病毒宏基因组学在动物病毒研究中的应用及研究进展

    廖勤丰　李文娟　向帮全

    摘要：近年来，新发人畜共患病呈现逐年递增的趋势，人类想要征服新发人畜共患病，就必须提前发掘潜在的新的致病性病原，并针对新病原进行基因组分析、流行病学调查、致病机制及疫苗开发等方面的研究。病毒宏基因组学是在宏基因组学基础上发展起来研究特定环境中病毒的新兴技术，该技术结合深度测序技术（第二代、第三代测序技术）已经在人类、动物、特定环境中挖掘出大量的新病毒，该技术不依赖于病毒培养及病毒序列，在国内外被广泛应用于新发人畜共患病病原的挖掘与临床诊断。就病毒宏基因组学在动物病毒研究中的应用及研究进展进行了介绍。

    关键词：病毒宏基因组学；动物病毒；应用；进展

    中图分类号：S852.65；Q78

    文献标识码：B

    文章编号：1007-273X（2014）04-0076-03

    病毒是引发人畜共患病的主要病原体之一，伴随环境、生态和人类行为等各方面因素的变化，新发人畜共患病也呈现逐年递增的趋势，它们极大地威胁着人类和动物的健康和生命，并给畜牧业和农业的健康发展以及自然界生态链的平衡带来危害及灾难。然而，许多新发人畜共患病的病原最初往往是未知的，如1986年的牛海绵状脑病[1]、1999年的尼帕病毒[2]、2003年的SARS冠状病毒[3]、1997至今不断变异的高致病性禽流感H5和H[4-7]7、2009年的甲型H1N[8]1、2010年的新型布尼亚病毒[9]，它们都经历了一个从未知到己知的探索过程。为此，及早地发现，鉴别未知的或新出现的病原，是有效预防和控制传染病的先决条件之一。传统的诊断技术已不能满足提前预警或快速诊断新发人畜共患病的需求。近年来，病毒宏基因组学[10，11]的出现和兴起，为人类诊断新发人畜共患病和探索潜在的病原提供了巨大的帮助。

    1病毒宏基因组学简介

    宏基因组学或元基因组（metagenomics），其定义为“The collective genomes of soil microflora”。该学科最早可追溯到1991年，Schmidt等[10]首次提出环境基因组学的概念，他们在对太平洋浮游生物进行系统分类时构建了第一个噬菌体文库，并发现了 15 种全新的细菌序列。1999年，宏基因组学概念是由Handelsman等[11]首次提出，他将“土壤中所有微生物基因组的总和”命名为土壤宏基因组，系统给出了宏基因组的概念，提出针对特定环境样品中遗传物质总和进行非培养研究。2005年，Chen等[12]对宏基因组进一步概括为“应用现代的分子生物学技术直接从环境中获取的目的微生物群落基因组，叫宏基因组”。

    病毒宏基因组学（Viral metagenomics）是宏基因组学的一个分支，指研究特定环境中的病毒群落的一门技术。近年来随着新测序技术的不断发展，尤其是第二代、第三代测序仪的出现，使病毒宏基因组学发展尤为迅速。2002年，Brcitbart等[13]用鸟枪测序法（Shotgun sequencing）首次对海洋中病毒群体进行了研究，首次阐明海水中病毒群体以噬菌体为主，并且他是最早应用宏基因组学分析人粪便中不能培养的病毒群落，标志病毒宏基因组学的开端。2005年，Edwards等[14]首次提出病毒宏基因组学这一概念，其描述的是环境中的病毒群落—噬菌体。2007 年，Delwart[15]再次提到病毒宏基因组学这一概念，并对宏基因组学挖掘新病毒的方法进行了阐述，侧重于人和动物机体中的真核病毒群落。

