不同位置土壤中枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力的比较

    王佩+武亚方+卢江丽+刘梦洁

    摘要：从月季花下、草坪上及大树下采集土壤，然后对其进行分离得到枯草芽孢杆菌。通过对枯草芽苞杆菌利用酪蛋白培养基产蛋白酶能力的比较，发现月季花下土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力最强。

    关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；纯化

    中图分类号：S188文献标识码：A文章编号：1007-273X（2014）03-0012-02

    随着饲用酶制剂应用研究的不断深入，人们逐渐发现了蛋白酶在动物营养上的独特作用，蛋白酶也因此受到了越来越多的关注。根据来源的不同，蛋白酶可分为动物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等[1]。其中微生物蛋白酶既有通过细菌（如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）培养提取的，也有通过真菌（如黑曲霉、酵母）发酵提取的。微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生产成本相对低廉，在多种工业（如饲料、食品等）上得到了广泛应用。本试验通过对不同位置的新鲜土壤进行分离，筛选出产蛋白酶活力较高的菌株，为微生物蛋白酶的研究奠定了基础。

    1材料与方法

    1.1土壤

    试验用3份新鲜土壤：采自黄淮学院某月季花下、草坪上及大树下，距土壤表层约10 cm。

    1.2方法

    1.2.1菌株分离 将土样平摊于一干净的四方纸上，从纸的四角及中间各取适量的土样，混匀。称取1.0 g混匀土样与20 mL肉汤培养基于锥形瓶中混合，封口。再将其放入80 ℃恒温水浴锅中加热处理10 min，然后于恒温摇床内30 ℃，150 r/min振荡培养24 h。

    用接种环接种于营养琼脂培养基上，30 ℃条件下培养24 h[2，3]。

    1.2.2革兰氏染色 将上述营养琼脂培养基上的菌落进行涂片镜检。

    在已干燥的抹片上滴加草酸铵结晶紫染色液，染色1 min，水洗；加路戈碘液进行媒染2 min，水洗；加95%乙醇进行脱色30 s，水洗；加10倍稀释的石碳酸复红染液，复染1 min，水洗；吸干、烘干，镜检。

    1.2.3生化试验

    （1）接触酶试验。用接种环取一小环符合上述要求的菌落涂抹于已滴有10%过氧化氢溶液的载玻片上，观察载玻片上是否有大量气泡产生。

    （2）V-P试验。将符合上述要求的菌落接种于V-P反应培养液中，37 ℃培养4 d后，取2 mL培养液和等量的40%NaOH溶液混合，充分振荡后观察培养液是否呈红色。

    （3）水解淀粉试验。取符合上述要求的菌落接种于淀粉培养基上，于37 ℃培养4 d后，在平板上滴加卢氏碘液（需铺满菌落），观察平板是否呈蓝色，菌落周围有无无色透明圈出现。

    （4）柠檬酸盐试验。将符合上述要求的菌落接种于柠檬酸盐培养基上，37 ℃培养4 d，观察平板是否呈现蓝色或桃红色。

    （5）分解酪素试验。将符合各个生化鉴定结果的菌落接种于肉汤培养基中，置于恒温摇床机内30 ℃、150 r/min振荡富集培养24 h。然后再将其置于80℃水浴锅中加热10 min。取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释为10 4、10 5、10 6。分别取0.1 mL菌液涂布于酪素培养基上。倒置于恒温培养箱中30 ℃培养24 h。

    观察酪素平板上菌落周围是否产生透明圈，挑H/C（透明圈直径/菌落直径）比值大的菌种接入斜面培养基上。30 ℃培养24 h，备用。

    1.2.4菌种纯化 平板划线分离法在牛肉膏蛋白胨培养基上分离纯化挑选出的菌株。

    2结果与分析

    2.1菌种分离

    革兰氏染色阳性；镜检结果为短杆状、芽孢端生，形状椭圆。

    2.2菌种鉴定

    生化试验鉴定结果见表1。有表1可见，该菌对接触酶试验、V-P试验、水解淀粉试验、柠檬酸盐试验均呈阳性。

    由表2可见，月季花下分离后菌株在酵素平板上的H/C值最大。该菌能分解酪素，在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈H/C结果见表2。

