冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株相关耐冷指标的影响
于锡宏+戴忠仁+蒋欣梅+董然
摘 要：以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响。结果表明，与冷胁迫和常温条件下的正常植株相比，冷胁迫后的基因沉默植株的相对电导率和丙二醛含量均显著增加，叶绿素含量显著降低；冷胁迫后的基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白含量增加的幅度远远低于冷胁迫后的正常植株增加的幅度。
关键词：冷胁迫；黄瓜；CBF1；基因沉默；耐冷指标
中图分类号：S642.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）22-0042-03
黄瓜（Cucumis sativus L.）是典型的冷敏感型植物，其所有组织以及果实器官都对低温敏感，通常温度在10～12℃以下时其生理活动失调、生长减缓或停止发育，5℃以下则难以适应[1]。黑龙江省位于高纬度地区，春秋季节易遭受寒流的侵袭，冷害多发，而作为我省冬春设施反季节生产的主栽蔬菜之一，冷敏感性已经成为黄瓜正常生长的主要限制因子。因此，研究黄瓜的冷胁迫机理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。
本试验以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响，通过对相对电导率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及叶绿素含量的分析，试图研究黄瓜冷胁迫反应的生理机制，为改进低温条件下黄瓜的栽培措施和研究黄瓜冷胁迫的生理机制提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 黄瓜沉默植株的获得
根据CBF1基因编码区的cDNA序列，设计带有相应酶切位点的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黄瓜cDNA为模板，PCR扩增目的片段，回收后克隆到pMD18-T载体，进行双酶切定向克隆在pgR107 载体的Cla I和Sal I多克隆位点，构建pgR107-CBF1。以本实验室保存黄瓜品种Y081无菌组培苗为试验材料，将无菌苗移栽到营养钵中，转到昼夜平均温度18℃条件下的人工气候箱中生长，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入叶片叶脉中，获得基因沉默植株。
1.2 试验处理
将基因沉默后的植株（T）放置在平均温度为18℃的条件下预处理1 d，然后置于昼夜平均温度7.5℃的光照培养箱中冷胁迫处理3 d，为了消除光照培养箱内因弱光条件而引起的试验误差，我们把始终处于常温条件下未经侵染处理的正常植株作为对照1（CK1），以采用相同方式进行冷处理的未经侵染处理的正常植株作为对照2（CK2）。随机选取功能叶进行相关生理生化指标的测定，其中相对电导率测定采用外渗电导法[2]；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量测定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[3]；叶绿素含量测定采用丙酮比色法[2]。
2 结果与分析
2.1 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相对电导率和叶绿素含量的影响
如表1所示，与常温条件下生长的对照CK1相比，经过冷胁迫后可以使植株叶片中的丙二醛含量和相对电导率显著提高，而叶绿素含量显著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相对电导率表现最高，显著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的叶绿素含量最低，显著低于CK1和CK2。处理T中的丙二醛含量和相对电导率比CK2分别高10.96%和41.48%，叶绿素含量比CK2降低了42.37%。说明冷胁迫对基因沉默植株的伤害要重于对照植株，可能已给植株造成不可恢复的伤害，其细胞膜系统的正常代谢活动已遭到破坏。
2.2 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白质含量的影响
通过比较冷胁迫下基因沉默植株与对照植株之间脯氨酸和可溶性蛋白质含量的变化可以看出（表2），冷胁迫后黄瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白质含量均显著增加，但与常温对照CK1比，冷胁迫后基因沉默植株（T）体内脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。
3 结论与讨论
冷胁迫对植物的整个生理代谢过程均产生影响，包括细胞原生质体的流动减缓和停滞、细胞器结构的破坏、有机物的合成受阻和运输缓慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷胁迫对植物造成伤害的一个重要方面是质膜相变引起的电解质外渗，而相对电导率是一个对低温比较敏感的指标，而且简便易测，能反映特定低温下质膜的透性[5]，为大多数研究者所使用。同时膜脂过氧化的终极分解产物是丙二醛，其含量的多少可反映膜质过氧化的程度，也间接反映了生物体抗氧化能力的强弱，其含量越高，说明植株遭受逆境伤害的程度越严重。张学明[6]研究发现，植物体内的丙二醛含量可表征细胞膜的损伤程度，丙二醛含量越高，细胞膜的透性越大；刘建辉等[7]认为，冷胁迫后的冷敏型黄瓜相对电导率高于耐冷型黄瓜。在果树上也有类似的报道，宋洪伟等[8]的研究表明，耐冷性强的悬钩子属、猕猴桃属和醋栗属的小浆果冷胁迫后膜脂不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值及不饱和度均较高，细胞膜的稳定性相对较高；刘艳等[9]研究发现，耐冷性强的梨品种体内脂肪及脂类物质的积累显著的高于不耐冷品种。植物的生长发育与植物体的光合作用紧密相关，低温对光合作用的影响也最大，叶绿体是植物体进行光合作用的主要场所，对冷胁迫最为敏感[10]，王毅等[11]研究发现，冷胁迫后黄瓜幼苗叶片的叶绿素含量显著降低，细胞正常代谢受影响；樊怀福等[12]发现冷胁迫后番茄的叶绿素和类胡萝卜素含量降低。这与我们的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明显低于对照植株，沉默植株正常生理代谢受到抑制，体内相对电导率和丙二醛含量显著增加，叶绿素含量显著降低。
冷胁迫下植物体内游离蛋白质含量和脯氨酸含量增加，可有利于细胞保水性的增加，降低细胞的结冰温度，提高植物的耐冷性。有些学者研究发现，黄瓜冷胁迫期间，体内可溶性蛋白含量和耐冷性之间呈正相关的关系，林善枝等[13]的研究表明，冷胁迫过程中毛白杨幼苗蛋白质含量的增加与其耐冷性和存活率的增强密切相关。对于蛋白质与植物耐冷性的关系，也有学者提出了不同的观点，简令成[14]认为，植物体内可溶性蛋白质的增加与植物耐冷性的增强无明显的因果关系，可溶性蛋白质含量在冷胁迫条件下无明显变化；何若韫[15]研究发现，冷胁迫下稻米体内的可溶性蛋白含量降低，而游离氨基酸含量增加，与耐冷型品种相比，冷敏型品种的可溶性蛋白质更低。我们的试验结果表明，冷胁迫后黄瓜CBF1基因沉默植株体内的脯氨酸和可溶性蛋白质含量增加的幅度远远低于未沉默植株增加幅度。
参考文献
[1] 山东农业大学.蔬菜栽培学总论[M].北京：中国农业出版社，2000.
