对白木香种子黄酮类提取物体外抗氧化能力的研究
邵素珍
摘要：目的 分析体外条件下，白木香种子在抗氧化方面的能力。方法 对白木香的种子进行预处理，并从中提取出黄酮类成分，并采取铜离子还原法来对其抗氧化能力进行测定，并同抗坏血酸（即VC）来对照。测定后计算它的相对总清除率或还原百分率，将相对总清除率或者还原百分率作为纵坐标，将样品液浓度作为图的横坐标来作线性回归。并通过回归曲线置信限制，计算其半抑制浓度。结果 在本研究中所得到的数据，用SPSS 19.0统计学软件分析后，得出白木香种子黄酮类提取物对铜离子的还原力的IC50为0.09815 mg/mL。在该考察的总体范围当中，白木香种子在抗氧化能力方面尽管弱于VC的抗氧化能力，但其却随着浓度的升高而增强。结论 中药白木香种子具备较强抗氧化能力，可以给中药制剂以及保健品的进一步开发提供参考依据，其药用价值需更进一步的研究。
关键词：白木香种子;体外抗氧化;铜离子还原
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）08-0073-03
所谓白木香种子，即白木香之附属产物，其尽管具有很高的药用价值，不过其真正的资源却未能被人展开有效的开发和利用。随着人类各项组织损伤等疾病均同人体内部氧化反应有着很大的关联，所以，当下已然有越来越多的学者参与到对抗氧化药物的研究中来。不过，人们对于白木香种子体外抗氧化能力的研究却较为稀少，有限的研究也仅局限在DPPH法，从而极大的限制了人们对白木香种子抗氧化能力的了解和认识[1]。为了将白木香种子抗氧化的能力进行细致的分析，在本文中，笔者将使用对铜离子的还原能力测定这一体外抗氧化方法来对白木香种子的抗氧化能力及抗菌能力进行研究，以期对白木香种子的开发和利用带来一定的启发。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与试剂 白木香种子（茂名市君元沉香种植发展有限公司提供）;芦丁（rutin）标准品（北京化学试剂有限公司），邻苯三酚，FeSO·7H2O;新亚铜：天津市福晨化学试剂厂;盐酸，过氧化氢，无水乙醇，Tris，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，乙醚等试剂均为市售国产分析纯。
1.1.2 仪器 紫外分光光度计（UV-910O，北京瑞利公司），250 mL索氏提取器：郑州兴华玻璃仪器厂电子天平（sartorius BS 110S，北京赛多利斯仪器系统有限公司），电热恒温水浴锅（DK-98—1型，天津泰斯特仪器有限公司），高速万能粉碎机（Fw80型，天津泰斯特仪器有限公司）
1.2 方法
1.2.1 提取黄酮类成分 选取1000 g成熟饱满的白木香种子，并将其放于60度左右的干燥箱中，烘干4 h后，加以研磨至能过60目。称取200 g的白木香种子粉末，采用无水乙醚为抽提液，80摄氏度条件下，以索氏抽提法将其脱脂及除脂溶性色素。抽提液变为没有颜色时，将石油醚挥尽后在用正丁醇、乙酸乙酯溶液重复前过程。最后，使用体积分数为60%的乙醇浸提，并回流3次提取黄酮类成分[2]。所有浸提料液的比例为1∶5，每次浸提的时间为2 h，温度是100度，浸提6次至提取液没有颜色为止。将所得浸提液合并之后实施减压浓缩到恒温后获取浸膏。
1.2.2 黄酮类成分样品浓度测定。
1.2.2.1 绘制标准曲线 取芦丁标准品在120 ℃干燥至恒重后称取10 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到浓度是100 g/mL的芦丁溶液。然后将其用70%乙醇进一步稀释成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，各取1 mL于试管中，加70%乙醇1 mL，加NaNO2溶液（5%）0.3 mL，搖匀后静置10 min，然后加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，静置10 min，再加4%的NaOH溶液2 mL，摇匀后静置15 min后，510 nm波长处测定吸光度A。然后根据标准曲线的制作方法，以吸光值（A，510 nm）为纵坐标（y为吸光度），浓度（C，g/mL）为横坐标（x为白木香种子黄酮类化合物样品浓度（μg/mL），进行线性回归并求回归方程。
1.2.2.2 白木香种子黄酮类化合物样品含量的测定 分别吸取1 mL样品于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度。分别取1 mL稀释液于试管中，加70%乙醇1 mL，依次加入5% NaNO2 0.3 mL，混匀后静置6 min，加10%Al（NO3）3 0.3 mL，摇匀后静置6 min，加4%NaOH溶液2 mL，摇匀后静置10 min，同时以70%乙醇代替样品液配制空白试剂。510 nm波长处测定吸光度A。
