：Camelliaoleifera；chlorophyll；extractionmethods
叶绿素是植物进行光合作用最重要的物质之一。早期一段时间叶绿素提取主要采用Arono法[1]，该方法缺点是需研磨、过滤，步骤多，工作量大，且易受光氧化；1976年Shoaf提出了用二甲基亚砜提取藻类叶绿素，1979年Hiscox将该方法用于提取高等植物叶绿素[2]，该方法缺点是二甲基亚砜气味难闻，成本高，且低于19℃就会结晶；1981年古川昭雄提出了用无水乙醇浸泡提取叶绿素的方法[3]，该方法的缺点是提取时间长，提取不完全等；1984年福建林科所陈福明提出了丙酮、无水乙醇和蒸馏水45∶45∶1的混合液浸泡提取叶绿素的方法[4]，随后沈阳农学院张宪政于1985年提出了丙酮和无水乙醇1∶1的混合液法[5]，1992年北京农业大学彭运生又提出了丙酮和无水乙醇2∶1的混合液法[6]。
就油茶叶绿素提取而言，虽然目前几种方法都有采用，但提取效果的比较研究尚未见报道。本研究以长林4号油茶叶片为试材，对80%丙酮浸提法[7-15]、95%乙醇浸提法[16-19]、45∶45∶1混合液法（丙酮∶乙醇：水）[20-24]、1∶1混合液法（丙酮∶乙醇）[25-28]和2∶1混合液法（丙酮∶乙醇）[29-32]的油茶叶绿素提取效果进行比较研究，以期为油茶叶绿素含量测定方法的选择提供依据。
1材料与方法
1.1材料
选取长林4号盛产期油茶树向阳中上部叶片，擦拭干净，去除大叶脉，剪碎成约10cm×02cm的细丝，遮光混匀备用。
1.2试验方法
按体积比配制浸提液，共5个处理：①80%丙酮；②95%乙醇；③丙酮∶乙醇=1∶1；④丙酮∶乙醇=2∶1；⑤丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1。将剪好的细丝称取0.2000g，放入装有浸提液的25ml具塞刻度试管，定容，置于暗处室温浸提24h，每个处理重复3次，期间摇动几次。提取液分别于470、645、663nm波长下测定吸光度（95%乙醇提取液于470、649、665nm波长下测定吸光度），重复3次。叶绿素浓度按Arnon[1]公式计算：
Ca=12.71A663-2.59A645
Cb=22.88A645-4.67A663
Ca+b=Ca+Cb=20.29A645-8.04A663
Cx，c=（1000A470-3.27Ca-104Cb）/229
95%乙醇提取液叶绿素浓度按下列公式计算[33]：
Ca=13.95A665-6.88A649
Cb=24.96A649-7.32A665
Ca+b=Ca+Cb=18.08A649+6.63A665
Cx，c=（1000A470-2.05Ca-114.8Cb）/245
叶绿素含量（mg/g）=C·V/1000Fw
式中：A665、A663、A649、A645、A470分别为相应波长下的吸光值；V为提取液总体积（ml）；Fw为所取叶片鲜重（g）；Ca、Cb、Ca+b和Cx，c分别为叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素浓度，单位为（mg/L）。
1.3数据分析
采用MicrosoftExcel2003和SPSS19.0统计分析软件对试验数据进行处理分析。
湖北林业科技第46卷第6期程贵文，等：油茶叶绿素提取方法的比较研究2结果与分析
2.1不同提取方法对油茶叶绿素a含量的影响
不同提取方法下油茶叶绿素a含量如图1所示，从图中可以看出不同提取方法下油茶叶绿素a含量存在极显著性差异，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，叶绿素a提取含量达2178mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液，叶绿素a提取含量为2107mg/g；其它3种提取效果相对较差，最差的是80%丙酮提取液，叶绿素a提取含量为1733mg/g，仅为效果最好的7957%。
注：①80%丙酮；②95%乙醇；③丙酮∶乙醇=1∶1；
④丙酮∶乙醇=2∶1；⑤丙酮∶乙醇∶水=45∶45∶1。
不同小写字母表示差异显著（P<005）。下同。
2.2不同提取方法对油茶叶绿素b含量的影响
如图2所显示，不同提取方法下油茶叶绿素b含量存在显著性差异，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，叶绿素b提取含量达0711mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液与80%丙酮，叶绿素b提取含量分别为0668mg/g和0633mg/g；其它2种提取效果相对较差，最差的为0589mg/g（丙酮∶乙醇∶水=45∶45∶1），是效果最好的8284%。
2.3不同提取方法对油茶叶绿素总含量的影响
从图3可以看出，不同提取方法下油茶叶绿素总含量存在极显著性差异，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，叶绿素总提取量达2889mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液，叶绿素总提取量为2775mg/g；其它3种提取效果相对较差，最差的是95%乙醇提取液，叶绿素总提取量为2335mg/g，仅为效果最好的8082%。