[2] 高俊凤.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006.
[3] 郝再斌，苍晶，徐仲.植物生理实验[M].哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2006.
[4] 李美茹，刘鸿先.植物细胞中的抗寒物质及其与植物耐冷性的关系[J].植物生理学通讯，1995（5）：328-334.
[5] 逯明辉，娄群峰，陈劲枫.黄瓜的冷害及耐冷性[J].植物学通报，2004，21（5）：578-586.
[6] 张学明.桉树在低温胁迫下的脂膜过氧化作用和膜伤害[J].经济林研究，1994（S1）：12-14.
[7] 刘建辉，崔鸿文.电导法鉴定黄瓜抗寒性的研究[J].西北农业大学学报，1995（4）：74-77.
[8] 宋洪伟，董英山.用膜脂脂肪酸法鉴定小浆果资源的抗寒性[J].落叶果树，2000（3）：6-8.
[9] 刘艳，赵虎成，李雄，等.梨枝条中淀粉、还原糖及脂类物质动态变化与抗寒性的关系[J].内蒙古农业大学学报：自然科学版，2002，23（1）：57-60.
[10] 任旭琴，陈伯清.低温下辣椒幼苗光合特性的初步研究[J].江苏农业科学，2006（6）：243-244.
[11] 王毅，方秀娟，徐欣，等.黄瓜幼苗低温锻炼对叶片细胞叶绿体结构的影响[J].园艺学报，1995（3）：299-300.
[12] 樊怀福，蒋卫杰，郭世荣.低温对番茄幼苗植株生长和叶片光合作用的影响[J].江苏农业科学，2005（3）：89-91.
[13] 林善枝，李雪平，张志毅.在低温诱导毛白杨抗冻性中CaM含量和G6PDHase及ATPase活性的变化[J].北京林业大学学报，2001，23（5）：4-9.
[14] 简令成.植物抗寒机理研究的新进展[J].植物学通报，1992（3）：17-22.
[15] 何若韫.植物低温逆境生理[M].北京：中国农业出版社，1995.
摘 要：以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响。结果表明，与冷胁迫和常温条件下的正常植株相比，冷胁迫后的基因沉默植株的相对电导率和丙二醛含量均显著增加，叶绿素含量显著降低；冷胁迫后的基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白含量增加的幅度远远低于冷胁迫后的正常植株增加的幅度。
关键词：冷胁迫；黄瓜；CBF1；基因沉默；耐冷指标
中图分类号：S642.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）22-0042-03
黄瓜（Cucumis sativus L.）是典型的冷敏感型植物，其所有组织以及果实器官都对低温敏感，通常温度在10～12℃以下时其生理活动失调、生长减缓或停止发育，5℃以下则难以适应[1]。黑龙江省位于高纬度地区，春秋季节易遭受寒流的侵袭，冷害多发，而作为我省冬春设施反季节生产的主栽蔬菜之一，冷敏感性已经成为黄瓜正常生长的主要限制因子。因此，研究黄瓜的冷胁迫机理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。
本试验以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响，通过对相对电导率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及叶绿素含量的分析，试图研究黄瓜冷胁迫反应的生理机制，为改进低温条件下黄瓜的栽培措施和研究黄瓜冷胁迫的生理机制提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 黄瓜沉默植株的获得
根据CBF1基因编码区的cDNA序列，设计带有相应酶切位点的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黄瓜cDNA为模板，PCR扩增目的片段，回收后克隆到pMD18-T载体，进行双酶切定向克隆在pgR107 载体的Cla I和Sal I多克隆位点，构建pgR107-CBF1。以本实验室保存黄瓜品种Y081无菌组培苗为试验材料，将无菌苗移栽到营养钵中，转到昼夜平均温度18℃条件下的人工气候箱中生长，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入叶片叶脉中，获得基因沉默植株。
1.2 试验处理
将基因沉默后的植株（T）放置在平均温度为18℃的条件下预处理1 d，然后置于昼夜平均温度7.5℃的光照培养箱中冷胁迫处理3 d，为了消除光照培养箱内因弱光条件而引起的试验误差，我们把始终处于常温条件下未经侵染处理的正常植株作为对照1（CK1），以采用相同方式进行冷处理的未经侵染处理的正常植株作为对照2（CK2）。随机选取功能叶进行相关生理生化指标的测定，其中相对电导率测定采用外渗电导法[2]；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量测定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[3]；叶绿素含量测定采用丙酮比色法[2]。
2 结果与分析
2.1 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相对电导率和叶绿素含量的影响
如表1所示，与常温条件下生长的对照CK1相比，经过冷胁迫后可以使植株叶片中的丙二醛含量和相对电导率显著提高，而叶绿素含量显著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相对电导率表现最高，显著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的叶绿素含量最低，显著低于CK1和CK2。处理T中的丙二醛含量和相对电导率比CK2分别高10.96%和41.48%，叶绿素含量比CK2降低了42.37%。说明冷胁迫对基因沉默植株的伤害要重于对照植株，可能已给植株造成不可恢复的伤害，其细胞膜系统的正常代谢活动已遭到破坏。
2.2 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白质含量的影响
通过比较冷胁迫下基因沉默植株与对照植株之间脯氨酸和可溶性蛋白质含量的变化可以看出（表2），冷胁迫后黄瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白质含量均显著增加，但与常温对照CK1比，冷胁迫后基因沉默植株（T）体内脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。
3 结论与讨论