1.2.3 配置抗氧化研究样品溶液 称取10 mg浸膏，将其置于无水乙醇中，配置出1 mg/mL浓度白木香种子的样品液。
1.2.4 测定还原能力 分别提取浓度不同的5 mL样品液，并加入7.5 mmol/L的新亚铜试剂及0.01 mmol/L的硫酸铜溶液各1.25 mL，将其混合后再添加ph值为7.0，浓度为0.2 mL每升的NH4Ac溶液，将三样液体混合至10 mL的体积，然后摇匀取1.0 mL。将该溶液摇匀后放置半个小时后，放置其在450 nm的波长中对其吸光度的数值进行测量[3]。在这段时间内，溶剂作为其空白对照，而VC作为其阳性对照。相对总还原的百分率等于A减去A0再除以Amax减去A0。其中，A0是该样品的浓度是0时的最大值，Amax是测量一次后所得吸光度值的最大数，而A则是该样品的A450nm数值。
1.3 观察指标和评价标准 在本次研究中，以氧化剂被阻碍至一半的时候，还原剂（抑制剂）的浓度作为其观察指标。按上文中所提计算方法展开计算，以相对总还原率作为其纵坐标，样品液浓度作横坐标。若一物质IC50低于10 mg/mL，则表示拥有抗氧化的能力[4].。
1.4 統计学方法 在本研究中所收获的实验数据，进行线性回归及统计分析（一致以SPSS 19.0计学软件及Microsoft Office2010）。通过可见-紫外分光光度计，将各样品浓度吸光值读取出来，测量数不可以低于3次，并取各次所得数据的平均值。通过上文的计算公式计算出相对总清除率和还原率。以相对总清除率（还原率）的百分率作为其纵坐标，以样品液浓度作为数据的横坐标并作线性回归，通过线性回归置信限制，将氧化剂被阻碍至一半时还原剂（抑制剂）的浓度数值计算出来[5]。
2 结果
2.1 样品浓度 根据实验而得到标准回归方程y=0.002627x-0.01309（r=0.9992）
测得白木香种子黄酮类提取物样品吸光度为y=180，由此可得其浓度为x=73.50μg/mL
2.2 对铜离子还原的能力 在浓度为0.02至0.12 mg/mL的范围之内，VC和白木香种子对铜离子还原的能力具有线性关系，通过对回归线的拟合得到氧化剂被阻碍至一半时还原剂（抑制剂）的浓度数值分别为0.01725 mg/mL以及0.09815 mg/mL。具体见图1及图2。
图1 白木香种子的铜离子还原能力
注：横坐标表示白木香种子的浓度（mg/mL），纵坐标表示相对总还原百分率。
图2 VC的铜离子的还原能力
注：横坐标表示VC浓度（mg/mL），纵坐标表示相对总还原百分率。
3 讨论
从结果上能够知道，在可以检测的范围之内，白木香种子在抗氧化方面是随着本身的浓度升高而增强的。从上述讨论得知，白木香种子对铜离子的还原能力的IC50为0.09775 mg/mL，VC对铜离子的还原能力的IC50分别为0.017 mg/mL，从中笔者可以看到，白木香种子相较于VC而言，其抗氧化的能力明显不如，而国内的学者认为，如果某一种药物的IC50值不高于10 mg/mL，则表示其具备抗氧化的能力[6]。因此笔者可以初步认为，白木香种子具有较为显著的抗氧化能力。据学者段周等在对白木香叶提取黄酮类化合物所实施的体外抗氧化能力的研究中，也较为明确的证明了该提取物的清除DPPH·能力[7]。而自由基其实是人类机体所维持生命各种活动的过程中所衍生出来的某一活性分子，如果人体内产生过多的自由基，便会致使组织器或者细胞产生损伤，进而引发各类型的疾病，从而加快人体的衰老速度。而抗氧化剂因为其自身的抗氧化能力，因此可以对自由基的生成产生一定程度的抑制作用，甚至可以将自由基彻底的清除。
所谓白木香，其实就是沉香这味药材的最重要来源之一。沉香，众所周知的珍贵药材。当前，尽管沉香已然在广东、海南等地开展了大规模的种植栽培，但我国的沉香需求也正在以一定速度的扩大，因此其往往供不应求。为了生态的平衡，寻找能有替代沉香的药物便显得极为重要[8]。而白木香种子因为其较高的产量以及很实惠的价格，因此，其可以说是代替沉香的首选。在本研究中，笔者通过铜离子还原法这一体外抗氧化方法对白木香种子的抗氧化能力进行了研究和测定，其结果表明，尽管白木香种子在还原铜离子的能力上较VC弱，可是随着白木香种子浓度的升高，其抗氧化能力也随之而升高，且其IC50值不高于10 mg/mL，具有较为显著的抗氧化能力。此可以说是对白木香种子以及精油关于抗氧化能力的探究带来的一定参考。
上述研究表明明，在抗氧化方面，白木香种子有着很高的能力，此外在笔者研究相关文献时也发现，白木香种子种含有各种营养成分以及挥发油。所以，对白木香种子的研究需要专业人士作进一步的药理学分析研究，以期给今后的开发和利用带来更为准确的实验依据。
参考文献：
[1]陈地灵，吴韦，林励，等.沉香茶提取物的体外抗氧化和体内降血脂作用评价[J].现代食品科技，2013，20（6）：1198-1202.