2.4不同提取方法对油茶叶绿素a/b的影响
从图4可以看出，不同提取方法下油茶叶绿素a/b值差异性并不显著，a/b值最大的是3154（丙酮∶乙醇=1∶1），最小的是2738（80%丙酮）。
2.5不同提取方法對油茶类胡萝卜素含量的影响
由图5可以看出，不同提取方法下油茶类胡萝卜素含量存在显著性差异，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，类胡萝卜素提取量达0661mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液与95%乙醇，类胡萝卜素提取量分别为0652mg/g和0643mg/g；最差的是80%丙酮提取液，类胡萝卜素提取量为0565mg/g，为效果最好的8548%。
3讨论
5种不同提取方法下油茶叶绿素的提取含量差异显著，其中叶绿素a含量和叶绿素总含量达到极显著水平，叶绿素b含量和类胡萝卜素含量达到显著水平，且丙酮和乙醇混合液提取效果比丙酮、乙醇单独提取效果好，可能原因是丙酮和乙醇间存在协同萃取效应[34]，两者混合能够促进叶绿素的提取效率；不同提取方法下油茶叶绿素a/b值差异性并不显著，这是因为不同提取方法提取的叶绿素a含量与叶绿素b含量具有相似的变化趋势，所以其比值变化不显著。叶绿素a/b值的高低与叶绿素提取液浓度有密切的关系，叶绿素提取液总浓度在35～60mg·L-1之间，该比值变化不大，超过该范围，比值随提取液浓度的降低而增大，随提取液浓度的升高而减小[35]。本试验提取液浓度均在467～5778mg·L-1之间，所测值比较稳定。
4结论
综合分析表明，丙酮乙醇2∶1混合液法为长林4号油茶叶片叶绿素提取的最佳方法。与常规研磨法相比，该方法具有操作程序简单、步骤少、工作量小、受光影响小等优点[6]，对于批量测定油茶叶绿素含量具有重要的意义。
参考文献
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[32]杨少燕，苏淑钗，马履一，等.芸苔素内酯对油茶光合作用及果实性状的影响[J].江西农业大学学报，2016，38（2）：319326.
[33]王学奎.植物生理生化实验原理和技术（第二版）[M].北京：高等教育出版社，1999：79.
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[35]舒展，张晓素，陈娟，等.叶绿素含量测定的简化[J].植物生理学通讯，2010，46（4）：399402.（责任编辑：夏剑萍）
摘要：为寻求油茶葉绿素提取效果最好的方法，以长林4号油茶叶片为试材，研究5种不同提取方法对油茶叶片叶绿素提取效果的影响。结果表明：不同提取方法提取效果差异显著，提取效果最好的是丙酮∶乙醇=2∶1的混合液，其次是丙酮∶乙醇=1∶1的混合液，然后是丙酮∶乙醇∶水=45∶45∶1的混合液，80%丙酮和95%乙醇提取效果相对较差。丙酮∶乙醇2∶1混合液法比较适合油茶叶绿素的提取。
关键词：油茶；叶绿素；提取方法
中图分类号：S7223文献标识码：A文章编号：1004-3020（2017）06-0011-04ComparisonofChlorophyllExtractionMethodsinCamelliaoleiferaChengGuiwenGongHongenYanSongbaoChenChuansongLuoJiadongYuanXiaopingWuJianguo
（TheExperimentalCentreofSubtropicalForestry，CAFXinyu336600）
Abstract：InordertofindoutthebestextractionmethodofchlorophyllinCamelliaoleifera，theeffectsoffivedifferentextractionmethodsontheextractionofchlorophyllwerestudied，withCamelliaoleiferaleavesofChanglin4asexperimentalmaterial.Theresultsshowedthatdifferentextractionmethodsshowedsignificantdifferencethe，mixedreagentofacetoneandethylalcoholinratioof2∶1hadthebesteffect，followedbythemixedreagentofacetoneandethylalcoholinratioof1∶1，thenthemixedreagentofacetone，ethylalcoholandwaterinratioof45∶45∶1，80%acetoneand95%ethanolhadrelativelypooreffect.Themixtureofacetoneandethanolinratioof2：1issuitablefortheextractionofchlorophyllfromCamelliaoleifera.
