HPLC—MS—MS测定水产品中的甲基睾丸酮残留量
马瑞欣+苏欢欢+梁艳红+孙伟彬+郝新丽+张勇
摘 要：在研究基质效应的基础上，建立了乙酸乙酯提取，石油醚净化，氘代甲基睾丸酮为内标，甲醇和5 mmol/L乙酸铵（含0.15%甲酸）为流动相，梯度洗脱，高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS-MS）测定水产品中甲基睾丸酮残留量的方法。在2.0～500 ng/mL浓度范围内，线性良好，R2≥0.999；定量限为5.0 μg/Kg。空白样品添加标准物质后的回收率在75%～105%之间，相对标准偏差≤10%。该方法前处理简单，可适用于批量水产品中甲基睾丸酮残留量的快速定性定量检测。
关键词：高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS-MS）；水产品；甲基睾丸酮；内标法
17-α-甲基睾丸酮（17-αlpha-methyltestosterone）是一种人工合成的雄性激素，水产养殖中使用可提高产量，但在水产动物体内代谢缓慢，其残留会对人体造成危害。欧盟国家禁止在食品动物中使用甲基睾丸酮及其化合物，我国已经把甲基睾丸酮列入食品动物禁用的兽药清单[1]。
检测水产品中甲基睾丸酮残留量的方法有高效液相色谱法[2]和液质联用法[3-5]。液相色谱法[2]仍是目前农业部下达水产品抽查任务中的唯一方法，但其存在两个问题：一是样品基线干扰大，难以达到10 μg/kg的检测限，且容易出现假阳性[6]，造成定性和定量的不准确；二是采用乙醚提取，乙醚挥发性很强，易被氧化成过氧化物，过氧化物不稳定，加热易爆炸，给实验操作人员带来一定的安全隐患。虽然有文献对液相色谱法进行了改进[7-8]，但效果仍不理想。液相色谱-串联质谱法的测定方法[3-5]前处理需固相萃取净化，操作步骤太过繁琐，不适用于实验室批量检测任务。
本文在考虑基质效应的基础上，建立了以氘代甲基睾丸酮（methyltestosterone-D3）为内标，高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中甲基睾丸酮残留量的方法。该方法前处理简单，回收率高，实用性强，可适用于批量水产品中甲基睾丸酮残留量的快速定性定量检测。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与设备
高效液相色谱-串联质谱联用仪（Thermofisher，ACCLE-TSQ QUANTUMN ACCESS MAX）；MS3数显型振荡器（广州仪科实验室技术有限公司）；离心机（湖南湘仪，TDZ5-WS）；旋转蒸发仪（英国，Bibby，RE300），高速离心机（上海安亭，TGL-16C）；十万分之一电子天平（德国赛多利斯）；超纯水仪（milipore）。
1.2 主要试剂与材料
17-α-甲基睾丸酮（DR，纯度98%）；氘代甲基睾丸酮（WITEGA，纯度99.5%）；乙酸乙酯（色谱纯，B&J）；甲醇（色谱纯，fisher）；甲酸（色谱纯，DIKMA）；石油醚（色谱纯，天津光复）；乙酸铵（色谱纯，美国fisher）。实验所用水为超纯水。
甲醇溶液：取80 mL甲醇加入20 mL水。
2 实验方法
2.1 标准溶液的配制
2.1.1 17-α-甲基睾酮储备液 准确称取10.2 mg甲基睾丸酮（纯度98%）标准物质，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的标准物质储备液，棕色瓶中-18 ℃保存。
2.1.2 氘代甲基睾酮储备液 准确称取5.0 mg甲基睾丸酮标准物质，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成100 μg/mL的标准物质储备液，棕色瓶中-18 ℃保存。
2.1.3 标准系列的配制 取甲基睾酮储备液和氘代甲基睾酮储备液分别用甲醇稀释成1.0 μg/mL的溶液，取此溶液用甲醇溶液稀释成2.0、5.0、10、20、50、100、500 ng/mL的标准系列，内标浓度为100 ng/mL。
2.2 样品提取
在50 mL离心试管中称取样品5.00g，加入1.0 μg/mL的内标溶液200 μL，涡旋混匀30 s，放置30 min后，加入20 mL乙酸乙酯，3 000 r/min涡旋振荡2 min，4 000 r/min离心3 min，把乙酸乙酯层移入100 mL鸡心瓶中。在离心试管中再加入20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯，40 ℃旋转蒸发至干。在鸡心瓶中加入2 mL甲醇溶液涡旋振荡1 min，加入2 mL石油醚，涡旋混合30 s，静止分层，弃去上层石油醚，再加入2 mL石油醚，涡旋混合30 s，取下层溶液10 000 r/min离心5 min，过0.2 m滤膜后高效液相色谱-串联质谱联用仪分析。