[2]路晶晶，戚进，朱丹妮，等.白木香叶中黄酮类成分结构与抗氧化功能的相关性研究[J].中国天然药物，2008，6（6）：456-460.
[3]林芳花，彭永宏，柯菲菲，等.沉香叶鞣质含量测定及抗氧化、延缓衰老作用的研究[J].广东药学院学报，2012，28（3）：259-262.
[4]吴惠妃，梅全喜，李庆国，等.白木香种子挥发油化学成分及抗氧化性研究[J].中药材，2013，36（9）：1463-1466.
[5]郑义，邵颖，陈安徽，等.益智仁总黄酮超声辅助提取工艺优化及其抗氧化性活性[J].食品科学，2014，35（6）：44-49.
[6]林芳花，彭永宏，江顺，等.香叶提取工艺及其抗氧化活性实验研究[J].中国野生植物资源，2011，30（4）：35-38.
[7]段宙位，李维国，窦志浩，等.沉香叶黄酮类化合物的提取及其抗氧化活性[J].食品科学，2015，36（6）：45-50.
[8]李薇，梅文莉，左文健，等.白木香的化学成分与生物活性研究进展[J].热带亚热带植物学报，2014，22（2）：201-212.
（收稿日期：2018-05-08）
摘要：目的 分析体外条件下，白木香种子在抗氧化方面的能力。方法 对白木香的种子进行预处理，并从中提取出黄酮类成分，并采取铜离子还原法来对其抗氧化能力进行测定，并同抗坏血酸（即VC）来对照。测定后计算它的相对总清除率或还原百分率，将相对总清除率或者还原百分率作为纵坐标，将样品液浓度作为图的横坐标来作线性回归。并通过回归曲线置信限制，计算其半抑制浓度。结果 在本研究中所得到的数据，用SPSS 19.0统计学软件分析后，得出白木香种子黄酮类提取物对铜离子的还原力的IC50为0.09815 mg/mL。在该考察的总体范围当中，白木香种子在抗氧化能力方面尽管弱于VC的抗氧化能力，但其却随着浓度的升高而增强。结论 中药白木香种子具备较强抗氧化能力，可以给中药制剂以及保健品的进一步开发提供参考依据，其药用价值需更进一步的研究。
关键词：白木香种子;体外抗氧化;铜离子还原
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）08-0073-03
所谓白木香种子，即白木香之附属产物，其尽管具有很高的药用价值，不过其真正的资源却未能被人展开有效的开发和利用。随着人类各项组织损伤等疾病均同人体内部氧化反应有着很大的关联，所以，当下已然有越来越多的学者参与到对抗氧化药物的研究中来。不过，人们对于白木香种子体外抗氧化能力的研究却较为稀少，有限的研究也仅局限在DPPH法，从而极大的限制了人们对白木香种子抗氧化能力的了解和认识[1]。为了将白木香种子抗氧化的能力进行细致的分析，在本文中，笔者将使用对铜离子的还原能力测定这一体外抗氧化方法来对白木香种子的抗氧化能力及抗菌能力进行研究，以期对白木香种子的开发和利用带来一定的启发。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与试剂 白木香种子（茂名市君元沉香种植发展有限公司提供）;芦丁（rutin）标准品（北京化学试剂有限公司），邻苯三酚，FeSO·7H2O;新亚铜：天津市福晨化学试剂厂;盐酸，过氧化氢，无水乙醇，Tris，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，乙醚等试剂均为市售国产分析纯。
1.1.2 仪器 紫外分光光度计（UV-910O，北京瑞利公司），250 mL索氏提取器：郑州兴华玻璃仪器厂电子天平（sartorius BS 110S，北京赛多利斯仪器系统有限公司），电热恒温水浴锅（DK-98—1型，天津泰斯特仪器有限公司），高速万能粉碎机（Fw80型，天津泰斯特仪器有限公司）
1.2 方法