Keywords：Camelliaoleifera；chlorophyll；extractionmethods
叶绿素是植物进行光合作用最重要的物质之一。早期一段时间叶绿素提取主要采用Arono法[1]，该方法缺点是需研磨、过滤，步骤多，工作量大，且易受光氧化；1976年Shoaf提出了用二甲基亚砜提取藻类叶绿素，1979年Hiscox将该方法用于提取高等植物叶绿素[2]，该方法缺点是二甲基亚砜气味难闻，成本高，且低于19℃就会结晶；1981年古川昭雄提出了用无水乙醇浸泡提取叶绿素的方法[3]，该方法的缺点是提取时间长，提取不完全等；1984年福建林科所陈福明提出了丙酮、无水乙醇和蒸馏水45∶45∶1的混合液浸泡提取叶绿素的方法[4]，随后沈阳农学院张宪政于1985年提出了丙酮和无水乙醇1∶1的混合液法[5]，1992年北京农业大学彭运生又提出了丙酮和无水乙醇2∶1的混合液法[6]。
就油茶叶绿素提取而言，虽然目前几种方法都有采用，但提取效果的比较研究尚未见报道。本研究以长林4号油茶叶片为试材，对80%丙酮浸提法[7-15]、95%乙醇浸提法[16-19]、45∶45∶1混合液法（丙酮∶乙醇：水）[20-24]、1∶1混合液法（丙酮∶乙醇）[25-28]和2∶1混合液法（丙酮∶乙醇）[29-32]的油茶叶绿素提取效果进行比较研究，以期为油茶叶绿素含量测定方法的选择提供依据。
1材料与方法
1.1材料
选取长林4号盛产期油茶树向阳中上部叶片，擦拭干净，去除大叶脉，剪碎成约10cm×02cm的细丝，遮光混匀备用。
1.2试验方法
按体积比配制浸提液，共5个处理：①80%丙酮；②95%乙醇；③丙酮∶乙醇=1∶1；④丙酮∶乙醇=2∶1；⑤丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1。将剪好的细丝称取0.2000g，放入装有浸提液的25ml具塞刻度试管，定容，置于暗处室温浸提24h，每个处理重复3次，期间摇动几次。提取液分别于470、645、663nm波长下测定吸光度（95%乙醇提取液于470、649、665nm波长下测定吸光度），重复3次。叶绿素浓度按Arnon[1]公式计算：
Ca=12.71A663-2.59A645
Cb=22.88A645-4.67A663
Ca+b=Ca+Cb=20.29A645-8.04A663
Cx，c=（1000A470-3.27Ca-104Cb）/229
95%乙醇提取液叶绿素浓度按下列公式计算[33]：
Ca=13.95A665-6.88A649
Cb=24.96A649-7.32A665
Ca+b=Ca+Cb=18.08A649+6.63A665
Cx，c=（1000A470-2.05Ca-114.8Cb）/245
叶绿素含量（mg/g）=C·V/1000Fw
式中：A665、A663、A649、A645、A470分别为相应波长下的吸光值；V为提取液总体积（ml）；Fw为所取叶片鲜重（g）；Ca、Cb、Ca+b和Cx，c分别为叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素浓度，单位为（mg/L）。
1.3数据分析
采用MicrosoftExcel2003和SPSS19.0统计分析软件对试验数据进行处理分析。
湖北林业科技第46卷第6期程贵文，等：油茶叶绿素提取方法的比较研究2结果与分析
2.1不同提取方法对油茶叶绿素a含量的影响
不同提取方法下油茶叶绿素a含量如图1所示，从图中可以看出不同提取方法下油茶叶绿素a含量存在极显著性差异，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，叶绿素a提取含量达2178mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液，叶绿素a提取含量为2107mg/g；其它3种提取效果相对较差，最差的是80%丙酮提取液，叶绿素a提取含量为1733mg/g，仅为效果最好的7957%。
