猪流行性腹泻病原学特征及其诊断与防治
罗虎臣 陈清华
摘要：猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒感染的具有高传染性、高致病性和高死亡率的疾病，自出现至今对全球畜牧行业造成了巨大的损失，本文结合国内外最新研究进展，从流行性腹泻病毒的病原学特征和发病机制到疾病的诊断方法和预防免疫措施进行总结和综述，以期为有效的诊断和预防流行性腹泻病提供理论依据.
关键词：猪流行性腹泻;仔猪;诊断方法;防治方式。
猪流行性腹泻（ Porcineepidemic diarrhea，PED）是一种高度接触性肠道传染病.其病原为流行性腹泻病毒（Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV），临床症状主要表现为急性肠炎、腹泻、呕吐、脱水等。这种病毒发病力强，流行广，传染率高.对各个阶段的猪健康生产都存在巨大的威胁.免疫等机能未完善的仔猪更易于传染和发病，且死亡率高达100%，但死亡率也会随猪年龄增长而降低。流行性腹泻病最早于1971年发现.在1978年成功分离出病毒，命名为CV777。2001年首次完成了CV777病毒的全基因组测序.解析了PEDV的基因组结构。然而，虽然随着研究的开展，人们对PEDV的了解日益深入，但在1970至今.PEDV的疫情先后席卷了欧洲和亚洲甚至北美洲等众多国家，造成了庞大的经济损失。因此，本文总结了国内外对PEDV的病理学和生理学特征、发病机制、诊断方法以及可用于预防PEDV感染的控制措施作一综述.以期为养殖和生产中对于PED的应对提供理论基础和实证总结。
1.PEDV病原学特征和生物学性质
PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属的一种.病毒形态近似球形.但在粪中的病毒具有长且多形性的特点，直径在95～190nm之间，均值130nm.外覆囊膜，且囊膜上具有花瓣状纤突结构，这些纤突结构具有一定间隔，呈放射分布。病毒内核酸属线性单股正链RNA，具有侵染能力，基因组由27000～33000个核苷酸组成.相对分子量在6—8x106，其基因组大小为28kb，包含S、N、P、M四大主要结构基因，以及ORF3附属基因。在猪体内PEDV中幾大结构基因的表达都保持在较高水平.因此，S、N、M、ORF3编码的蛋白常作为PEDV的诊断和变异检测的重要依据。PEDV对外界抵抗能力较弱，很容易被醚或氯仿灭活，同时，对高温的耐受性不强.在4～500C的温度范围内.其活性相对稳定。在4℃下，pH3—10范围的细胞培养基中孵育6小时后.PEDV表现出低至中等的残留感染性，而在37。C下6小时，其仅可在pH5～8.5之间的范围保持其感染性。在小于4和大于9时完全失活。这些数据结果表明，如果PEDV在超过370C的较高温度环境下暴露一段时间，使用酸性或碱性消毒剂可将其灭活。研究发现.PEDV只能在肠上皮组织的培养物内增殖.传统犊牛血清培养基会抑制PEDV与红细胞中受体的结合，故而，细胞培养方式难以成功。但也有学者发现其生长与培养液中的胰蛋白酶有紧密的联系。
2.PED的发病机制
PED发病机制主要是通过口鼻途径进入机体.猪小肠绒毛状肠细胞表达大量的氨肽酶N （APN），是一种被鉴定为PEDV的细胞受体的糖基化跨膜蛋白。肠细胞上的高密度受体允许PEDV通过病毒一受体相互作用侵入细胞和进行复制，故而.PEDV可通过此方式侵入小肠。进入小肠后.通过小肠绒毛细胞内的内质网膜出芽增殖.在此过程中造成宿主细胞器破坏，线粒体肿胀等情况，最终导致肠绒毛上皮吸收细胞减少.营养物质吸收障碍.出现非绒毛萎缩式腹泻的情况。PEDV是细胞溶解性的.被感染的肠细胞会迅速急性坏死，导致小肠中的绒毛显著萎缩.绒毛高度与隐窝深度的比值从7：1缩减至3：l，小肠吸收面积显著减少，营养物质吸收出现严重障碍。另一方面，肠道内ATP酶活性降低.肠上皮的钠泵失活.肠内渗透压升高，出现渗透性腹泻，同时，肠道黏膜上皮细胞中的各类消化酶活性和数量显著降低.肠道内营养物质的消化和分解受到限制.营养物质发酵.刺激肠道蠕动，加重腹泻症状。