冷胁迫对植物的整个生理代谢过程均产生影响，包括细胞原生质体的流动减缓和停滞、细胞器结构的破坏、有机物的合成受阻和运输缓慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷胁迫对植物造成伤害的一个重要方面是质膜相变引起的电解质外渗，而相对电导率是一个对低温比较敏感的指标，而且简便易测，能反映特定低温下质膜的透性[5]，为大多数研究者所使用。同时膜脂过氧化的终极分解产物是丙二醛，其含量的多少可反映膜质过氧化的程度，也间接反映了生物体抗氧化能力的强弱，其含量越高，说明植株遭受逆境伤害的程度越严重。张学明[6]研究发现，植物体内的丙二醛含量可表征细胞膜的损伤程度，丙二醛含量越高，细胞膜的透性越大；刘建辉等[7]认为，冷胁迫后的冷敏型黄瓜相对电导率高于耐冷型黄瓜。在果树上也有类似的报道，宋洪伟等[8]的研究表明，耐冷性强的悬钩子属、猕猴桃属和醋栗属的小浆果冷胁迫后膜脂不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值及不饱和度均较高，细胞膜的稳定性相对较高；刘艳等[9]研究发现，耐冷性强的梨品种体内脂肪及脂类物质的积累显著的高于不耐冷品种。植物的生长发育与植物体的光合作用紧密相关，低温对光合作用的影响也最大，叶绿体是植物体进行光合作用的主要场所，对冷胁迫最为敏感[10]，王毅等[11]研究发现，冷胁迫后黄瓜幼苗叶片的叶绿素含量显著降低，细胞正常代谢受影响；樊怀福等[12]发现冷胁迫后番茄的叶绿素和类胡萝卜素含量降低。这与我们的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明显低于对照植株，沉默植株正常生理代谢受到抑制，体内相对电导率和丙二醛含量显著增加，叶绿素含量显著降低。
冷胁迫下植物体内游离蛋白质含量和脯氨酸含量增加，可有利于细胞保水性的增加，降低细胞的结冰温度，提高植物的耐冷性。有些学者研究发现，黄瓜冷胁迫期间，体内可溶性蛋白含量和耐冷性之间呈正相关的关系，林善枝等[13]的研究表明，冷胁迫过程中毛白杨幼苗蛋白质含量的增加与其耐冷性和存活率的增强密切相关。对于蛋白质与植物耐冷性的关系，也有学者提出了不同的观点，简令成[14]认为，植物体内可溶性蛋白质的增加与植物耐冷性的增强无明显的因果关系，可溶性蛋白质含量在冷胁迫条件下无明显变化；何若韫[15]研究发现，冷胁迫下稻米体内的可溶性蛋白含量降低，而游离氨基酸含量增加，与耐冷型品种相比，冷敏型品种的可溶性蛋白质更低。我们的试验结果表明，冷胁迫后黄瓜CBF1基因沉默植株体内的脯氨酸和可溶性蛋白质含量增加的幅度远远低于未沉默植株增加幅度。
参考文献
[1] 山东农业大学.蔬菜栽培学总论[M].北京：中国农业出版社，2000.
[2] 高俊凤.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006.
[3] 郝再斌，苍晶，徐仲.植物生理实验[M].哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2006.
[4] 李美茹，刘鸿先.植物细胞中的抗寒物质及其与植物耐冷性的关系[J].植物生理学通讯，1995（5）：328-334.
[5] 逯明辉，娄群峰，陈劲枫.黄瓜的冷害及耐冷性[J].植物学通报，2004，21（5）：578-586.
[6] 张学明.桉树在低温胁迫下的脂膜过氧化作用和膜伤害[J].经济林研究，1994（S1）：12-14.
[7] 刘建辉，崔鸿文.电导法鉴定黄瓜抗寒性的研究[J].西北农业大学学报，1995（4）：74-77.
[8] 宋洪伟，董英山.用膜脂脂肪酸法鉴定小浆果资源的抗寒性[J].落叶果树，2000（3）：6-8.
[9] 刘艳，赵虎成，李雄，等.梨枝条中淀粉、还原糖及脂类物质动态变化与抗寒性的关系[J].内蒙古农业大学学报：自然科学版，2002，23（1）：57-60.
[10] 任旭琴，陈伯清.低温下辣椒幼苗光合特性的初步研究[J].江苏农业科学，2006（6）：243-244.
[11] 王毅，方秀娟，徐欣，等.黄瓜幼苗低温锻炼对叶片细胞叶绿体结构的影响[J].园艺学报，1995（3）：299-300.
[12] 樊怀福，蒋卫杰，郭世荣.低温对番茄幼苗植株生长和叶片光合作用的影响[J].江苏农业科学，2005（3）：89-91.
[13] 林善枝，李雪平，张志毅.在低温诱导毛白杨抗冻性中CaM含量和G6PDHase及ATPase活性的变化[J].北京林业大学学报，2001，23（5）：4-9.
[14] 简令成.植物抗寒机理研究的新进展[J].植物学通报，1992（3）：17-22.
[15] 何若韫.植物低温逆境生理[M].北京：中国农业出版社，1995.
摘 要：以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响。结果表明，与冷胁迫和常温条件下的正常植株相比，冷胁迫后的基因沉默植株的相对电导率和丙二醛含量均显著增加，叶绿素含量显著降低；冷胁迫后的基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白含量增加的幅度远远低于冷胁迫后的正常植株增加的幅度。
关键词：冷胁迫；黄瓜；CBF1；基因沉默；耐冷指标
中图分类号：S642.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）22-0042-03
黄瓜（Cucumis sativus L.）是典型的冷敏感型植物，其所有组织以及果实器官都对低温敏感，通常温度在10～12℃以下时其生理活动失调、生长减缓或停止发育，5℃以下则难以适应[1]。黑龙江省位于高纬度地区，春秋季节易遭受寒流的侵袭，冷害多发，而作为我省冬春设施反季节生产的主栽蔬菜之一，冷敏感性已经成为黄瓜正常生长的主要限制因子。因此，研究黄瓜的冷胁迫机理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。
本试验以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响，通过对相对电导率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及叶绿素含量的分析，试图研究黄瓜冷胁迫反应的生理机制，为改进低温条件下黄瓜的栽培措施和研究黄瓜冷胁迫的生理机制提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 黄瓜沉默植株的获得
根据CBF1基因编码区的cDNA序列，设计带有相应酶切位点的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黄瓜cDNA为模板，PCR扩增目的片段，回收后克隆到pMD18-T载体，进行双酶切定向克隆在pgR107 载体的Cla I和Sal I多克隆位点，构建pgR107-CBF1。以本实验室保存黄瓜品种Y081无菌组培苗为试验材料，将无菌苗移栽到营养钵中，转到昼夜平均温度18℃条件下的人工气候箱中生长，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入叶片叶脉中，获得基因沉默植株。
