利用模拟酶催化显色和等温核酸扩增反应检测特定序列DNA
汤薇等
摘要：基于血红素（Hemin）与G四联体（G4）所形成模拟酶的催化作用，结合等温指数扩增反应（IEXPAR），建立了特定序列DNA的显色检测方法。目标DNA引发IEXPAR，通过设计模板序列，IEXPAR产生大量富含鸟嘌呤的单链DNA，在K+存在时，该单链DNA可形成G4结构，G4可以与Hemin结合形成具有过氧化物酶活性的模拟酶（HeminG4），HeminG4催化H2O2氧化2，2联氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二铵盐 （ABTS），使体系颜色发生变化，反应产物最大吸收波长为421 nm。对显色反应体系中的实验参数进行了优化，包括Hemin浓度、ABTS浓度、H2O2浓度、IEXPAR时间和显色反应时间。在最佳条件下，所建立的体系可以简便、快速检测0.1～10 nmol/L的目标DNA分子，且本方法能够很好地区分单个碱基的差别，具有良好的特异性。
关键词：特定序列DNA的检测； 等温指数扩增（IEXPAR）； HeminG4模拟酶； 显色分析
1引言
核酸扩增是实现高灵敏度检测核酸的重要手段。目前常用的核酸扩增技术是聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction， PCR），但PCR需要精确的热循环和严格的反应条件。近年来，核酸的等温扩增技术得到了迅速发展[1]。等温指数扩增反应（Isothermal exponential amplification reaction，IEXPAR）是Galas等建立的一种新型的核酸扩增技术[2]。结合DNA聚合酶催化的延伸反应及切刻内切酶的剪切作用，IEXPAR可以在等温条件下，短时间内对目标核酸分子扩增106～109倍。该技术具有简便、快速的显著优点，其扩增倍数可与PCR媲美。目前IEXPAR已广泛用于特定序列DNA分析[3]、病毒基因鉴定[4，5]、microRNA测定[6，7]以及转录因子分析[8]。但基于IEXPAR的核酸分析多采用实时荧光检测方法，需要昂贵的实时荧光定量PCR等仪器。
在K+存在时，富含鸟嘌呤的单链DNA（G4DNA）通过分子内氢键的相互作用可折叠形成稳定的G四联体结构（G4）[9～11]，G4可与氯高铁血红素（Hemin）结合，形成具有过氧化物酶活性的模拟酶（HeminG4）[12]，HeminG4可以催化H2O2与2，2联氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二铵盐（ABTS）的氧化反应，使体系颜色发生变化，并在421 nm产生最大吸收。本研究通过设计IEXPAR反应模板，产生G4DNA，利用HeminG4模拟酶的催化作用，结合等温指数扩增反应，建立了一种廉价、简便的显色法检测特定序列DNA的新方法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
3结果与讨论
3.1等温指数扩增及显色法检测DNA的原理
等温指数扩增及显色法检测DNA的原理如图1所示，首先根据检测的TargetDNA及G4DNA 的序列设计扩增模板Template 1和Template 2。Template 1的3′端序列与TargetDNA序列互补，5′端序列与G4DNA序列互补，Template 2的3′端和5′端序列相同且与G4DNA完全互补。Template 1和Template 2中间都含有切刻内切酶Nt.BstNBI特异性识别序列；在DNA聚合酶和dNTPs存在时，TargetDNA与Template 1的3′端序列杂交， 并进行延伸反应， 形成含有Nt.BstNBI特异性识别序列的双链DNA，Nt.BstNBI将识别对应的双链序列，并从其后4个碱基处将DNA剪切，释放出G4DNA；切口处的DNA继续延伸并被剪切，释放出更多的G4DNA，形成线性放大的机制。另外，释放出的G4DNA与Template 2的3′端序列杂交，并在聚合酶作用下沿着Template 2延伸形成双链DNA，Nt.BstNBI识别其特异性序列并将延伸反应产生的DNA剪切，切口处DNA继续延伸、被剪切，这样不断进行剪切延伸剪切，形成指数扩增机制，产生大量G4DNA。在K+存在时，G4DNA形成G4结构，G4与Hemin结合形成具有过氧化物酶活性的模拟酶，该模拟酶可以催化ABTSH2O2体系发生氧化还原反应， 并伴随颜色变化， 反应产物最大吸收波长为421 nm。通过测定吸光度可灵敏地检测TargetDNA。
3.2实验条件优化