3.PED的诊断
PEDV在临床、病理变化和流行病学等方面，与猪传染性胃肠炎非常相似.因此需要准确方便的手段对疾病进行诊断，才能快速的做出应对和治疗方案，减少经济损失。
3.1 病原学检测
病原学检测方法中最直接的方法是通过电镜下观察病毒粒子的形态特征来判断其感染情况，但PEDV作为冠状病毒的一种，在形态学中难以与猪传染性胃肠炎病毒区别，所以此法不能作为诊断PED的唯一标准。
病毒分离培养方法通过使用疑似感染的PEDV的病料处理后接种Vero细胞.通过观察病变情况来判断是否为PEDV病毒感染.PEDV感染后两天表现为细胞表面粗糙，颗粒增多，细胞出现空斑和脱落等特征.即可初步感染.后续通过结合其他检测手段使结果更加准确。但此法检测周期长，工序繁琐，难以迅速便捷的诊断出PEDV的病情。
3.2 免疫学检测
血清中和试验法操作便捷，易于判定，因此适合较大数量的样品检测.也是PEDV早期的检测方法.其原理通过在血清中检测PEDV抗体的方式鉴定其感染情况，但由于猪肠道中黏膜免疫的特异性.因此猪血清中出现的抗体不一定与对PEDV的防御有关.因此诊断时还需设计对照和回归分析，因此此法具有不确定性。
免疫荧光抗体检测技术针对血清中和法的不确定性.通过直接免疫荧光和间接免疫荧光两种方法，结合间接血凝试验和电镜检测的方式，大大提高了检测方法的准确性和特异性.但由于检测周期较长等问题也影响其临床推广。
酶联免疫吸附法（ELISA）是检测病毒的标准方法，此法可通过试验直接检测出猪粪中的抗原。其主要方法有竞争阻断ELISA （ELISA-blocking）、斑点酶联免疫吸附试验（ Dot -ELISA）和快速ELISA等方法。ELISA-blocking优势在于可检测出存在一年以上的PEDV抗体.Dot-ELISA在敏感性和重复性上优于传统检测方法。
3.3 分子生物学技术
核酸探针杂交法是通过核酸探针直接检测细胞内是否存在相应的靶核酸序列.由于探针本身的优势可以保证组织和细胞本身的完整性.同时可以检测出病毒核酸的表达.同时通过对核酸的定位了解病毒的传播情況。但此法操作复杂，检测周期长，涉及较为高深的分子生物学技术.临床应用推广较为困难。
反转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）是病毒检测手段当中应用最普遍的一种方法，此法具有高灵敏度、特异性强、操作简便、检测周期短等优点。研究表明.根据PEDV的CV777毒株的M基因序列建立的RT-PCR检测方法，可检测到浓度为lOOpg/μL的PEDVRNA。
逆转录一环街道等温核酸扩增技术（RT-LAMP）是一种新型的快速检测PED的方式.目前已在胚胎性别、细菌和病毒的检测中有较为广泛的使用，相较于RT-PCR.本法检测周期更短、污染更小、特异性更高。经研究证实，RT-LAMP不仅能够在样品中检测到病毒.并且可以将PDEV与猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒等与其类似的病毒区分出来，敏感性很高。
套式RT-PCR是一种特异性高、敏感性高的诊断方法.研究表明.此法在RT-PCR的反应基础上建立起关于PEDV的检测方法.可以有效降低RT-PCR检测中的污染和假阳性情况.提高了检测的准确性。
实时荧光定量（real-time RT-PCR）是基于标准PCR基础上发展而来的检测方式，其最大的优势是不仅可以定性的诊断是否病毒感染.还可通过定量分析了解病料中病毒的丰度和感染程度。研究表明.建立的基于SYBR Green I的野毒株和弱毒株的ORF3基因核苷酸序列的实时荧光定量RT-PCR检测方法.此方法对于野毒株感染的PED和疫苗免疫效果的快速诊断具有很强的临床意义。