1.2 试验处理
将基因沉默后的植株（T）放置在平均温度为18℃的条件下预处理1 d，然后置于昼夜平均温度7.5℃的光照培养箱中冷胁迫处理3 d，为了消除光照培养箱内因弱光条件而引起的试验误差，我们把始终处于常温条件下未经侵染处理的正常植株作为对照1（CK1），以采用相同方式进行冷处理的未经侵染处理的正常植株作为对照2（CK2）。随机选取功能叶进行相关生理生化指标的测定，其中相对电导率测定采用外渗电导法[2]；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量测定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[3]；叶绿素含量测定采用丙酮比色法[2]。
2 结果与分析
2.1 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相对电导率和叶绿素含量的影响
如表1所示，与常温条件下生长的对照CK1相比，经过冷胁迫后可以使植株叶片中的丙二醛含量和相对电导率显著提高，而叶绿素含量显著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相对电导率表现最高，显著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的叶绿素含量最低，显著低于CK1和CK2。处理T中的丙二醛含量和相对电导率比CK2分别高10.96%和41.48%，叶绿素含量比CK2降低了42.37%。说明冷胁迫对基因沉默植株的伤害要重于对照植株，可能已给植株造成不可恢复的伤害，其细胞膜系统的正常代谢活动已遭到破坏。
2.2 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白质含量的影响
通过比较冷胁迫下基因沉默植株与对照植株之间脯氨酸和可溶性蛋白质含量的变化可以看出（表2），冷胁迫后黄瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白质含量均显著增加，但与常温对照CK1比，冷胁迫后基因沉默植株（T）体内脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。
3 结论与讨论
冷胁迫对植物的整个生理代谢过程均产生影响，包括细胞原生质体的流动减缓和停滞、细胞器结构的破坏、有机物的合成受阻和运输缓慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷胁迫对植物造成伤害的一个重要方面是质膜相变引起的电解质外渗，而相对电导率是一个对低温比较敏感的指标，而且简便易测，能反映特定低温下质膜的透性[5]，为大多数研究者所使用。同时膜脂过氧化的终极分解产物是丙二醛，其含量的多少可反映膜质过氧化的程度，也间接反映了生物体抗氧化能力的强弱，其含量越高，说明植株遭受逆境伤害的程度越严重。张学明[6]研究发现，植物体内的丙二醛含量可表征细胞膜的损伤程度，丙二醛含量越高，细胞膜的透性越大；刘建辉等[7]认为，冷胁迫后的冷敏型黄瓜相对电导率高于耐冷型黄瓜。在果树上也有类似的报道，宋洪伟等[8]的研究表明，耐冷性强的悬钩子属、猕猴桃属和醋栗属的小浆果冷胁迫后膜脂不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值及不饱和度均较高，细胞膜的稳定性相对较高；刘艳等[9]研究发现，耐冷性强的梨品种体内脂肪及脂类物质的积累显著的高于不耐冷品种。植物的生长发育与植物体的光合作用紧密相关，低温对光合作用的影响也最大，叶绿体是植物体进行光合作用的主要场所，对冷胁迫最为敏感[10]，王毅等[11]研究发现，冷胁迫后黄瓜幼苗叶片的叶绿素含量显著降低，细胞正常代谢受影响；樊怀福等[12]发现冷胁迫后番茄的叶绿素和类胡萝卜素含量降低。这与我们的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明显低于对照植株，沉默植株正常生理代谢受到抑制，体内相对电导率和丙二醛含量显著增加，叶绿素含量显著降低。
冷胁迫下植物体内游离蛋白质含量和脯氨酸含量增加，可有利于细胞保水性的增加，降低细胞的结冰温度，提高植物的耐冷性。有些学者研究发现，黄瓜冷胁迫期间，体内可溶性蛋白含量和耐冷性之间呈正相关的关系，林善枝等[13]的研究表明，冷胁迫过程中毛白杨幼苗蛋白质含量的增加与其耐冷性和存活率的增强密切相关。对于蛋白质与植物耐冷性的关系，也有学者提出了不同的观点，简令成[14]认为，植物体内可溶性蛋白质的增加与植物耐冷性的增强无明显的因果关系，可溶性蛋白质含量在冷胁迫条件下无明显变化；何若韫[15]研究发现，冷胁迫下稻米体内的可溶性蛋白含量降低，而游离氨基酸含量增加，与耐冷型品种相比，冷敏型品种的可溶性蛋白质更低。我们的试验结果表明，冷胁迫后黄瓜CBF1基因沉默植株体内的脯氨酸和可溶性蛋白质含量增加的幅度远远低于未沉默植株增加幅度。
参考文献
[1] 山东农业大学.蔬菜栽培学总论[M].北京：中国农业出版社，2000.
[2] 高俊凤.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006.
[3] 郝再斌，苍晶，徐仲.植物生理实验[M].哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2006.
[4] 李美茹，刘鸿先.植物细胞中的抗寒物质及其与植物耐冷性的关系[J].植物生理学通讯，1995（5）：328-334.
[5] 逯明辉，娄群峰，陈劲枫.黄瓜的冷害及耐冷性[J].植物学通报，2004，21（5）：578-586.
[6] 张学明.桉树在低温胁迫下的脂膜过氧化作用和膜伤害[J].经济林研究，1994（S1）：12-14.
[7] 刘建辉，崔鸿文.电导法鉴定黄瓜抗寒性的研究[J].西北农业大学学报，1995（4）：74-77.
[8] 宋洪伟，董英山.用膜脂脂肪酸法鉴定小浆果资源的抗寒性[J].落叶果树，2000（3）：6-8.
[9] 刘艳，赵虎成，李雄，等.梨枝条中淀粉、还原糖及脂类物质动态变化与抗寒性的关系[J].内蒙古农业大学学报：自然科学版，2002，23（1）：57-60.
[10] 任旭琴，陈伯清.低温下辣椒幼苗光合特性的初步研究[J].江苏农业科学，2006（6）：243-244.
[11] 王毅，方秀娟，徐欣，等.黄瓜幼苗低温锻炼对叶片细胞叶绿体结构的影响[J].园艺学报，1995（3）：299-300.
[12] 樊怀福，蒋卫杰，郭世荣.低温对番茄幼苗植株生长和叶片光合作用的影响[J].江苏农业科学，2005（3）：89-91.
[13] 林善枝，李雪平，张志毅.在低温诱导毛白杨抗冻性中CaM含量和G6PDHase及ATPase活性的变化[J].北京林业大学学报，2001，23（5）：4-9.
[14] 简令成.植物抗寒机理研究的新进展[J].植物学通报，1992（3）：17-22.
[15] 何若韫.植物低温逆境生理[M].北京：中国农业出版社，1995.