2.3 仪器条件
2.3.1 色谱条件 色谱柱：hypersil gold 50×2.1，1.9 μm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流动相A： 5 mmol/L乙酸铵（含0.15%甲酸）；流动相B：甲醇；流速：250 μL/min；梯度洗脱如表1。
2.3.2 质谱条件
离子化模式：电喷雾正离子模式（ESI+），选择反应监测（SRM）；喷雾电压（spray voltage）3 000V；蒸汽温度（vaperizer temperature）300 ℃；离子传输毛细管温度（capillary temperature）270 ℃；鞘气（sheath gas pressure）40；辅气（Aux gas pressure）10。
选择反应监测母离子、子离子和碰撞能见表2。
2.3.3 结果计算 测定结果由仪器工作站按照内标法自动计算。样品中甲基睾丸酮的量按式（1）计算。
3 实验结果
3.1 定性分析
甲基睾丸酮的定量离子为97.200，定性离子为109.48，其丰度之比在100%±20%之间，则定为阳性。标准溶液离子质量色谱图见图1。
图1 标准溶液（50 ng/mL）特征离子质量色谱图
3.2 定量分析
图2 工作曲线3.2.1 线性范围 在2.0～500 ng/mL浓度范围内，线性良好，R2≥0.999，见图2。
3.2.2 灵敏度 实验表明，甲基睾丸酮的检测限为1.0 μg/kg；定量限为5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行样品的RSD≤15%。
3.2.3 准确度和精密度 分别向对虾和罗非鱼的空白样品中添加17-α-甲基睾丸酮标准物质，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每个添加水平做平行样品6个，按上述方法检测，检测结果平均回收率在77.10%～102.19%之间，相对标准偏差≤10%，详见表3。空白样品和添加标准物质的样品谱图见图3。
4 讨论
4.1 提取溶剂的选择
实验选取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分别作为提取溶剂，并分别用甲醇溶液配制标准溶液和用空白样品提取液配制基质标准溶液来评定基质效应和提取回收率[9-10]，基质为罗非鱼，见表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睾丸酮标准溶液，set2： 罗非鱼空白样品提取后添加17-α-甲基睾丸酮标准溶液，set3： 罗非鱼空白样品添加17-α-甲基睾丸酮标准溶液后进行提取，基质效应为ME=set2/set1，提取回收率为RE=set3/set2。ME 值越小，表明基质效应越严重；RE值越大，表明所用溶剂的提取回收率越高。由表4可知：四种提取剂中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基质效应小；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此选择乙酸乙酯作为提取溶剂。实验表明，乙酸乙酯提取后的样品溶液在目标化合物周围无干扰物质存在。
4.2 净化溶剂的选择
实验发现：用空白样品提取液配制的标准溶液（基质标准溶液）经正己烷萃取后，甲基睾丸酮的定量离子峰面积是萃取前的30%左右，见表5。而石油醚萃取后基质标准溶液的峰面积基本无变化。因此本实验利用石油醚进行除杂净化。
4.3 实验方法的确定
由于基质效应比较严重，本文采用内标法进行检测，甲醇和5 mmol/L乙酸铵（含0.15%甲酸）作为流动相，梯度洗脱，以降低基质效应的影响。
5 结论
在考察基质效应的基础上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚净化、内标法测定水产品中甲基睾丸酮残留量的高效液相色谱-串联质谱法。该方法前处理简单，准确度和精密度良好，检出限5.0 μg/kg，完全满足我国水产品中甲基睾丸酮10.0 μg/kg的检出要求，可适用于实验室中甲基睾丸酮的批量检测。
参考文献：
[1] 全国水产标准化技术委员会. NY 5071-2002 无公害食品 渔用药物使用准则[S].北京：中国标准出版社，2002