4.PED的预防
由于PED发病急、发病日龄小、致死率高的特征，因此无法有效的采取主动免疫的方式来进行预防.因此通过为母猪注射弱毒或灭活的疫苗，再通过乳汁的传递，将特异性的抗体传递给仔猪，达到免疫的效果。研究表明，哈药集团生物疫苗有限公司生产的PEDV和TGEV二联灭活疫苗主动免疫保护率可达96%.被动免疫保护率也达到了85%以上。也有学者在探索PEDV、TGEV和RV的三联灭活疫苗的应用效果.结果表明.在4个省9个猪场进行的45000头份的保护率超过95%，免疫效果明显。在使用疫苗时.可以在母猪分娩前20～30d通过肌肉或者后海穴注射灭活疫苗进行免疫，或者通过口服弱毒苗的方式为妊娠后期的母猪进行免疫程序.口服弱毒苗还可刺激黏膜和血清免疫抗体的产生，增强免疫效果。
在近年的研究中发现，除了使用弱毒苗和灭活苗免疫母猪外.还可通过将PEDV中的基因片段转入烟草中，通过基因表达的方式，将抗原的基因在烟草中表达，进而使用转基因烟草饲喂动物，具有激发动物全身和黏膜免疫的效果.也为PED的免疫方法提供了新的思路。也有研究表明，构建了含有PEDV的M、S、sM基因的重组病毒感染Vero细胞，再提取细胞上清液进行免疫.也可有效刺激黏膜免疫和体液免疫水平。葛俊伟等将PEDV的纤突蛋白Sl基因片段重组于干酪乳杆菌中.或者可表达并分泌PEDV Sl蛋白的乳杆菌，再口服方式接种小鼠.可显著提高小鼠的免疫水平.提高肠道内免疫球蛋白的含量。但这类方式通过口服免疫具有抗原基因表达的蛋白.可能会受到消化到内消化液等因素的影响，降低免疫效果，也有研究表明，可通过壳聚糖或类似物包被.使其克服消化生理的影响，提高利用率。
5.小结
PED作为一种危害性极强的疾病.对生猪养殖的影响十分深远，造成了巨大的经济损失。但是随着研究的不断深入.我们需要相信将会有更便捷和准确的诊断方法的提出和应用.和更低风险和更高效的疫苗的研制成功.甚至出现直接治愈流行性腹泻的药物.来减少和控制甚至消灭PED对畜牧行业的影响。
参考文献（略）
摘要：猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒感染的具有高传染性、高致病性和高死亡率的疾病，自出现至今对全球畜牧行业造成了巨大的损失，本文结合国内外最新研究进展，从流行性腹泻病毒的病原学特征和发病机制到疾病的诊断方法和预防免疫措施进行总结和综述，以期为有效的诊断和预防流行性腹泻病提供理论依据.
关键词：猪流行性腹泻;仔猪;诊断方法;防治方式。
猪流行性腹泻（ Porcineepidemic diarrhea，PED）是一种高度接触性肠道传染病.其病原为流行性腹泻病毒（Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV），临床症状主要表现为急性肠炎、腹泻、呕吐、脱水等。这种病毒发病力强，流行广，传染率高.对各个阶段的猪健康生产都存在巨大的威胁.免疫等机能未完善的仔猪更易于传染和发病，且死亡率高达100%，但死亡率也会随猪年龄增长而降低。流行性腹泻病最早于1971年发现.在1978年成功分离出病毒，命名为CV777。2001年首次完成了CV777病毒的全基因组测序.解析了PEDV的基因组结构。然而，虽然随着研究的开展，人们对PEDV的了解日益深入，但在1970至今.PEDV的疫情先后席卷了欧洲和亚洲甚至北美洲等众多国家，造成了庞大的经济损失。因此，本文总结了国内外对PEDV的病理学和生理学特征、发病机制、诊断方法以及可用于预防PEDV感染的控制措施作一综述.以期为养殖和生产中对于PED的应对提供理论基础和实证总结。
1.PEDV病原学特征和生物学性质
PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属的一种.病毒形态近似球形.但在粪中的病毒具有长且多形性的特点，直径在95～190nm之间，均值130nm.外覆囊膜，且囊膜上具有花瓣状纤突结构，这些纤突结构具有一定间隔，呈放射分布。病毒内核酸属线性单股正链RNA，具有侵染能力，基因组由27000～33000个核苷酸组成.相对分子量在6—8x106，其基因组大小为28kb，包含S、N、P、M四大主要结构基因，以及ORF3附属基因。在猪体内PEDV中幾大结构基因的表达都保持在较高水平.因此，S、N、M、ORF3编码的蛋白常作为PEDV的诊断和变异检测的重要依据。PEDV对外界抵抗能力较弱，很容易被醚或氯仿灭活，同时，对高温的耐受性不强.在4～500C的温度范围内.其活性相对稳定。在4℃下，pH3—10范围的细胞培养基中孵育6小时后.PEDV表现出低至中等的残留感染性，而在37。C下6小时，其仅可在pH5～8.5之间的范围保持其感染性。在小于4和大于9时完全失活。这些数据结果表明，如果PEDV在超过370C的较高温度环境下暴露一段时间，使用酸性或碱性消毒剂可将其灭活。研究发现.PEDV只能在肠上皮组织的培养物内增殖.传统犊牛血清培养基会抑制PEDV与红细胞中受体的结合，故而，细胞培养方式难以成功。但也有学者发现其生长与培养液中的胰蛋白酶有紧密的联系。
2.PED的发病机制
PED发病机制主要是通过口鼻途径进入机体.猪小肠绒毛状肠细胞表达大量的氨肽酶N （APN），是一种被鉴定为PEDV的细胞受体的糖基化跨膜蛋白。肠细胞上的高密度受体允许PEDV通过病毒一受体相互作用侵入细胞和进行复制，故而.PEDV可通过此方式侵入小肠。进入小肠后.通过小肠绒毛细胞内的内质网膜出芽增殖.在此过程中造成宿主细胞器破坏，线粒体肿胀等情况，最终导致肠绒毛上皮吸收细胞减少.营养物质吸收障碍.出现非绒毛萎缩式腹泻的情况。PEDV是细胞溶解性的.被感染的肠细胞会迅速急性坏死，导致小肠中的绒毛显著萎缩.绒毛高度与隐窝深度的比值从7：1缩减至3：l，小肠吸收面积显著减少，营养物质吸收出现严重障碍。另一方面，肠道内ATP酶活性降低.肠上皮的钠泵失活.肠内渗透压升高，出现渗透性腹泻，同时，肠道黏膜上皮细胞中的各类消化酶活性和数量显著降低.肠道内营养物质的消化和分解受到限制.营养物质发酵.刺激肠道蠕动，加重腹泻症状。
3.PED的诊断
PEDV在临床、病理变化和流行病学等方面，与猪传染性胃肠炎非常相似.因此需要准确方便的手段对疾病进行诊断，才能快速的做出应对和治疗方案，减少经济损失。
3.1 病原学检测
病原学检测方法中最直接的方法是通过电镜下观察病毒粒子的形态特征来判断其感染情况，但PEDV作为冠状病毒的一种，在形态学中难以与猪传染性胃肠炎病毒区别，所以此法不能作为诊断PED的唯一标准。
病毒分离培养方法通过使用疑似感染的PEDV的病料处理后接种Vero细胞.通过观察病变情况来判断是否为PEDV病毒感染.PEDV感染后两天表现为细胞表面粗糙，颗粒增多，细胞出现空斑和脱落等特征.即可初步感染.后续通过结合其他检测手段使结果更加准确。但此法检测周期长，工序繁琐，难以迅速便捷的诊断出PEDV的病情。
3.2 免疫学检测
血清中和试验法操作便捷，易于判定，因此适合较大数量的样品检测.也是PEDV早期的检测方法.其原理通过在血清中检测PEDV抗体的方式鉴定其感染情况，但由于猪肠道中黏膜免疫的特异性.因此猪血清中出现的抗体不一定与对PEDV的防御有关.因此诊断时还需设计对照和回归分析，因此此法具有不确定性。
免疫荧光抗体检测技术针对血清中和法的不确定性.通过直接免疫荧光和间接免疫荧光两种方法，结合间接血凝试验和电镜检测的方式，大大提高了检测方法的准确性和特异性.但由于检测周期较长等问题也影响其临床推广。
酶联免疫吸附法（ELISA）是检测病毒的标准方法，此法可通过试验直接检测出猪粪中的抗原。其主要方法有竞争阻断ELISA （ELISA-blocking）、斑点酶联免疫吸附试验（ Dot -ELISA）和快速ELISA等方法。ELISA-blocking优势在于可检测出存在一年以上的PEDV抗体.Dot-ELISA在敏感性和重复性上优于传统检测方法。