摘 要：以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响。结果表明，与冷胁迫和常温条件下的正常植株相比，冷胁迫后的基因沉默植株的相对电导率和丙二醛含量均显著增加，叶绿素含量显著降低；冷胁迫后的基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白含量增加的幅度远远低于冷胁迫后的正常植株增加的幅度。
关键词：冷胁迫；黄瓜；CBF1；基因沉默；耐冷指标
中图分类号：S642.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）22-0042-03
黄瓜（Cucumis sativus L.）是典型的冷敏感型植物，其所有组织以及果实器官都对低温敏感，通常温度在10～12℃以下时其生理活动失调、生长减缓或停止发育，5℃以下则难以适应[1]。黑龙江省位于高纬度地区，春秋季节易遭受寒流的侵袭，冷害多发，而作为我省冬春设施反季节生产的主栽蔬菜之一，冷敏感性已经成为黄瓜正常生长的主要限制因子。因此，研究黄瓜的冷胁迫机理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。
本试验以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响，通过对相对电导率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及叶绿素含量的分析，试图研究黄瓜冷胁迫反应的生理机制，为改进低温条件下黄瓜的栽培措施和研究黄瓜冷胁迫的生理机制提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 黄瓜沉默植株的获得
根据CBF1基因编码区的cDNA序列，设计带有相应酶切位点的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黄瓜cDNA为模板，PCR扩增目的片段，回收后克隆到pMD18-T载体，进行双酶切定向克隆在pgR107 载体的Cla I和Sal I多克隆位点，构建pgR107-CBF1。以本实验室保存黄瓜品种Y081无菌组培苗为试验材料，将无菌苗移栽到营养钵中，转到昼夜平均温度18℃条件下的人工气候箱中生长，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入叶片叶脉中，获得基因沉默植株。
1.2 试验处理
将基因沉默后的植株（T）放置在平均温度为18℃的条件下预处理1 d，然后置于昼夜平均温度7.5℃的光照培养箱中冷胁迫处理3 d，为了消除光照培养箱内因弱光条件而引起的试验误差，我们把始终处于常温条件下未经侵染处理的正常植株作为对照1（CK1），以采用相同方式进行冷处理的未经侵染处理的正常植株作为对照2（CK2）。随机选取功能叶进行相关生理生化指标的测定，其中相对电导率测定采用外渗电导法[2]；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量测定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[3]；叶绿素含量测定采用丙酮比色法[2]。
2 结果与分析
2.1 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相对电导率和叶绿素含量的影响
如表1所示，与常温条件下生长的对照CK1相比，经过冷胁迫后可以使植株叶片中的丙二醛含量和相对电导率显著提高，而叶绿素含量显著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相对电导率表现最高，显著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的叶绿素含量最低，显著低于CK1和CK2。处理T中的丙二醛含量和相对电导率比CK2分别高10.96%和41.48%，叶绿素含量比CK2降低了42.37%。说明冷胁迫对基因沉默植株的伤害要重于对照植株，可能已给植株造成不可恢复的伤害，其细胞膜系统的正常代谢活动已遭到破坏。
2.2 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白质含量的影响
通过比较冷胁迫下基因沉默植株与对照植株之间脯氨酸和可溶性蛋白质含量的变化可以看出（表2），冷胁迫后黄瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白质含量均显著增加，但与常温对照CK1比，冷胁迫后基因沉默植株（T）体内脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。
3 结论与讨论
冷胁迫对植物的整个生理代谢过程均产生影响，包括细胞原生质体的流动减缓和停滞、细胞器结构的破坏、有机物的合成受阻和运输缓慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷胁迫对植物造成伤害的一个重要方面是质膜相变引起的电解质外渗，而相对电导率是一个对低温比较敏感的指标，而且简便易测，能反映特定低温下质膜的透性[5]，为大多数研究者所使用。同时膜脂过氧化的终极分解产物是丙二醛，其含量的多少可反映膜质过氧化的程度，也间接反映了生物体抗氧化能力的强弱，其含量越高，说明植株遭受逆境伤害的程度越严重。张学明[6]研究发现，植物体内的丙二醛含量可表征细胞膜的损伤程度，丙二醛含量越高，细胞膜的透性越大；刘建辉等[7]认为，冷胁迫后的冷敏型黄瓜相对电导率高于耐冷型黄瓜。在果树上也有类似的报道，宋洪伟等[8]的研究表明，耐冷性强的悬钩子属、猕猴桃属和醋栗属的小浆果冷胁迫后膜脂不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值及不饱和度均较高，细胞膜的稳定性相对较高；刘艳等[9]研究发现，耐冷性强的梨品种体内脂肪及脂类物质的积累显著的高于不耐冷品种。植物的生长发育与植物体的光合作用紧密相关，低温对光合作用的影响也最大，叶绿体是植物体进行光合作用的主要场所，对冷胁迫最为敏感[10]，王毅等[11]研究发现，冷胁迫后黄瓜幼苗叶片的叶绿素含量显著降低，细胞正常代谢受影响；樊怀福等[12]发现冷胁迫后番茄的叶绿素和类胡萝卜素含量降低。这与我们的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明显低于对照植株，沉默植株正常生理代谢受到抑制，体内相对电导率和丙二醛含量显著增加，叶绿素含量显著降低。
冷胁迫下植物体内游离蛋白质含量和脯氨酸含量增加，可有利于细胞保水性的增加，降低细胞的结冰温度，提高植物的耐冷性。有些学者研究发现，黄瓜冷胁迫期间，体内可溶性蛋白含量和耐冷性之间呈正相关的关系，林善枝等[13]的研究表明，冷胁迫过程中毛白杨幼苗蛋白质含量的增加与其耐冷性和存活率的增强密切相关。对于蛋白质与植物耐冷性的关系，也有学者提出了不同的观点，简令成[14]认为，植物体内可溶性蛋白质的增加与植物耐冷性的增强无明显的因果关系，可溶性蛋白质含量在冷胁迫条件下无明显变化；何若韫[15]研究发现，冷胁迫下稻米体内的可溶性蛋白含量降低，而游离氨基酸含量增加，与耐冷型品种相比，冷敏型品种的可溶性蛋白质更低。我们的试验结果表明，冷胁迫后黄瓜CBF1基因沉默植株体内的脯氨酸和可溶性蛋白质含量增加的幅度远远低于未沉默植株增加幅度。
参考文献
[1] 山东农业大学.蔬菜栽培学总论[M].北京：中国农业出版社，2000.