3.2.1Hemin浓度优化固定ABTS浓度为5.0 mmol/L，H2O2浓度为1.0 mmol/L，G4DNA为1 μmol/L，研究了不同浓度Hemin与G4DNA所形成的模拟酶对ABTSH2O2显色体系吸光度的影响，结果如图2所示。当Hemin浓度低于2.5 μmol/L时，体系的吸光度随着Hemin浓度升高快速增加；当Hemin浓度大于2.5 μmol/L时，吸光度随着Hemin浓度增加的趋势趋于平缓。同时，空白的吸光度随着Hemin浓度升高逐渐增加。当Hemin浓度等于2.5 μmol/L，G4DNA产生的吸光度与空白的差值达到最大值。本实验测定DNA时， Hemin浓度选择为2.5 μmol/L。
3.2.2ABTS浓度优化选择Hemin浓度为2.5 μmol/L，H2O2浓度为1.0 mmol/L，G4DNA为1 μmol/L，考察了ABTS浓度对模拟酶ABTSH2O2显色体系吸光度的影响。由图3可见，随着ABTS浓度增大，G4DNA所产生的吸光度呈逐渐增长趋势； ABTS浓度高于5 mmol/L， 吸光度增加趋于平缓，同时，由于ABTS在421 nm产生微弱的吸收，空白吸光度也随ABTS浓度的升高逐渐增加。综合考虑，本实验中ABTS最佳浓度选择5 mmol/L。
3.4检测方法的特异性评价
为了评价所建立方法对检测特定序列的TargetDNA的特异性，按照2.2.1节的方法，在相同条件下对10 pmol/L TargetDNA及分别含有1， 2和 3个突变碱基的Mutant DNA 1， Mutant DNA 2和Mutant DNA 3（序列见表1）同时进行测定，结果表明，Mutant DNA 1， Mutant DNA 2和Mutant DNA 3对检测10 pmol/L TargetDNA产生的干扰分别为6.3%， 1.3%和0.1%。表明本方法能够很好地识别TargetDNA中单个碱基差别，对特定序列的TargetDNA测定具有良好的特异性。
4结论
建立了一种利用显色法结合IEXPAR高灵敏、高特异性检测DNA的新方法。利用双扩增模板模型，通过设计Template 1的3′端序列实现不同特定序列核酸（包括DNA和RNA）的分析检测，同时Template 1的5′端序列和Template 2可以作为普遍适用的序列实现IEXPAR的显色检测；利用HeminG4模拟酶催化ABTSH2O2显色反应，只需简单的分光光度计进行检测，降低了检测的成本；本方法可以利用微孔板检测系统（如酶标仪）， 实现高通量的样品分析。
References
1Kim J， Easley C. J. Bioanalysis， 2011， 3（2）： 227-239
2van Ness J， van Ness L K， Galas D J. Proc. Natl. Acad. Sci.， 2003， 100（8）： 4504-4509
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4Tan E， Erwin B， Dames S， Voelkerding K， Niemz A. Clin. Chem.， 2007， 53： 2017-2020
5Tan E， Erwin B， Dames S， Ferguson T M， Buechel M， Voelkerding K， Niemz A. Biochem.， 2008， 47（38）： 9987-9999
6Jia H X， Li Z P， Liu C H， Cheng Y Q. Angew. Chem. Int. Ed.， 2010， 122： 5630-5633
7Zhang Y， Zhang C Y. Anal. Chem.， 2012， 84（1）： 224-231
8Zhang Y.， Hu J， Zhang C Y. Anal. Chem.， 2012， 84（21）： 9544-9549
9Li T， Shi L， Wang E， Dong S. Chem. Eur. J.， 2009， 15： 1036-1042
10Li T， Shi L， Wang E， Dong S. Chem. Commun.， 2009： 580-582
11Yang X， Li T， Li B， Wang E. Analyst， 2010， 135： 71-75
12Pavlov V， Xiao Y， Gill R， Dishon A， Kotler M， Willner I. Anal. Chem.， 2004， 76（7）： 2152- 2156
13Xiao Y， Pavlov V， Gill R， Bourenko T， Willner I. Chem. Bio. Chem.， 2004， 5（3）： 374-379
14Kolpashchikov D M.J. Am. Chem. Soc.， 2008， 130（10）： 2934-2935
15LI ZhengPing，ZHANG ZongMian，LIU ChengHui. Journal of Hebei University （Natural Science Edition）， 2011， 31（2）： 167-170
4结论