3.3 分子生物学技术
核酸探针杂交法是通过核酸探针直接检测细胞内是否存在相应的靶核酸序列.由于探针本身的优势可以保证组织和细胞本身的完整性.同时可以检测出病毒核酸的表达.同时通过对核酸的定位了解病毒的传播情況。但此法操作复杂，检测周期长，涉及较为高深的分子生物学技术.临床应用推广较为困难。
反转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）是病毒检测手段当中应用最普遍的一种方法，此法具有高灵敏度、特异性强、操作简便、检测周期短等优点。研究表明.根据PEDV的CV777毒株的M基因序列建立的RT-PCR检测方法，可检测到浓度为lOOpg/μL的PEDVRNA。
逆转录一环街道等温核酸扩增技术（RT-LAMP）是一种新型的快速检测PED的方式.目前已在胚胎性别、细菌和病毒的检测中有较为广泛的使用，相较于RT-PCR.本法检测周期更短、污染更小、特异性更高。经研究证实，RT-LAMP不仅能够在样品中检测到病毒.并且可以将PDEV与猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒等与其类似的病毒区分出来，敏感性很高。
套式RT-PCR是一种特异性高、敏感性高的诊断方法.研究表明.此法在RT-PCR的反应基础上建立起关于PEDV的检测方法.可以有效降低RT-PCR检测中的污染和假阳性情况.提高了检测的准确性。
实时荧光定量（real-time RT-PCR）是基于标准PCR基础上发展而来的检测方式，其最大的优势是不仅可以定性的诊断是否病毒感染.还可通过定量分析了解病料中病毒的丰度和感染程度。研究表明.建立的基于SYBR Green I的野毒株和弱毒株的ORF3基因核苷酸序列的实时荧光定量RT-PCR检测方法.此方法对于野毒株感染的PED和疫苗免疫效果的快速诊断具有很强的临床意义。
4.PED的预防
由于PED发病急、发病日龄小、致死率高的特征，因此无法有效的采取主动免疫的方式来进行预防.因此通过为母猪注射弱毒或灭活的疫苗，再通过乳汁的传递，将特异性的抗体传递给仔猪，达到免疫的效果。研究表明，哈药集团生物疫苗有限公司生产的PEDV和TGEV二联灭活疫苗主动免疫保护率可达96%.被动免疫保护率也达到了85%以上。也有学者在探索PEDV、TGEV和RV的三联灭活疫苗的应用效果.结果表明.在4个省9个猪场进行的45000头份的保护率超过95%，免疫效果明显。在使用疫苗时.可以在母猪分娩前20～30d通过肌肉或者后海穴注射灭活疫苗进行免疫，或者通过口服弱毒苗的方式为妊娠后期的母猪进行免疫程序.口服弱毒苗还可刺激黏膜和血清免疫抗体的产生，增强免疫效果。
在近年的研究中发现，除了使用弱毒苗和灭活苗免疫母猪外.还可通过将PEDV中的基因片段转入烟草中，通过基因表达的方式，将抗原的基因在烟草中表达，进而使用转基因烟草饲喂动物，具有激发动物全身和黏膜免疫的效果.也为PED的免疫方法提供了新的思路。也有研究表明，构建了含有PEDV的M、S、sM基因的重组病毒感染Vero细胞，再提取细胞上清液进行免疫.也可有效刺激黏膜免疫和体液免疫水平。葛俊伟等将PEDV的纤突蛋白Sl基因片段重组于干酪乳杆菌中.或者可表达并分泌PEDV Sl蛋白的乳杆菌，再口服方式接种小鼠.可显著提高小鼠的免疫水平.提高肠道内免疫球蛋白的含量。但这类方式通过口服免疫具有抗原基因表达的蛋白.可能会受到消化到内消化液等因素的影响，降低免疫效果，也有研究表明，可通过壳聚糖或类似物包被.使其克服消化生理的影响，提高利用率。
5.小结
PED作为一种危害性极强的疾病.对生猪养殖的影响十分深远，造成了巨大的经济损失。但是随着研究的不断深入.我们需要相信将会有更便捷和准确的诊断方法的提出和应用.和更低风险和更高效的疫苗的研制成功.甚至出现直接治愈流行性腹泻的药物.来减少和控制甚至消灭PED对畜牧行业的影响。
参考文献（略）