[2] 高俊凤.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006.
[3] 郝再斌，苍晶，徐仲.植物生理实验[M].哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2006.
[4] 李美茹，刘鸿先.植物细胞中的抗寒物质及其与植物耐冷性的关系[J].植物生理学通讯，1995（5）：328-334.
[5] 逯明辉，娄群峰，陈劲枫.黄瓜的冷害及耐冷性[J].植物学通报，2004，21（5）：578-586.
[6] 张学明.桉树在低温胁迫下的脂膜过氧化作用和膜伤害[J].经济林研究，1994（S1）：12-14.
[7] 刘建辉，崔鸿文.电导法鉴定黄瓜抗寒性的研究[J].西北农业大学学报，1995（4）：74-77.
[8] 宋洪伟，董英山.用膜脂脂肪酸法鉴定小浆果资源的抗寒性[J].落叶果树，2000（3）：6-8.
[9] 刘艳，赵虎成，李雄，等.梨枝条中淀粉、还原糖及脂类物质动态变化与抗寒性的关系[J].内蒙古农业大学学报：自然科学版，2002，23（1）：57-60.
[10] 任旭琴，陈伯清.低温下辣椒幼苗光合特性的初步研究[J].江苏农业科学，2006（6）：243-244.
[11] 王毅，方秀娟，徐欣，等.黄瓜幼苗低温锻炼对叶片细胞叶绿体结构的影响[J].园艺学报，1995（3）：299-300.
[12] 樊怀福，蒋卫杰，郭世荣.低温对番茄幼苗植株生长和叶片光合作用的影响[J].江苏农业科学，2005（3）：89-91.
[13] 林善枝，李雪平，张志毅.在低温诱导毛白杨抗冻性中CaM含量和G6PDHase及ATPase活性的变化[J].北京林业大学学报，2001，23（5）：4-9.
[14] 简令成.植物抗寒机理研究的新进展[J].植物学通报，1992（3）：17-22.
[15] 何若韫.植物低温逆境生理[M].北京：中国农业出版社，1995.
摘 要：以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响。结果表明，与冷胁迫和常温条件下的正常植株相比，冷胁迫后的基因沉默植株的相对电导率和丙二醛含量均显著增加，叶绿素含量显著降低；冷胁迫后的基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白含量增加的幅度远远低于冷胁迫后的正常植株增加的幅度。
关键词：冷胁迫；黄瓜；CBF1；基因沉默；耐冷指标
中图分类号：S642.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）22-0042-03
黄瓜（Cucumis sativus L.）是典型的冷敏感型植物，其所有组织以及果实器官都对低温敏感，通常温度在10～12℃以下时其生理活动失调、生长减缓或停止发育，5℃以下则难以适应[1]。黑龙江省位于高纬度地区，春秋季节易遭受寒流的侵袭，冷害多发，而作为我省冬春设施反季节生产的主栽蔬菜之一，冷敏感性已经成为黄瓜正常生长的主要限制因子。因此，研究黄瓜的冷胁迫机理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。
本试验以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响，通过对相对电导率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及叶绿素含量的分析，试图研究黄瓜冷胁迫反应的生理机制，为改进低温条件下黄瓜的栽培措施和研究黄瓜冷胁迫的生理机制提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 黄瓜沉默植株的获得
根据CBF1基因编码区的cDNA序列，设计带有相应酶切位点的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黄瓜cDNA为模板，PCR扩增目的片段，回收后克隆到pMD18-T载体，进行双酶切定向克隆在pgR107 载体的Cla I和Sal I多克隆位点，构建pgR107-CBF1。以本实验室保存黄瓜品种Y081无菌组培苗为试验材料，将无菌苗移栽到营养钵中，转到昼夜平均温度18℃条件下的人工气候箱中生长，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入叶片叶脉中，获得基因沉默植株。
1.2 试验处理
将基因沉默后的植株（T）放置在平均温度为18℃的条件下预处理1 d，然后置于昼夜平均温度7.5℃的光照培养箱中冷胁迫处理3 d，为了消除光照培养箱内因弱光条件而引起的试验误差，我们把始终处于常温条件下未经侵染处理的正常植株作为对照1（CK1），以采用相同方式进行冷处理的未经侵染处理的正常植株作为对照2（CK2）。随机选取功能叶进行相关生理生化指标的测定，其中相对电导率测定采用外渗电导法[2]；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量测定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[3]；叶绿素含量测定采用丙酮比色法[2]。
2 结果与分析
2.1 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相对电导率和叶绿素含量的影响
如表1所示，与常温条件下生长的对照CK1相比，经过冷胁迫后可以使植株叶片中的丙二醛含量和相对电导率显著提高，而叶绿素含量显著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相对电导率表现最高，显著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的叶绿素含量最低，显著低于CK1和CK2。处理T中的丙二醛含量和相对电导率比CK2分别高10.96%和41.48%，叶绿素含量比CK2降低了42.37%。说明冷胁迫对基因沉默植株的伤害要重于对照植株，可能已给植株造成不可恢复的伤害，其细胞膜系统的正常代谢活动已遭到破坏。
2.2 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白质含量的影响
通过比较冷胁迫下基因沉默植株与对照植株之间脯氨酸和可溶性蛋白质含量的变化可以看出（表2），冷胁迫后黄瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白质含量均显著增加，但与常温对照CK1比，冷胁迫后基因沉默植株（T）体内脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。
3 结论与讨论