建立了一种利用显色法结合IEXPAR高灵敏、高特异性检测DNA的新方法。利用双扩增模板模型，通过设计Template 1的3′端序列实现不同特定序列核酸（包括DNA和RNA）的分析检测，同时Template 1的5′端序列和Template 2可以作为普遍适用的序列实现IEXPAR的显色检测；利用HeminG4模拟酶催化ABTSH2O2显色反应，只需简单的分光光度计进行检测，降低了检测的成本；本方法可以利用微孔板检测系统（如酶标仪）， 实现高通量的样品分析。
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4结论
建立了一种利用显色法结合IEXPAR高灵敏、高特异性检测DNA的新方法。利用双扩增模板模型，通过设计Template 1的3′端序列实现不同特定序列核酸（包括DNA和RNA）的分析检测，同时Template 1的5′端序列和Template 2可以作为普遍适用的序列实现IEXPAR的显色检测；利用HeminG4模拟酶催化ABTSH2O2显色反应，只需简单的分光光度计进行检测，降低了检测的成本；本方法可以利用微孔板检测系统（如酶标仪）， 实现高通量的样品分析。
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摘要：基于血红素（Hemin）与G四联体（G4）所形成模拟酶的催化作用，结合等温指数扩增反应（IEXPAR），建立了特定序列DNA的显色检测方法。目标DNA引发IEXPAR，通过设计模板序列，IEXPAR产生大量富含鸟嘌呤的单链DNA，在K+存在时，该单链DNA可形成G4结构，G4可以与Hemin结合形成具有过氧化物酶活性的模拟酶（HeminG4），HeminG4催化H2O2氧化2，2联氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二铵盐 （ABTS），使体系颜色发生变化，反应产物最大吸收波长为421 nm。对显色反应体系中的实验参数进行了优化，包括Hemin浓度、ABTS浓度、H2O2浓度、IEXPAR时间和显色反应时间。在最佳条件下，所建立的体系可以简便、快速检测0.1～10 nmol/L的目标DNA分子，且本方法能够很好地区分单个碱基的差别，具有良好的特异性。
关键词：特定序列DNA的检测； 等温指数扩增（IEXPAR）； HeminG4模拟酶； 显色分析
1引言
核酸扩增是实现高灵敏度检测核酸的重要手段。目前常用的核酸扩增技术是聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction， PCR），但PCR需要精确的热循环和严格的反应条件。近年来，核酸的等温扩增技术得到了迅速发展[1]。等温指数扩增反应（Isothermal exponential amplification reaction，IEXPAR）是Galas等建立的一种新型的核酸扩增技术[2]。结合DNA聚合酶催化的延伸反应及切刻内切酶的剪切作用，IEXPAR可以在等温条件下，短时间内对目标核酸分子扩增106～109倍。该技术具有简便、快速的显著优点，其扩增倍数可与PCR媲美。目前IEXPAR已广泛用于特定序列DNA分析[3]、病毒基因鉴定[4，5]、microRNA测定[6，7]以及转录因子分析[8]。但基于IEXPAR的核酸分析多采用实时荧光检测方法，需要昂贵的实时荧光定量PCR等仪器。
在K+存在时，富含鸟嘌呤的单链DNA（G4DNA）通过分子内氢键的相互作用可折叠形成稳定的G四联体结构（G4）[9～11]，G4可与氯高铁血红素（Hemin）结合，形成具有过氧化物酶活性的模拟酶（HeminG4）[12]，HeminG4可以催化H2O2与2，2联氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二铵盐（ABTS）的氧化反应，使体系颜色发生变化，并在421 nm产生最大吸收。本研究通过设计IEXPAR反应模板，产生G4DNA，利用HeminG4模拟酶的催化作用，结合等温指数扩增反应，建立了一种廉价、简便的显色法检测特定序列DNA的新方法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
3结果与讨论
3.1等温指数扩增及显色法检测DNA的原理
