芒果品种遗传多样性及其亲缘关系研究

    韦再行　陆英　秦田伟　李贤宇

    芒果材料的基因组遗传复杂;利用ISSR分子标记，进行野生芒果品种资源亲缘关系的研究，为我国部分野生芒果遗传多样性研究提供基础，为野生芒果种质亲缘关系分析，遗传作图，分子标记辅助育种等方面提供参考。

    芒果在我国的栽培历史悠久，种植由于起源循环途径多样，地方品种没有确切的科学名称，造成同物异名现象普遍，需建立快速高效的芒果种质资源鉴定技术工具、研究芒果种质资源的遗传多样性，有助于子代与亲本的快速鉴别。

    目前，国内外学者针对我国芒果主栽品种指纹图谱构建研究较少，采用SSR分子标记技术对30份芒果主栽品种进行遗传多样性分析，以期为我国芒果主栽品种育种实践及知识产权保护等提供参考依据，为芒果品种的DUS测试奠定技术基础。

    简单重复序列间扩增标记是由蒙特利大学Zietkiewicz等提出的新型分子标记技术，真核生物基因组中广泛存在由1-4个碱基对组成的简单重复序列，ISRR分子标记是用锚定的微卫星DNA为引物，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，用于ISSR-PCR扩增的引物通常为16-18个碱基序列，扩增的Inter-SSR区域多个条带可通过聚丙烯苔氨凝胶电泳得以分辨。

    运用ISRR标记技术时，筛选出多态性强的引物是ISSR技术的关键，引物的总长度为15-24bp，用于ISRR的引物常为5或3端加锚的二核普酸，四核普酸重复序列。植物基因组中最多的SRR是二核昔酸重复序列，要保证引物的Tm值靠近退火温度，引物最好有锚定碱基，使定位更准确，数据更可靠。

    目前ISRR技术在果树遗传育种上的应用主要包括种质资源鉴定，指纹图谱的构建，果树的进化与奇缘关系及目标基因定位方面。ISRR标记技术对RCR反应的敏感度比RAPD低，实验条件的优化非常必要，ISRR引物含有重复序列，基因组内靶序列在DNA复制中存在不均交换现象，引起引物结合点之间的片断长度差异。

    ISRR以其设备重复性高，多态性丰富的特点在果树系统分类方面发挥重大作用，ISRR分子标记技术使利用分子标记预测成为可能，通过对遗传标记的间接选择可分辨某些不易区分的形状，ISRR分子标记已广泛应用于多种果树上，解决过去制约果树育种周期长的问题，在果树育种研究方面具有广阔的前景。

    1、芒果品种遗传多样性实验

    ①实验方法

    芒果主栽品种叶片材料由农林科学院热带作物品种资源研究中心提供，基因组DNA提取，采集实验材料幼叶，将浓度统一调整至20ng/μL保存备用。

    根据已开发SRR标记，合成115对SSR引物，以海顿，缅甸球芒为主栽品种为材料进行引物筛选，确定条带清晰的多态性SSR标记用于遗传多样性分析。PCR反映体系20.0μL包括10×Buffer2.0μL，以超纯水补充至20μL，94℃预变形5min，72℃1min，72℃延伸5min，扩增产物用6%变性聚合丙烯酰胺凝胶分离电泳缓冲液为1×TBE，电泳后银染显色。

    用Popgene计算Shannons多态指数，计算Dice遗传相似系数，用Powermaket软件计算SSR位点的多态性信息量。根据每对SSR引物扩增的所有差异谱带，纯合位点的等位变异数据记录为X/X，杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，小片段在前，根据指纹图谱出现的概率共识P=1/2n，统计图谱的置信概率。

    ②实验结果

    利用改良的CTAB法可有效提取总DNA，经琼脂糖电泳监测，基因组DNA条带清晰，说明提取的DNA质量较好，对提取的DNA样品进行监测，OD260/OD280可用于SSR引物的筛选。

    利用115对引物对5份芒果资源进行引物筛选，利用64对引物组合对30份芒果种质进行扩增，根据SSR扩增结果，平均Shannons多态性指数为1.00，64对引物PIC变幅为0.07-0.77，引物M46的多态性对稿，所有引物中的PIC小于0.20的有4个。

    利用NTsys软件进行聚类分析，将30份芒果材料分为四类群体，第一类包括14分材料，第二類包括11分材料，第三类包括4分材料，第四类有一个品牌马切苏。

    选出7对SSR引物构建了数字化指纹图谱，发现引物产生标记信息可完全区分芒果品种，引物的多态性位点数为58，芒果品种中可能存在2个品种的电泳图谱完全相同。

    2总结

    SSR分子标记由于具有共显性等优点，已成为作物遗传多样性分析的主要方法，广泛应用于各种作物上，在芒果种质资源遗传多样性研究上相对落后，使用SSR标记数目一般少于40对，本文从115对SSR标记中筛选获得64对多态性SSR标记。

    由于我国芒果资源自国外不同地方引进，从国内不同地方收集的资源不能按地域性聚集。30份芒果主栽品种第一类包含14份材料，说明品种与其他品种亲缘关系较远。第二类根据国外引进材料育成品种，第三类材料仅有4分品种，说明同一单位育出的芒果品种可能是同一父母本，鹰嘴芒与象牙22聚类结果显示器亲缘关系较近，其遗传组分与鹰嘴芒更相似。

    目前，我国芒果生产中存在同物异名的现象，利用DNA分子标记技术，对苗真实性进行鉴定不受时空的限制，能最大幅度提高品种鉴定的准确度，我国将DNA指纹图谱鉴定作为品种质量监控的重要措施，本文建立30份中国芒果主栽品种数字指纹图谱。

    由于芒果遗传多样性丰富，建立了不同芒果品种的DNA指纹图谱，利用构建的SSR分子标记指纹图谱，可在芒果育种中合理选配亲本，加快遗传改良进程，为芒果品种群划分提供分子遗传学依据。

    （作者单位：1.531500广西壮族自治区田东县义圩镇农业服务中心;2.533000广西壮族自治区百色市芒果研究院;3.545400广西壮族自治区融安县农业技术推广中心;4.530000广西壮族自治区土壤肥料工作站）