冷胁迫对植物的整个生理代谢过程均产生影响，包括细胞原生质体的流动减缓和停滞、细胞器结构的破坏、有机物的合成受阻和运输缓慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷胁迫对植物造成伤害的一个重要方面是质膜相变引起的电解质外渗，而相对电导率是一个对低温比较敏感的指标，而且简便易测，能反映特定低温下质膜的透性[5]，为大多数研究者所使用。同时膜脂过氧化的终极分解产物是丙二醛，其含量的多少可反映膜质过氧化的程度，也间接反映了生物体抗氧化能力的强弱，其含量越高，说明植株遭受逆境伤害的程度越严重。张学明[6]研究发现，植物体内的丙二醛含量可表征细胞膜的损伤程度，丙二醛含量越高，细胞膜的透性越大；刘建辉等[7]认为，冷胁迫后的冷敏型黄瓜相对电导率高于耐冷型黄瓜。在果树上也有类似的报道，宋洪伟等[8]的研究表明，耐冷性强的悬钩子属、猕猴桃属和醋栗属的小浆果冷胁迫后膜脂不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值及不饱和度均较高，细胞膜的稳定性相对较高；刘艳等[9]研究发现，耐冷性强的梨品种体内脂肪及脂类物质的积累显著的高于不耐冷品种。植物的生长发育与植物体的光合作用紧密相关，低温对光合作用的影响也最大，叶绿体是植物体进行光合作用的主要场所，对冷胁迫最为敏感[10]，王毅等[11]研究发现，冷胁迫后黄瓜幼苗叶片的叶绿素含量显著降低，细胞正常代谢受影响；樊怀福等[12]发现冷胁迫后番茄的叶绿素和类胡萝卜素含量降低。这与我们的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明显低于对照植株，沉默植株正常生理代谢受到抑制，体内相对电导率和丙二醛含量显著增加，叶绿素含量显著降低。
冷胁迫下植物体内游离蛋白质含量和脯氨酸含量增加，可有利于细胞保水性的增加，降低细胞的结冰温度，提高植物的耐冷性。有些学者研究发现，黄瓜冷胁迫期间，体内可溶性蛋白含量和耐冷性之间呈正相关的关系，林善枝等[13]的研究表明，冷胁迫过程中毛白杨幼苗蛋白质含量的增加与其耐冷性和存活率的增强密切相关。对于蛋白质与植物耐冷性的关系，也有学者提出了不同的观点，简令成[14]认为，植物体内可溶性蛋白质的增加与植物耐冷性的增强无明显的因果关系，可溶性蛋白质含量在冷胁迫条件下无明显变化；何若韫[15]研究发现，冷胁迫下稻米体内的可溶性蛋白含量降低，而游离氨基酸含量增加，与耐冷型品种相比，冷敏型品种的可溶性蛋白质更低。我们的试验结果表明，冷胁迫后黄瓜CBF1基因沉默植株体内的脯氨酸和可溶性蛋白质含量增加的幅度远远低于未沉默植株增加幅度。
参考文献
[1] 山东农业大学.蔬菜栽培学总论[M].北京：中国农业出版社，2000.
[2] 高俊凤.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006.
[3] 郝再斌，苍晶，徐仲.植物生理实验[M].哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2006.
[4] 李美茹，刘鸿先.植物细胞中的抗寒物质及其与植物耐冷性的关系[J].植物生理学通讯，1995（5）：328-334.
[5] 逯明辉，娄群峰，陈劲枫.黄瓜的冷害及耐冷性[J].植物学通报，2004，21（5）：578-586.
[6] 张学明.桉树在低温胁迫下的脂膜过氧化作用和膜伤害[J].经济林研究，1994（S1）：12-14.
[7] 刘建辉，崔鸿文.电导法鉴定黄瓜抗寒性的研究[J].西北农业大学学报，1995（4）：74-77.
[8] 宋洪伟，董英山.用膜脂脂肪酸法鉴定小浆果资源的抗寒性[J].落叶果树，2000（3）：6-8.
[9] 刘艳，赵虎成，李雄，等.梨枝条中淀粉、还原糖及脂类物质动态变化与抗寒性的关系[J].内蒙古农业大学学报：自然科学版，2002，23（1）：57-60.
[10] 任旭琴，陈伯清.低温下辣椒幼苗光合特性的初步研究[J].江苏农业科学，2006（6）：243-244.
[11] 王毅，方秀娟，徐欣，等.黄瓜幼苗低温锻炼对叶片细胞叶绿体结构的影响[J].园艺学报，1995（3）：299-300.
[12] 樊怀福，蒋卫杰，郭世荣.低温对番茄幼苗植株生长和叶片光合作用的影响[J].江苏农业科学，2005（3）：89-91.
[13] 林善枝，李雪平，张志毅.在低温诱导毛白杨抗冻性中CaM含量和G6PDHase及ATPase活性的变化[J].北京林业大学学报，2001，23（5）：4-9.
[14] 简令成.植物抗寒机理研究的新进展[J].植物学通报，1992（3）：17-22.
[15] 何若韫.植物低温逆境生理[M].北京：中国农业出版社，1995.
摘 要：以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响。结果表明，与冷胁迫和常温条件下的正常植株相比，冷胁迫后的基因沉默植株的相对电导率和丙二醛含量均显著增加，叶绿素含量显著降低；冷胁迫后的基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白含量增加的幅度远远低于冷胁迫后的正常植株增加的幅度。
关键词：冷胁迫；黄瓜；CBF1；基因沉默；耐冷指标
中图分类号：S642.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）22-0042-03
黄瓜（Cucumis sativus L.）是典型的冷敏感型植物，其所有组织以及果实器官都对低温敏感，通常温度在10～12℃以下时其生理活动失调、生长减缓或停止发育，5℃以下则难以适应[1]。黑龙江省位于高纬度地区，春秋季节易遭受寒流的侵袭，冷害多发，而作为我省冬春设施反季节生产的主栽蔬菜之一，冷敏感性已经成为黄瓜正常生长的主要限制因子。因此，研究黄瓜的冷胁迫机理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。
本试验以黄瓜CBF1基因沉默植株为试材，研究了冷胁迫下黄瓜CBF1基因的沉默对植株相关耐冷指标的影响，通过对相对电导率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及叶绿素含量的分析，试图研究黄瓜冷胁迫反应的生理机制，为改进低温条件下黄瓜的栽培措施和研究黄瓜冷胁迫的生理机制提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 黄瓜沉默植株的获得
根据CBF1基因编码区的cDNA序列，设计带有相应酶切位点的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黄瓜cDNA为模板，PCR扩增目的片段，回收后克隆到pMD18-T载体，进行双酶切定向克隆在pgR107 载体的Cla I和Sal I多克隆位点，构建pgR107-CBF1。以本实验室保存黄瓜品种Y081无菌组培苗为试验材料，将无菌苗移栽到营养钵中，转到昼夜平均温度18℃条件下的人工气候箱中生长，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入叶片叶脉中，获得基因沉默植株。