    2病毒宏基因组学的应用

    病毒宏基因组学已经应用到人类、动物和环境中，涉及到农业、工业及畜牧业等各个领域，其应用范围已延伸到海洋、湖水、热泉、下水道等无机环境，以及组织病料、血液、呼吸道、动物排泄物等有机环境[16]。2009年，Fan等[17]应用病毒宏基因组学的方法研究佛罗里达绿海龟的纤维状乳头瘤组织中发现了新型单链DNA病毒（Sea turtle tornovirus 1，STTV1）。2009年，Djikeng等[18]系统分析了来自马里兰淡水湖中的RNA 病毒宏基因组，结果获得淡水湖中30多个RNA病毒家族序列，其中包含小RNA病毒、小双股病毒及正黏病毒等。2009年，Willner等[19]研究了健康和呼吸道感染的人的呼吸道分泌物中的 DNA病毒群落。发现肺囊性纤维化病人的病毒群体包括疱疹病毒和反转录病毒等，而健康人的病毒群落呈现出明显的多样性。2010年，Day等[20]应用病毒宏基因组学分析患有肠道病毒性肠炎的火鸡群，结果显示火鸡肠道内含有呼肠孤病毒、小RNA病毒及星状病毒等。Shan等[21]对中国17份猪粪便研究也获得了猪肠道病毒组的构成，包括肠道病毒、博卡病毒和星状病毒等。蝙蝠作为很多人兽共患病（例如埃博拉病毒、严重急性呼吸系统综合征（SARS）病毒和尼帕病毒）的自然传播宿主，故蝙蝠体内的病毒多样性成为学者研究的热点。2010年，Li等[22]和Donaldson等[23]应用病毒宏基因组学的方法分别研究了北美蝙蝠粪便中的病毒群落。发现了大量新的哺乳动物病毒和昆虫病毒及植物病毒，Donaldson还发现了一株新的冠状病毒。Ge等[24]和Wu等[25]也采用类似的技术对不同地方的蝙蝠进行研究，发现了一些蝙蝠圆环病毒、蝙蝠腺病毒、蝙蝠博卡病毒和蝙蝠乳头瘤病毒等病毒。2013年，杨凡力等[26]应用病毒宏基因组学的方法研究吉林、云南、湖南采集的蝙蝠组织，发现蝙蝠体内有细小病毒、博卡病毒、腺病毒、小双节 RNA 病毒、圆环病毒等新病毒。

    3病毒宏基因组学的研究策略

    病毒宏基因组学的研究过程主要包括以下3个步骤：样品的处理、病毒宏基因组学文库构建和数据分析与处理[27]。

    3.1样品制备

    样品的制备最关键的是样品的处理、遗传物质的分离和富集。样品的制备关键应做到提取能够代表该环境的高纯度样本，并除去非病毒核酸细胞和遗传物质的干扰。富集微生物及去除非目的性的细胞和遗传物质是分离高质量的遗传物质的前提，提取高纯度的代表特定环境中的遗传物质是宏基因组学研究过程中的最大难题。正切流过滤系统、差异过滤、梯度离心、空心纤维过滤、DNA酶和RNA酶处理、序列非依赖的单引物扩增（Sequence-independent single primer amplification，SISPA）等技术可用于样品的制备，而SYBR金染色法可用于实时监测处理样品中病毒颗粒的数量。1990年，Giovannoni等[28]利用正切流过滤系统（Tangential flow filtration）筛选海洋浮游生物；1991年，Schmidt等[10]利用正切流过滤系统分析了海洋浮游生物的微生物群落中的遗传物质；2001年，Allander等[29]用DNA酶去除牛血清中病毒壳粒外的DNA，通过SISPA法发现2个新的牛细小病毒。2002年，Breitbart等[13]通过差异过滤和梯度离心的方法富集海洋中的DNA病毒—噬菌体。2005年，Zhang等[30]用DNA酶和RNA酶去除人肠道过滤后的悬液中的非病毒壳粒包被的遗传物质，应用SISPA扩增和鸟枪法测序发现了大量的植物病毒。

    3.2病毒宏基因组学文库构建

    目前，构建的病毒宏基因组学文库主要有载体克隆文库和基于高通量测序技术的加接头的文库。随着深度测序技术的不断发展，第二代高通量测序技术、第三代单分子测序技术已经广泛地应用于各项研究领域中，以454测序技术和Illumina测序技术为代表的二代测序法得到迅速推广用于构建病毒宏基因组文库，相信将来第三代测序平台如tSMSTM（true single molecular sequeneing）技术平台、SMRT（single molecule real-time）技术平台、FRET测序技术及纳米孔单分子技术为代表的第三代测序法也将应用于构建病毒宏基因组文库。Donaldson等[23]采用高通量测序技术构建了蝙蝠肠道的病毒宏基因组学文库，获得了600 000条读长（Reads）的核酸序列。杨凡力等[26]通过基于 Solexa 高通量测序的病毒宏基因组学技术，获得了11 644 232条读长（Reads）蝙蝠组织的病毒宏基因组学文库，并拼接出44 872条重叠序列。