    根据各项指标的检测结果，依照《伯杰氏细菌鉴定手册》，可以认为筛选到的菌株为枯草芽孢杆菌[4]，其中月季花下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最强，草坪上纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力次之，大树下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最弱。

    3讨论

    催化蛋白质水解的酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。许多行业已开始大量利用蛋白酶，因为它既可以节省时间，又能改善劳动卫生条件。蛋白酶可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎；加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时应注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。

    本试验通过对菌株分离、鉴定的研究，得到了产蛋白酶的枯草芽孢杆菌，为进一步提高该菌产中性蛋白酶的能力奠定了基础，在接下来的试验中，计划筛选出高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，并对其进行优化，提高酶活力，增强稳定性，使其作为酶制剂尽快应用于饲料添加剂产业。

    参考文献：

    [1]郭兴华，益生菌—基础与应用[M].北京：北京科学技术出版社，2002.

    [2]汤保贵，徐中文，张金燕，等.枯草芽孢杆菌的培养条件及对水质的净化作用[J].淡水鱼业，2007，37（3）：45 48.

    [3]雷爱莹.枯草芽孢杆菌的分离和净化水质的研究[J].广西农业科学，2005（3）：20 22.

    [4]温海燕.枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].兽医科技，2012（2）：118 119.

    摘要：从月季花下、草坪上及大树下采集土壤，然后对其进行分离得到枯草芽孢杆菌。通过对枯草芽苞杆菌利用酪蛋白培养基产蛋白酶能力的比较，发现月季花下土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力最强。

    关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；纯化

    中图分类号：S188文献标识码：A文章编号：1007-273X（2014）03-0012-02

    随着饲用酶制剂应用研究的不断深入，人们逐渐发现了蛋白酶在动物营养上的独特作用，蛋白酶也因此受到了越来越多的关注。根据来源的不同，蛋白酶可分为动物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等[1]。其中微生物蛋白酶既有通过细菌（如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）培养提取的，也有通过真菌（如黑曲霉、酵母）发酵提取的。微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生产成本相对低廉，在多种工业（如饲料、食品等）上得到了广泛应用。本试验通过对不同位置的新鲜土壤进行分离，筛选出产蛋白酶活力较高的菌株，为微生物蛋白酶的研究奠定了基础。

    1材料与方法

    1.1土壤

    试验用3份新鲜土壤：采自黄淮学院某月季花下、草坪上及大树下，距土壤表层约10 cm。

    1.2方法

    1.2.1菌株分离 将土样平摊于一干净的四方纸上，从纸的四角及中间各取适量的土样，混匀。称取1.0 g混匀土样与20 mL肉汤培养基于锥形瓶中混合，封口。再将其放入80 ℃恒温水浴锅中加热处理10 min，然后于恒温摇床内30 ℃，150 r/min振荡培养24 h。

    用接种环接种于营养琼脂培养基上，30 ℃条件下培养24 h[2，3]。

    1.2.2革兰氏染色 将上述营养琼脂培养基上的菌落进行涂片镜检。

    在已干燥的抹片上滴加草酸铵结晶紫染色液，染色1 min，水洗；加路戈碘液进行媒染2 min，水洗；加95%乙醇进行脱色30 s，水洗；加10倍稀释的石碳酸复红染液，复染1 min，水洗；吸干、烘干，镜检。

    1.2.3生化试验

    （1）接触酶试验。用接种环取一小环符合上述要求的菌落涂抹于已滴有10%过氧化氢溶液的载玻片上，观察载玻片上是否有大量气泡产生。

    （2）V-P试验。将符合上述要求的菌落接种于V-P反应培养液中，37 ℃培养4 d后，取2 mL培养液和等量的40%NaOH溶液混合，充分振荡后观察培养液是否呈红色。

    （3）水解淀粉试验。取符合上述要求的菌落接种于淀粉培养基上，于37 ℃培养4 d后，在平板上滴加卢氏碘液（需铺满菌落），观察平板是否呈蓝色，菌落周围有无无色透明圈出现。