1.2.1 提取黄酮类成分 选取1000 g成熟饱满的白木香种子，并将其放于60度左右的干燥箱中，烘干4 h后，加以研磨至能过60目。称取200 g的白木香种子粉末，采用无水乙醚为抽提液，80摄氏度条件下，以索氏抽提法将其脱脂及除脂溶性色素。抽提液变为没有颜色时，将石油醚挥尽后在用正丁醇、乙酸乙酯溶液重复前过程。最后，使用体积分数为60%的乙醇浸提，并回流3次提取黄酮类成分[2]。所有浸提料液的比例为1∶5，每次浸提的时间为2 h，温度是100度，浸提6次至提取液没有颜色为止。将所得浸提液合并之后实施减压浓缩到恒温后获取浸膏。
1.2.2 黄酮类成分样品浓度测定。
1.2.2.1 绘制标准曲线 取芦丁标准品在120 ℃干燥至恒重后称取10 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到浓度是100 g/mL的芦丁溶液。然后将其用70%乙醇进一步稀释成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，各取1 mL于试管中，加70%乙醇1 mL，加NaNO2溶液（5%）0.3 mL，搖匀后静置10 min，然后加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，静置10 min，再加4%的NaOH溶液2 mL，摇匀后静置15 min后，510 nm波长处测定吸光度A。然后根据标准曲线的制作方法，以吸光值（A，510 nm）为纵坐标（y为吸光度），浓度（C，g/mL）为横坐标（x为白木香种子黄酮类化合物样品浓度（μg/mL），进行线性回归并求回归方程。
1.2.2.2 白木香种子黄酮类化合物样品含量的测定 分别吸取1 mL样品于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度。分别取1 mL稀释液于试管中，加70%乙醇1 mL，依次加入5% NaNO2 0.3 mL，混匀后静置6 min，加10%Al（NO3）3 0.3 mL，摇匀后静置6 min，加4%NaOH溶液2 mL，摇匀后静置10 min，同时以70%乙醇代替样品液配制空白试剂。510 nm波长处测定吸光度A。
1.2.3 配置抗氧化研究样品溶液 称取10 mg浸膏，将其置于无水乙醇中，配置出1 mg/mL浓度白木香种子的样品液。
1.2.4 测定还原能力 分别提取浓度不同的5 mL样品液，并加入7.5 mmol/L的新亚铜试剂及0.01 mmol/L的硫酸铜溶液各1.25 mL，将其混合后再添加ph值为7.0，浓度为0.2 mL每升的NH4Ac溶液，将三样液体混合至10 mL的体积，然后摇匀取1.0 mL。将该溶液摇匀后放置半个小时后，放置其在450 nm的波长中对其吸光度的数值进行测量[3]。在这段时间内，溶剂作为其空白对照，而VC作为其阳性对照。相对总还原的百分率等于A减去A0再除以Amax减去A0。其中，A0是该样品的浓度是0时的最大值，Amax是测量一次后所得吸光度值的最大数，而A则是该样品的A450nm数值。
1.3 观察指标和评价标准 在本次研究中，以氧化剂被阻碍至一半的时候，还原剂（抑制剂）的浓度作为其观察指标。按上文中所提计算方法展开计算，以相对总还原率作为其纵坐标，样品液浓度作横坐标。若一物质IC50低于10 mg/mL，则表示拥有抗氧化的能力[4].。
1.4 統计学方法 在本研究中所收获的实验数据，进行线性回归及统计分析（一致以SPSS 19.0计学软件及Microsoft Office2010）。通过可见-紫外分光光度计，将各样品浓度吸光值读取出来，测量数不可以低于3次，并取各次所得数据的平均值。通过上文的计算公式计算出相对总清除率和还原率。以相对总清除率（还原率）的百分率作为其纵坐标，以样品液浓度作为数据的横坐标并作线性回归，通过线性回归置信限制，将氧化剂被阻碍至一半时还原剂（抑制剂）的浓度数值计算出来[5]。
2 结果
2.1 样品浓度 根据实验而得到标准回归方程y=0.002627x-0.01309（r=0.9992）
测得白木香种子黄酮类提取物样品吸光度为y=180，由此可得其浓度为x=73.50μg/mL