    3.3数据分析与处理

    病毒宏基因组学文库中包含兆级的短序列片段（Reads）。通过不同的序列拼接软件将Reads拼接较长的DNA序列片断（Contigs）。数据组装可通过K-mer分析评估各个样品的测序深度，通过对SOAPdenovo设置不同K值，筛选最佳组装结果，对最优组装结果进行校正，并统计Reads利用率。接着利用已测序生物体的DNA序列构建数据库，将拼接后的Contigs通过不同的鉴定方案，与数据库里的DNA序列信息进行比对，确定该序列来自的生物群落，筛选有用的基因信息。此外，还可以用一些工具对序列进行基因预测（如Metagene、GeneMark、FragGeneScan等）。

    4小结

    我国养殖业面临着老病仍在流行、新病不断出现的复杂局面。目前还存在着很多人类尚未认知或新出现的动物病毒，最近Anthony等[31]研究人员估计，仅在哺乳动物中就可能潜伏着超过32万种未知的病毒。如果其中的一种感染给人类，则有可能引发下一场流行病大暴发。鉴别出动物体内的所有未知病毒将对科学家和流行病学家产生巨大帮助。一旦一种动物病毒开始在人类中传播，研究人员便能够用新的序列迅速确定其源头。面对新发人畜共患病，目前人类还没有特殊的预防和治疗措施。因此，人类想要征服新发人畜共患病，只有提前发掘潜在的新的致病性病原，并针对新病原进行基因组分析、流行病学调查、疫苗和治疗抗体的开发等方面的研究。病毒宏基因组学是在宏基因组学基础上发展起来研究特定环境中病毒的新兴技术，该技术结合深度测序技术（第二代、第三代测序技术）已经在人类、动物、特定环境中挖掘出大量的新病毒，该技术不依赖于病毒培养及病毒序列，在国内外被广泛应用于新发人畜共患病病原的挖掘与临床诊断。总之，随着病毒宏基因组学与各种新的分子生物学技术及深度测序技术的结合，该技术展现了区别于传统病毒诊断技术的优势，而该技术对动物病毒的挖掘及其他领域的应用将更加广泛。

    参考文献：

    [1] STEKEL D J，NOWAK M A，SOUTHWOOD T R E，et al.Prediction of future BSE spread[J].Nature，1996，381： 119.

    [2] KRUSE H，kIRKEMO A M，HANDELAND K，et al.Wildlife as source of zoonotic infeetions [J].Emerg Infeet Dis，2004，10（12）： 2067-2072.

    [3] GUAN Y，ZHENG B J，HE Y Q，et al.Isolation and characterization of viruses related to the SARS coronavirus from animals in southern China [J].Science，2003，302（5643）： 276-278.

    [4] YUEN K Y，CHAN P K，PEIRIS M，et al.Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus[J].Lancet，1998，351：467-471.

    [5] GAO R，CAO B，HU Y，et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A （H7N9） virus[J].N Engl J Med，2013，368：1888-1897.

    [6] ZHU Q Y，QIN E D，WANG W，et al.Fatal infection with influenza A （H5N1） virus in China[J].N Engl J Med，2006，354（25）： 2731-2732.

    [7] LIU J，XIAO H，LEI F，et al.Highly pathogenic H5N1 influenza virus infeetion in migratory birds[J].Seienee，2005，309（5738）： 1206.

    [8]CAO B，LI X W，MAO Y，et al.Clinical features of the initial cases of 2009 pandemic influenza A （H1N1） virus infection in China[J].N Engl J Med，2009，361（26）： 2507-2517.