    （4）柠檬酸盐试验。将符合上述要求的菌落接种于柠檬酸盐培养基上，37 ℃培养4 d，观察平板是否呈现蓝色或桃红色。

    （5）分解酪素试验。将符合各个生化鉴定结果的菌落接种于肉汤培养基中，置于恒温摇床机内30 ℃、150 r/min振荡富集培养24 h。然后再将其置于80℃水浴锅中加热10 min。取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释为10 4、10 5、10 6。分别取0.1 mL菌液涂布于酪素培养基上。倒置于恒温培养箱中30 ℃培养24 h。

    观察酪素平板上菌落周围是否产生透明圈，挑H/C（透明圈直径/菌落直径）比值大的菌种接入斜面培养基上。30 ℃培养24 h，备用。

    1.2.4菌种纯化 平板划线分离法在牛肉膏蛋白胨培养基上分离纯化挑选出的菌株。

    2结果与分析

    2.1菌种分离

    革兰氏染色阳性；镜检结果为短杆状、芽孢端生，形状椭圆。

    2.2菌种鉴定

    生化试验鉴定结果见表1。有表1可见，该菌对接触酶试验、V-P试验、水解淀粉试验、柠檬酸盐试验均呈阳性。

    由表2可见，月季花下分离后菌株在酵素平板上的H/C值最大。该菌能分解酪素，在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈H/C结果见表2。

    根据各项指标的检测结果，依照《伯杰氏细菌鉴定手册》，可以认为筛选到的菌株为枯草芽孢杆菌[4]，其中月季花下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最强，草坪上纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力次之，大树下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最弱。

    3讨论

    催化蛋白质水解的酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。许多行业已开始大量利用蛋白酶，因为它既可以节省时间，又能改善劳动卫生条件。蛋白酶可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎；加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时应注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。

    本试验通过对菌株分离、鉴定的研究，得到了产蛋白酶的枯草芽孢杆菌，为进一步提高该菌产中性蛋白酶的能力奠定了基础，在接下来的试验中，计划筛选出高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，并对其进行优化，提高酶活力，增强稳定性，使其作为酶制剂尽快应用于饲料添加剂产业。

    参考文献：

    [1]郭兴华，益生菌—基础与应用[M].北京：北京科学技术出版社，2002.

    [2]汤保贵，徐中文，张金燕，等.枯草芽孢杆菌的培养条件及对水质的净化作用[J].淡水鱼业，2007，37（3）：45 48.

    [3]雷爱莹.枯草芽孢杆菌的分离和净化水质的研究[J].广西农业科学，2005（3）：20 22.

    [4]温海燕.枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].兽医科技，2012（2）：118 119.

    摘要：从月季花下、草坪上及大树下采集土壤，然后对其进行分离得到枯草芽孢杆菌。通过对枯草芽苞杆菌利用酪蛋白培养基产蛋白酶能力的比较，发现月季花下土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力最强。

    关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；纯化

    中图分类号：S188文献标识码：A文章编号：1007-273X（2014）03-0012-02

    随着饲用酶制剂应用研究的不断深入，人们逐渐发现了蛋白酶在动物营养上的独特作用，蛋白酶也因此受到了越来越多的关注。根据来源的不同，蛋白酶可分为动物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等[1]。其中微生物蛋白酶既有通过细菌（如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）培养提取的，也有通过真菌（如黑曲霉、酵母）发酵提取的。微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生产成本相对低廉，在多种工业（如饲料、食品等）上得到了广泛应用。本试验通过对不同位置的新鲜土壤进行分离，筛选出产蛋白酶活力较高的菌株，为微生物蛋白酶的研究奠定了基础。

    1材料与方法

    1.1土壤

    试验用3份新鲜土壤：采自黄淮学院某月季花下、草坪上及大树下，距土壤表层约10 cm。

    1.2方法

    1.2.1菌株分离 将土样平摊于一干净的四方纸上，从纸的四角及中间各取适量的土样，混匀。称取1.0 g混匀土样与20 mL肉汤培养基于锥形瓶中混合，封口。再将其放入80 ℃恒温水浴锅中加热处理10 min，然后于恒温摇床内30 ℃，150 r/min振荡培养24 h。