[2] 全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会. SC/T 3029-2006 水产品中甲基睾酮残留量的测定 液相色谱法[S]. 北京：中国农业出版社，2006
[3] 聂建荣，李大光，邓香连，等. LC-MS/MS法同时测定动物源性食品中甲基睾丸酮和己烯雌酚的 方法研究[J]. 中国兽药杂志，2009，43（4）：20-24
[4] 祝璟琳，杨弘，肖炜，等. 超高效液相色谱-串联质谱联用测定罗非鱼肌肉中甲基睾丸酮残留[J].食品科学，2011，32（22）：243-247
[5] 郑重莺，王扬，周凡，等. 高效液相色谱-串联质谱测定罗非鱼中甲基睾丸酮残留[J].中国渔业质量与标准，2013，3（3）：78-82
[6] 陈俊.高效液相色谱法检测水产品中甲基睾丸酮的假阳性分析[J].南方水产，2010，6（6）：74-76
[7] 秦振发，黎小正. 硅胶柱SPE-HPLC测定水产品中甲基睾酮的研究[J].食品科技，2009，34（10）：291-294
[8] 陈培基，李刘冬，邹琴，等.高效液相色谱法测定水产品中甲基睾丸酮残留量的优化研究[J].食品科学，2010，31（6）：223-226
[9] 赵建晖，唐庆强，吴文凡，等.固相萃取-超高效液相色谱-质谱联用法测定水产品中左氧氟沙星残留[J]. 福建分析测试，2011，20（5）：15-19
[10] 王立琦，曾振灵，束建花，等.液相色谱-电喷雾串联质谱测定猪组织中β-兴奋剂残留的基质效应[J].分析化学研究简报，2013，40（9）：1445-1449
图1 标准溶液（50 ng/mL）特征离子质量色谱图
3.2 定量分析
图2 工作曲线3.2.1 线性范围 在2.0～500 ng/mL浓度范围内，线性良好，R2≥0.999，见图2。
3.2.2 灵敏度 实验表明，甲基睾丸酮的检测限为1.0 μg/kg；定量限为5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行样品的RSD≤15%。
3.2.3 准确度和精密度 分别向对虾和罗非鱼的空白样品中添加17-α-甲基睾丸酮标准物质，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每个添加水平做平行样品6个，按上述方法检测，检测结果平均回收率在77.10%～102.19%之间，相对标准偏差≤10%，详见表3。空白样品和添加标准物质的样品谱图见图3。
4 讨论
4.1 提取溶剂的选择
实验选取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分别作为提取溶剂，并分别用甲醇溶液配制标准溶液和用空白样品提取液配制基质标准溶液来评定基质效应和提取回收率[9-10]，基质为罗非鱼，见表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睾丸酮标准溶液，set2： 罗非鱼空白样品提取后添加17-α-甲基睾丸酮标准溶液，set3： 罗非鱼空白样品添加17-α-甲基睾丸酮标准溶液后进行提取，基质效应为ME=set2/set1，提取回收率为RE=set3/set2。ME 值越小，表明基质效应越严重；RE值越大，表明所用溶剂的提取回收率越高。由表4可知：四种提取剂中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基质效应小；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此选择乙酸乙酯作为提取溶剂。实验表明，乙酸乙酯提取后的样品溶液在目标化合物周围无干扰物质存在。
4.2 净化溶剂的选择
实验发现：用空白样品提取液配制的标准溶液（基质标准溶液）经正己烷萃取后，甲基睾丸酮的定量离子峰面积是萃取前的30%左右，见表5。而石油醚萃取后基质标准溶液的峰面积基本无变化。因此本实验利用石油醚进行除杂净化。
4.3 实验方法的确定
由于基质效应比较严重，本文采用内标法进行检测，甲醇和5 mmol/L乙酸铵（含0.15%甲酸）作为流动相，梯度洗脱，以降低基质效应的影响。
5 结论
在考察基质效应的基础上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚净化、内标法测定水产品中甲基睾丸酮残留量的高效液相色谱-串联质谱法。该方法前处理简单，准确度和精密度良好，检出限5.0 μg/kg，完全满足我国水产品中甲基睾丸酮10.0 μg/kg的检出要求，可适用于实验室中甲基睾丸酮的批量检测。
参考文献：