1.2 试验处理
将基因沉默后的植株（T）放置在平均温度为18℃的条件下预处理1 d，然后置于昼夜平均温度7.5℃的光照培养箱中冷胁迫处理3 d，为了消除光照培养箱内因弱光条件而引起的试验误差，我们把始终处于常温条件下未经侵染处理的正常植株作为对照1（CK1），以采用相同方式进行冷处理的未经侵染处理的正常植株作为对照2（CK2）。随机选取功能叶进行相关生理生化指标的测定，其中相对电导率测定采用外渗电导法[2]；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量测定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[3]；叶绿素含量测定采用丙酮比色法[2]。
2 结果与分析
2.1 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相对电导率和叶绿素含量的影响
如表1所示，与常温条件下生长的对照CK1相比，经过冷胁迫后可以使植株叶片中的丙二醛含量和相对电导率显著提高，而叶绿素含量显著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相对电导率表现最高，显著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的叶绿素含量最低，显著低于CK1和CK2。处理T中的丙二醛含量和相对电导率比CK2分别高10.96%和41.48%，叶绿素含量比CK2降低了42.37%。说明冷胁迫对基因沉默植株的伤害要重于对照植株，可能已给植株造成不可恢复的伤害，其细胞膜系统的正常代谢活动已遭到破坏。
2.2 冷胁迫对黄瓜CBF1基因沉默植株体内脯氨酸和可溶性蛋白质含量的影响
通过比较冷胁迫下基因沉默植株与对照植株之间脯氨酸和可溶性蛋白质含量的变化可以看出（表2），冷胁迫后黄瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白质含量均显著增加，但与常温对照CK1比，冷胁迫后基因沉默植株（T）体内脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。
3 结论与讨论
冷胁迫对植物的整个生理代谢过程均产生影响，包括细胞原生质体的流动减缓和停滞、细胞器结构的破坏、有机物的合成受阻和运输缓慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷胁迫对植物造成伤害的一个重要方面是质膜相变引起的电解质外渗，而相对电导率是一个对低温比较敏感的指标，而且简便易测，能反映特定低温下质膜的透性[5]，为大多数研究者所使用。同时膜脂过氧化的终极分解产物是丙二醛，其含量的多少可反映膜质过氧化的程度，也间接反映了生物体抗氧化能力的强弱，其含量越高，说明植株遭受逆境伤害的程度越严重。张学明[6]研究发现，植物体内的丙二醛含量可表征细胞膜的损伤程度，丙二醛含量越高，细胞膜的透性越大；刘建辉等[7]认为，冷胁迫后的冷敏型黄瓜相对电导率高于耐冷型黄瓜。在果树上也有类似的报道，宋洪伟等[8]的研究表明，耐冷性强的悬钩子属、猕猴桃属和醋栗属的小浆果冷胁迫后膜脂不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值及不饱和度均较高，细胞膜的稳定性相对较高；刘艳等[9]研究发现，耐冷性强的梨品种体内脂肪及脂类物质的积累显著的高于不耐冷品种。植物的生长发育与植物体的光合作用紧密相关，低温对光合作用的影响也最大，叶绿体是植物体进行光合作用的主要场所，对冷胁迫最为敏感[10]，王毅等[11]研究发现，冷胁迫后黄瓜幼苗叶片的叶绿素含量显著降低，细胞正常代谢受影响；樊怀福等[12]发现冷胁迫后番茄的叶绿素和类胡萝卜素含量降低。这与我们的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明显低于对照植株，沉默植株正常生理代谢受到抑制，体内相对电导率和丙二醛含量显著增加，叶绿素含量显著降低。
冷胁迫下植物体内游离蛋白质含量和脯氨酸含量增加，可有利于细胞保水性的增加，降低细胞的结冰温度，提高植物的耐冷性。有些学者研究发现，黄瓜冷胁迫期间，体内可溶性蛋白含量和耐冷性之间呈正相关的关系，林善枝等[13]的研究表明，冷胁迫过程中毛白杨幼苗蛋白质含量的增加与其耐冷性和存活率的增强密切相关。对于蛋白质与植物耐冷性的关系，也有学者提出了不同的观点，简令成[14]认为，植物体内可溶性蛋白质的增加与植物耐冷性的增强无明显的因果关系，可溶性蛋白质含量在冷胁迫条件下无明显变化；何若韫[15]研究发现，冷胁迫下稻米体内的可溶性蛋白含量降低，而游离氨基酸含量增加，与耐冷型品种相比，冷敏型品种的可溶性蛋白质更低。我们的试验结果表明，冷胁迫后黄瓜CBF1基因沉默植株体内的脯氨酸和可溶性蛋白质含量增加的幅度远远低于未沉默植株增加幅度。
参考文献
[1] 山东农业大学.蔬菜栽培学总论[M].北京：中国农业出版社，2000.
[2] 高俊凤.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006.
[3] 郝再斌，苍晶，徐仲.植物生理实验[M].哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2006.
[4] 李美茹，刘鸿先.植物细胞中的抗寒物质及其与植物耐冷性的关系[J].植物生理学通讯，1995（5）：328-334.
[5] 逯明辉，娄群峰，陈劲枫.黄瓜的冷害及耐冷性[J].植物学通报，2004，21（5）：578-586.
[6] 张学明.桉树在低温胁迫下的脂膜过氧化作用和膜伤害[J].经济林研究，1994（S1）：12-14.
[7] 刘建辉，崔鸿文.电导法鉴定黄瓜抗寒性的研究[J].西北农业大学学报，1995（4）：74-77.
[8] 宋洪伟，董英山.用膜脂脂肪酸法鉴定小浆果资源的抗寒性[J].落叶果树，2000（3）：6-8.
[9] 刘艳，赵虎成，李雄，等.梨枝条中淀粉、还原糖及脂类物质动态变化与抗寒性的关系[J].内蒙古农业大学学报：自然科学版，2002，23（1）：57-60.
[10] 任旭琴，陈伯清.低温下辣椒幼苗光合特性的初步研究[J].江苏农业科学，2006（6）：243-244.
[11] 王毅，方秀娟，徐欣，等.黄瓜幼苗低温锻炼对叶片细胞叶绿体结构的影响[J].园艺学报，1995（3）：299-300.
[12] 樊怀福，蒋卫杰，郭世荣.低温对番茄幼苗植株生长和叶片光合作用的影响[J].江苏农业科学，2005（3）：89-91.
[13] 林善枝，李雪平，张志毅.在低温诱导毛白杨抗冻性中CaM含量和G6PDHase及ATPase活性的变化[J].北京林业大学学报，2001，23（5）：4-9.
[14] 简令成.植物抗寒机理研究的新进展[J].植物学通报，1992（3）：17-22.
[15] 何若韫.植物低温逆境生理[M].北京：中国农业出版社，1995.