    用接种环接种于营养琼脂培养基上，30 ℃条件下培养24 h[2，3]。

    1.2.2革兰氏染色 将上述营养琼脂培养基上的菌落进行涂片镜检。

    在已干燥的抹片上滴加草酸铵结晶紫染色液，染色1 min，水洗；加路戈碘液进行媒染2 min，水洗；加95%乙醇进行脱色30 s，水洗；加10倍稀释的石碳酸复红染液，复染1 min，水洗；吸干、烘干，镜检。

    1.2.3生化试验

    （1）接触酶试验。用接种环取一小环符合上述要求的菌落涂抹于已滴有10%过氧化氢溶液的载玻片上，观察载玻片上是否有大量气泡产生。

    （2）V-P试验。将符合上述要求的菌落接种于V-P反应培养液中，37 ℃培养4 d后，取2 mL培养液和等量的40%NaOH溶液混合，充分振荡后观察培养液是否呈红色。

    （3）水解淀粉试验。取符合上述要求的菌落接种于淀粉培养基上，于37 ℃培养4 d后，在平板上滴加卢氏碘液（需铺满菌落），观察平板是否呈蓝色，菌落周围有无无色透明圈出现。

    （4）柠檬酸盐试验。将符合上述要求的菌落接种于柠檬酸盐培养基上，37 ℃培养4 d，观察平板是否呈现蓝色或桃红色。

    （5）分解酪素试验。将符合各个生化鉴定结果的菌落接种于肉汤培养基中，置于恒温摇床机内30 ℃、150 r/min振荡富集培养24 h。然后再将其置于80℃水浴锅中加热10 min。取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释为10 4、10 5、10 6。分别取0.1 mL菌液涂布于酪素培养基上。倒置于恒温培养箱中30 ℃培养24 h。

    观察酪素平板上菌落周围是否产生透明圈，挑H/C（透明圈直径/菌落直径）比值大的菌种接入斜面培养基上。30 ℃培养24 h，备用。

    1.2.4菌种纯化 平板划线分离法在牛肉膏蛋白胨培养基上分离纯化挑选出的菌株。

    2结果与分析

    2.1菌种分离

    革兰氏染色阳性；镜检结果为短杆状、芽孢端生，形状椭圆。

    2.2菌种鉴定

    生化试验鉴定结果见表1。有表1可见，该菌对接触酶试验、V-P试验、水解淀粉试验、柠檬酸盐试验均呈阳性。

    由表2可见，月季花下分离后菌株在酵素平板上的H/C值最大。该菌能分解酪素，在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈H/C结果见表2。

    根据各项指标的检测结果，依照《伯杰氏细菌鉴定手册》，可以认为筛选到的菌株为枯草芽孢杆菌[4]，其中月季花下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最强，草坪上纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力次之，大树下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最弱。

    3讨论

    催化蛋白质水解的酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。许多行业已开始大量利用蛋白酶，因为它既可以节省时间，又能改善劳动卫生条件。蛋白酶可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎；加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时应注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。

    本试验通过对菌株分离、鉴定的研究，得到了产蛋白酶的枯草芽孢杆菌，为进一步提高该菌产中性蛋白酶的能力奠定了基础，在接下来的试验中，计划筛选出高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，并对其进行优化，提高酶活力，增强稳定性，使其作为酶制剂尽快应用于饲料添加剂产业。

    参考文献：

    [1]郭兴华，益生菌—基础与应用[M].北京：北京科学技术出版社，2002.

    [2]汤保贵，徐中文，张金燕，等.枯草芽孢杆菌的培养条件及对水质的净化作用[J].淡水鱼业，2007，37（3）：45 48.

    [3]雷爱莹.枯草芽孢杆菌的分离和净化水质的研究[J].广西农业科学，2005（3）：20 22.

    [4]温海燕.枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].兽医科技，2012（2）：118 119.