等温指数扩增及显色法检测DNA的原理如图1所示，首先根据检测的TargetDNA及G4DNA 的序列设计扩增模板Template 1和Template 2。Template 1的3′端序列与TargetDNA序列互补，5′端序列与G4DNA序列互补，Template 2的3′端和5′端序列相同且与G4DNA完全互补。Template 1和Template 2中间都含有切刻内切酶Nt.BstNBI特异性识别序列；在DNA聚合酶和dNTPs存在时，TargetDNA与Template 1的3′端序列杂交， 并进行延伸反应， 形成含有Nt.BstNBI特异性识别序列的双链DNA，Nt.BstNBI将识别对应的双链序列，并从其后4个碱基处将DNA剪切，释放出G4DNA；切口处的DNA继续延伸并被剪切，释放出更多的G4DNA，形成线性放大的机制。另外，释放出的G4DNA与Template 2的3′端序列杂交，并在聚合酶作用下沿着Template 2延伸形成双链DNA，Nt.BstNBI识别其特异性序列并将延伸反应产生的DNA剪切，切口处DNA继续延伸、被剪切，这样不断进行剪切延伸剪切，形成指数扩增机制，产生大量G4DNA。在K+存在时，G4DNA形成G4结构，G4与Hemin结合形成具有过氧化物酶活性的模拟酶，该模拟酶可以催化ABTSH2O2体系发生氧化还原反应， 并伴随颜色变化， 反应产物最大吸收波长为421 nm。通过测定吸光度可灵敏地检测TargetDNA。
3.2实验条件优化
3.2.1Hemin浓度优化固定ABTS浓度为5.0 mmol/L，H2O2浓度为1.0 mmol/L，G4DNA为1 μmol/L，研究了不同浓度Hemin与G4DNA所形成的模拟酶对ABTSH2O2显色体系吸光度的影响，结果如图2所示。当Hemin浓度低于2.5 μmol/L时，体系的吸光度随着Hemin浓度升高快速增加；当Hemin浓度大于2.5 μmol/L时，吸光度随着Hemin浓度增加的趋势趋于平缓。同时，空白的吸光度随着Hemin浓度升高逐渐增加。当Hemin浓度等于2.5 μmol/L，G4DNA产生的吸光度与空白的差值达到最大值。本实验测定DNA时， Hemin浓度选择为2.5 μmol/L。
3.2.2ABTS浓度优化选择Hemin浓度为2.5 μmol/L，H2O2浓度为1.0 mmol/L，G4DNA为1 μmol/L，考察了ABTS浓度对模拟酶ABTSH2O2显色体系吸光度的影响。由图3可见，随着ABTS浓度增大，G4DNA所产生的吸光度呈逐渐增长趋势； ABTS浓度高于5 mmol/L， 吸光度增加趋于平缓，同时，由于ABTS在421 nm产生微弱的吸收，空白吸光度也随ABTS浓度的升高逐渐增加。综合考虑，本实验中ABTS最佳浓度选择5 mmol/L。
3.4检测方法的特异性评价
为了评价所建立方法对检测特定序列的TargetDNA的特异性，按照2.2.1节的方法，在相同条件下对10 pmol/L TargetDNA及分别含有1， 2和 3个突变碱基的Mutant DNA 1， Mutant DNA 2和Mutant DNA 3（序列见表1）同时进行测定，结果表明，Mutant DNA 1， Mutant DNA 2和Mutant DNA 3对检测10 pmol/L TargetDNA产生的干扰分别为6.3%， 1.3%和0.1%。表明本方法能够很好地识别TargetDNA中单个碱基差别，对特定序列的TargetDNA测定具有良好的特异性。
4结论
建立了一种利用显色法结合IEXPAR高灵敏、高特异性检测DNA的新方法。利用双扩增模板模型，通过设计Template 1的3′端序列实现不同特定序列核酸（包括DNA和RNA）的分析检测，同时Template 1的5′端序列和Template 2可以作为普遍适用的序列实现IEXPAR的显色检测；利用HeminG4模拟酶催化ABTSH2O2显色反应，只需简单的分光光度计进行检测，降低了检测的成本；本方法可以利用微孔板检测系统（如酶标仪）， 实现高通量的样品分析。
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4结论
建立了一种利用显色法结合IEXPAR高灵敏、高特异性检测DNA的新方法。利用双扩增模板模型，通过设计Template 1的3′端序列实现不同特定序列核酸（包括DNA和RNA）的分析检测，同时Template 1的5′端序列和Template 2可以作为普遍适用的序列实现IEXPAR的显色检测；利用HeminG4模拟酶催化ABTSH2O2显色反应，只需简单的分光光度计进行检测，降低了检测的成本；本方法可以利用微孔板检测系统（如酶标仪）， 实现高通量的样品分析。
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4结论
建立了一种利用显色法结合IEXPAR高灵敏、高特异性检测DNA的新方法。利用双扩增模板模型，通过设计Template 1的3′端序列实现不同特定序列核酸（包括DNA和RNA）的分析检测，同时Template 1的5′端序列和Template 2可以作为普遍适用的序列实现IEXPAR的显色检测；利用HeminG4模拟酶催化ABTSH2O2显色反应，只需简单的分光光度计进行检测，降低了检测的成本；本方法可以利用微孔板检测系统（如酶标仪）， 实现高通量的样品分析。
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