    [9] YU X J，LIANG M F，ZHANG S Y，et al.Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China[J].N Engl J Med，2011，364： 1523-1532

    [10] SCHMIDT T M，DELONG E F，PACE N R.Analysis of a marine picoplankton community By 16S rRNA gene cloning and sequencing[J].Journal of Bacteriology，1991，173（14）：4371-4378.

    [11] HANDELSMAN J，RONDON M R，BRADY S F，et al.Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes： a new frontier for natural products[J].Chem Biol，1998，5（10）： 245-249.

    [12] CHEN K，PACHTER L.Bioinformatics for whole-genome shotgun sequencing of microbial communities[J].PLoS Comput Biol，2005，1（2）：106-112.

    [13] BREITBART M，SALAMON P，ANDRESEN B，et al.Genomic analysis of uncultured marine viral communities[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（22）： 14250-14255.

    [14] EDWARDS R A，ROHWER F.Viral metagenomics[J].Nat Rev Microbiol，2005，3（6）：504-510.

    [15] DELWART E L.Viral metagenomics[J].Rev Med Virol，2007，17（2）：115-131.

    [16]何彪，涂长春.病毒宏基因组学的研究现状及应用[J].畜牧兽医学报，2012，43（12）：1865-1870.

    [17] FAN T F，MANIRE C，BORROWMAN K，et al.Discovery of a novel single-stranded DNA virus from a sea turtle fibropapilloma by using viral metagenomics[J].J Virol，2009，83（6）：2500-2509.

    [18] DJIKENG A，KUZMICKAS R，ANDERSON N G，et al.Metagenomic analysis of RNA viruses in a fresh water lake[J].PLoS One，2009，4（9）：e7264.

    [19] WILLNER D，FURLAN M，HAYNES M，et al.Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in cystic fibrosis and non-cystic fibrosis individuals[J].PLoS One，2009，4（10）： e7370.

    [20] DAY J M，BALLARD L L，DUKE M V，et al.Metagenomic analysis of the turkey gut RNA virus community[J].Virol J，2010，7： 313.

    [21] SHAN T，LAN D，LI L，et al.Genomic character ization and hign prevalence of bocavirus in swine[J].PLoS One，2011，6： e17292.

    [22] LI L，VICTORIA J G，WANG C，et al.Bat guano virome： predominance of dietary viruses from insects and plants plus novel mammalian viruses[J].J Virol，2010，84（14）：6955-6965.

    [23] DONALDSON E F，HASKEW A N，GATES J E，et al.Metagenomic analysis of the viromes of three North American bat species： viral diversity among different bat species that share a common habitat[J].J Virol，2010，84（24）： 13004-13018.

    [24] GE X，LI Y，YANG H，et al.Metagenomic analysis of viruses from the bat fecal samples reveals many novel viruses in insectivoous bats in the china[J].J virol，2012，86： 4620-4630.

    [25] WU Z X，REN L，YANG Y，et al.Virome analysis for identification of novel mammalian viruses in bat species from Chinese provinces[J].J Virol，2012，86： 10999-11012.

    [26] 杨凡力，王意银，郑文成，等.中国部分地区蝙蝠携带病毒的宏基因组学分析[J].生物工程学报，2013，29（5）： 586-600.

    [27] 范胜涛，高玉伟，夏咸柱.病毒宏基因组学在医学领域的应用[J].中国生物制品学杂志，http：//www.cnki.net/kcms/detail/22.1197.Q.20131202.1511.001.html.

    [28] GIOVANNONI S，DELONG E，SCHMIDT T，et al.Tangential flow filtration and preliminary phylogenetic analysis of marine picoplankton[J].Applied and environmental microbiology，1990，56（8）： 2572-2575.

    [29] ALLANDER T，EMERSON S U，ENGLE R E et al.A virus discovery method incorporating DNase treatment and its application to the identification of two bovine parvovirus species[J].PNAS，2001，98（20）：11609-11614.

    [30] ZHANG T，BREITBART M，LEE W H，et al.RNA viral community in human feces：prevalence of plant pathogenic viruses[J].PLoS Biology，2005，4（1）：e3.

    [31] ANTHONY，EPSTEIN J H，KRIS A，et al.A strategy to estimate unknown viral diversity in mammals[J].mBio，2013，4（5）： 598-613.