2.2 对铜离子还原的能力 在浓度为0.02至0.12 mg/mL的范围之内，VC和白木香种子对铜离子还原的能力具有线性关系，通过对回归线的拟合得到氧化剂被阻碍至一半时还原剂（抑制剂）的浓度数值分别为0.01725 mg/mL以及0.09815 mg/mL。具体见图1及图2。
图1 白木香种子的铜离子还原能力
注：横坐标表示白木香种子的浓度（mg/mL），纵坐标表示相对总还原百分率。
图2 VC的铜离子的还原能力
注：横坐标表示VC浓度（mg/mL），纵坐标表示相对总还原百分率。
3 讨论
从结果上能够知道，在可以检测的范围之内，白木香种子在抗氧化方面是随着本身的浓度升高而增强的。从上述讨论得知，白木香种子对铜离子的还原能力的IC50为0.09775 mg/mL，VC对铜离子的还原能力的IC50分别为0.017 mg/mL，从中笔者可以看到，白木香种子相较于VC而言，其抗氧化的能力明显不如，而国内的学者认为，如果某一种药物的IC50值不高于10 mg/mL，则表示其具备抗氧化的能力[6]。因此笔者可以初步认为，白木香种子具有较为显著的抗氧化能力。据学者段周等在对白木香叶提取黄酮类化合物所实施的体外抗氧化能力的研究中，也较为明确的证明了该提取物的清除DPPH·能力[7]。而自由基其实是人类机体所维持生命各种活动的过程中所衍生出来的某一活性分子，如果人体内产生过多的自由基，便会致使组织器或者细胞产生损伤，进而引发各类型的疾病，从而加快人体的衰老速度。而抗氧化剂因为其自身的抗氧化能力，因此可以对自由基的生成产生一定程度的抑制作用，甚至可以将自由基彻底的清除。
所谓白木香，其实就是沉香这味药材的最重要来源之一。沉香，众所周知的珍贵药材。当前，尽管沉香已然在广东、海南等地开展了大规模的种植栽培，但我国的沉香需求也正在以一定速度的扩大，因此其往往供不应求。为了生态的平衡，寻找能有替代沉香的药物便显得极为重要[8]。而白木香种子因为其较高的产量以及很实惠的价格，因此，其可以说是代替沉香的首选。在本研究中，笔者通过铜离子还原法这一体外抗氧化方法对白木香种子的抗氧化能力进行了研究和测定，其结果表明，尽管白木香种子在还原铜离子的能力上较VC弱，可是随着白木香种子浓度的升高，其抗氧化能力也随之而升高，且其IC50值不高于10 mg/mL，具有较为显著的抗氧化能力。此可以说是对白木香种子以及精油关于抗氧化能力的探究带来的一定参考。
上述研究表明明，在抗氧化方面，白木香种子有着很高的能力，此外在笔者研究相关文献时也发现，白木香种子种含有各种营养成分以及挥发油。所以，对白木香种子的研究需要专业人士作进一步的药理学分析研究，以期给今后的开发和利用带来更为准确的实验依据。
参考文献：
[1]陈地灵，吴韦，林励，等.沉香茶提取物的体外抗氧化和体内降血脂作用评价[J].现代食品科技，2013，20（6）：1198-1202.
[2]路晶晶，戚进，朱丹妮，等.白木香叶中黄酮类成分结构与抗氧化功能的相关性研究[J].中国天然药物，2008，6（6）：456-460.
[3]林芳花，彭永宏，柯菲菲，等.沉香叶鞣质含量测定及抗氧化、延缓衰老作用的研究[J].广东药学院学报，2012，28（3）：259-262.
[4]吴惠妃，梅全喜，李庆国，等.白木香种子挥发油化学成分及抗氧化性研究[J].中药材，2013，36（9）：1463-1466.
[5]郑义，邵颖，陈安徽，等.益智仁总黄酮超声辅助提取工艺优化及其抗氧化性活性[J].食品科学，2014，35（6）：44-49.
[6]林芳花，彭永宏，江顺，等.香叶提取工艺及其抗氧化活性实验研究[J].中国野生植物资源，2011，30（4）：35-38.
[7]段宙位，李维国，窦志浩，等.沉香叶黄酮类化合物的提取及其抗氧化活性[J].食品科学，2015，36（6）：45-50.
[8]李薇，梅文莉，左文健，等.白木香的化学成分与生物活性研究进展[J].热带亚热带植物学报，2014，22（2）：201-212.
（收稿日期：2018-05-08）