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[9] 赵建晖，唐庆强，吴文凡，等.固相萃取-超高效液相色谱-质谱联用法测定水产品中左氧氟沙星残留[J]. 福建分析测试，2011，20（5）：15-19
[10] 王立琦，曾振灵，束建花，等.液相色谱-电喷雾串联质谱测定猪组织中β-兴奋剂残留的基质效应[J].分析化学研究简报，2013，40（9）：1445-1449
图1 标准溶液（50 ng/mL）特征离子质量色谱图
3.2 定量分析
图2 工作曲线3.2.1 线性范围 在2.0～500 ng/mL浓度范围内，线性良好，R2≥0.999，见图2。
3.2.2 灵敏度 实验表明，甲基睾丸酮的检测限为1.0 μg/kg；定量限为5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行样品的RSD≤15%。
3.2.3 准确度和精密度 分别向对虾和罗非鱼的空白样品中添加17-α-甲基睾丸酮标准物质，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每个添加水平做平行样品6个，按上述方法检测，检测结果平均回收率在77.10%～102.19%之间，相对标准偏差≤10%，详见表3。空白样品和添加标准物质的样品谱图见图3。
4 讨论
4.1 提取溶剂的选择
实验选取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分别作为提取溶剂，并分别用甲醇溶液配制标准溶液和用空白样品提取液配制基质标准溶液来评定基质效应和提取回收率[9-10]，基质为罗非鱼，见表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睾丸酮标准溶液，set2： 罗非鱼空白样品提取后添加17-α-甲基睾丸酮标准溶液，set3： 罗非鱼空白样品添加17-α-甲基睾丸酮标准溶液后进行提取，基质效应为ME=set2/set1，提取回收率为RE=set3/set2。ME 值越小，表明基质效应越严重；RE值越大，表明所用溶剂的提取回收率越高。由表4可知：四种提取剂中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基质效应小；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此选择乙酸乙酯作为提取溶剂。实验表明，乙酸乙酯提取后的样品溶液在目标化合物周围无干扰物质存在。
4.2 净化溶剂的选择
实验发现：用空白样品提取液配制的标准溶液（基质标准溶液）经正己烷萃取后，甲基睾丸酮的定量离子峰面积是萃取前的30%左右，见表5。而石油醚萃取后基质标准溶液的峰面积基本无变化。因此本实验利用石油醚进行除杂净化。
4.3 实验方法的确定
由于基质效应比较严重，本文采用内标法进行检测，甲醇和5 mmol/L乙酸铵（含0.15%甲酸）作为流动相，梯度洗脱，以降低基质效应的影响。
5 结论
在考察基质效应的基础上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚净化、内标法测定水产品中甲基睾丸酮残留量的高效液相色谱-串联质谱法。该方法前处理简单，准确度和精密度良好，检出限5.0 μg/kg，完全满足我国水产品中甲基睾丸酮10.0 μg/kg的检出要求，可适用于实验室中甲基睾丸酮的批量检测。
参考文献：
[1] 全国水产标准化技术委员会. NY 5071-2002 无公害食品 渔用药物使用准则[S].北京：中国标准出版社，2002
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[5] 郑重莺，王扬，周凡，等. 高效液相色谱-串联质谱测定罗非鱼中甲基睾丸酮残留[J].中国渔业质量与标准，2013，3（3）：78-82
[6] 陈俊.高效液相色谱法检测水产品中甲基睾丸酮的假阳性分析[J].南方水产，2010，6（6）：74-76
[7] 秦振发，黎小正. 硅胶柱SPE-HPLC测定水产品中甲基睾酮的研究[J].食品科技，2009，34（10）：291-294
[8] 陈培基，李刘冬，邹琴，等.高效液相色谱法测定水产品中甲基睾丸酮残留量的优化研究[J].食品科学，2010，31（6）：223-226
[9] 赵建晖，唐庆强，吴文凡，等.固相萃取-超高效液相色谱-质谱联用法测定水产品中左氧氟沙星残留[J]. 福建分析测试，2011，20（5）：15-19
[10] 王立琦，曾振灵，束建花，等.液相色谱-电喷雾串联质谱测定猪组织中β-兴奋剂残留的基质效应[J].分析化学研究简报，2013，40（9）：1445-1449