注：①80%丙酮；②95%乙醇；③丙酮∶乙醇=1∶1；
④丙酮∶乙醇=2∶1；⑤丙酮∶乙醇∶水=45∶45∶1。
不同小写字母表示差异显著（P<005）。下同。
2.2不同提取方法对油茶叶绿素b含量的影响
如图2所显示，不同提取方法下油茶叶绿素b含量存在显著性差异，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，叶绿素b提取含量达0711mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液与80%丙酮，叶绿素b提取含量分别为0668mg/g和0633mg/g；其它2种提取效果相对较差，最差的为0589mg/g（丙酮∶乙醇∶水=45∶45∶1），是效果最好的8284%。
2.3不同提取方法对油茶叶绿素总含量的影响
从图3可以看出，不同提取方法下油茶叶绿素总含量存在极显著性差异，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，叶绿素总提取量达2889mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液，叶绿素总提取量为2775mg/g；其它3种提取效果相对较差，最差的是95%乙醇提取液，叶绿素总提取量为2335mg/g，仅为效果最好的8082%。
2.4不同提取方法对油茶叶绿素a/b的影响
从图4可以看出，不同提取方法下油茶叶绿素a/b值差异性并不显著，a/b值最大的是3154（丙酮∶乙醇=1∶1），最小的是2738（80%丙酮）。
2.5不同提取方法對油茶类胡萝卜素含量的影响
由图5可以看出，不同提取方法下油茶类胡萝卜素含量存在显著性差异，丙酮和乙醇2∶1的混合液提取效果最好，类胡萝卜素提取量达0661mg/g；其次是丙酮和乙醇1∶1的混合液与95%乙醇，类胡萝卜素提取量分别为0652mg/g和0643mg/g；最差的是80%丙酮提取液，类胡萝卜素提取量为0565mg/g，为效果最好的8548%。
3讨论
5种不同提取方法下油茶叶绿素的提取含量差异显著，其中叶绿素a含量和叶绿素总含量达到极显著水平，叶绿素b含量和类胡萝卜素含量达到显著水平，且丙酮和乙醇混合液提取效果比丙酮、乙醇单独提取效果好，可能原因是丙酮和乙醇间存在协同萃取效应[34]，两者混合能够促进叶绿素的提取效率；不同提取方法下油茶叶绿素a/b值差异性并不显著，这是因为不同提取方法提取的叶绿素a含量与叶绿素b含量具有相似的变化趋势，所以其比值变化不显著。叶绿素a/b值的高低与叶绿素提取液浓度有密切的关系，叶绿素提取液总浓度在35～60mg·L-1之间，该比值变化不大，超过该范围，比值随提取液浓度的降低而增大，随提取液浓度的升高而减小[35]。本试验提取液浓度均在467～5778mg·L-1之间，所测值比较稳定。
4结论
综合分析表明，丙酮乙醇2∶1混合液法为长林4号油茶叶片叶绿素提取的最佳方法。与常规研磨法相比，该方法具有操作程序简单、步骤少、工作量小、受光影响小等优点[6]，对于批量测定油茶叶绿素含量具有重要的意义。
参考文献
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[11]范亚丽，董倩倩，袁金凤，等.岑软油茶4个不同品种的光合特性研究[J].西北农业学报，2014，23（3）：164169.
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[13]袁德梽.施氮对油茶光合生长特性及土壤肥力的影响[J].贵州农业科学，2015，43（4）：4247.（下转第58页）（上接第13页）
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