不同位置土壤中枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力的比较

    王佩+武亚方+卢江丽+刘梦洁

    摘要:从月季花下、草坪上及大树下采集土壤,然后对其进行分离得到枯草芽孢杆菌。通过对枯草芽苞杆菌利用酪蛋白培养基产蛋白酶能力的比较,发现月季花下土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力最强。

    关键词:枯草芽孢杆菌;蛋白酶;纯化

    中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1007-273X(2014)03-0012-02

    随着饲用酶制剂应用研究的不断深入,人们逐渐发现了蛋白酶在动物营养上的独特作用,蛋白酶也因此受到了越来越多的关注。根据来源的不同,蛋白酶可分为动物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等[1]。其中微生物蛋白酶既有通过细菌(如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌)培养提取的,也有通过真菌(如黑曲霉、酵母)发酵提取的。微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生产成本相对低廉,在多种工业(如饲料、食品等)上得到了广泛应用。本试验通过对不同位置的新鲜土壤进行分离,筛选出产蛋白酶活力较高的菌株,为微生物蛋白酶的研究奠定了基础。

    1材料与方法

    1.1土壤

    试验用3份新鲜土壤:采自黄淮学院某月季花下、草坪上及大树下,距土壤表层约10 cm。

    1.2方法

    1.2.1菌株分离 将土样平摊于一干净的四方纸上,从纸的四角及中间各取适量的土样,混匀。称取1.0 g混匀土样与20 mL肉汤培养基于锥形瓶中混合,封口。再将其放入80 ℃恒温水浴锅中加热处理10 min,然后于恒温摇床内30 ℃,150 r/min振荡培养24 h。

    用接种环接种于营养琼脂培养基上,30 ℃条件下培养24 h[2,3]。

    1.2.2革兰氏染色 将上述营养琼脂培养基上的菌落进行涂片镜检。

    在已干燥的抹片上滴加草酸铵结晶紫染色液,染色1 min,水洗;加路戈碘液进行媒染2 min,水洗;加95%乙醇进行脱色30 s,水洗;加10倍稀释的石碳酸复红染液,复染1 min,水洗;吸干、烘干,镜检。

    1.2.3生化试验

    (1)接触酶试验。用接种环取一小环符合上述要求的菌落涂抹于已滴有10%过氧化氢溶液的载玻片上,观察载玻片上是否有大量气泡产生。

    (2)V-P试验。将符合上述要求的菌落接种于V-P反应培养液中,37 ℃培养4 d后,取2 mL培养液和等量的40%NaOH溶液混合,充分振荡后观察培养液是否呈红色。

    (3)水解淀粉试验。取符合上述要求的菌落接种于淀粉培养基上,于37 ℃培养4 d后,在平板上滴加卢氏碘液(需铺满菌落),观察平板是否呈蓝色,菌落周围有无无色透明圈出现。

    (4)柠檬酸盐试验。将符合上述要求的菌落接种于柠檬酸盐培养基上,37 ℃培养4 d,观察平板是否呈现蓝色或桃红色。

    (5)分解酪素试验。将符合各个生化鉴定结果的菌落接种于肉汤培养基中,置于恒温摇床机内30 ℃、150 r/min振荡富集培养24 h。然后再将其置于80℃水浴锅中加热10 min。取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释为10 4、10 5、10 6。分别取0.1 mL菌液涂布于酪素培养基上。倒置于恒温培养箱中30 ℃培养24 h。

    观察酪素平板上菌落周围是否产生透明圈,挑H/C(透明圈直径/菌落直径)比值大的菌种接入斜面培养基上。30 ℃培养24 h,备用。

    1.2.4菌种纯化 平板划线分离法在牛肉膏蛋白胨培养基上分离纯化挑选出的菌株。

    2结果与分析

    2.1菌种分离

    革兰氏染色阳性;镜检结果为短杆状、芽孢端生,形状椭圆。

    2.2菌种鉴定

    生化试验鉴定结果见表1。有表1可见,该菌对接触酶试验、V-P试验、水解淀粉试验、柠檬酸盐试验均呈阳性。

    由表2可见,月季花下分离后菌株在酵素平板上的H/C值最大。该菌能分解酪素,在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈H/C结果见表2。

    根据各项指标的检测结果,依照《伯杰氏细菌鉴定手册》,可以认为筛选到的菌株为枯草芽孢杆菌[4],其中月季花下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最强,草坪上纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力次之,大树下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最弱。

    3讨论

    催化蛋白质水解的酶种类很多,重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。许多行业已开始大量利用蛋白酶,因为它既可以节省时间,又能改善劳动卫生条件。蛋白酶可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。临床上可作药用,如用胃蛋白酶治疗消化不良,用酸性蛋白酶治疗支气管炎;加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品,含碱性蛋白酶,能去除衣物上的血渍和蛋白污物,但使用时应注意不要接触皮肤,以免损伤皮肤表面的蛋白质,引起皮疹、湿疹等过敏现象。

    本试验通过对菌株分离、鉴定的研究,得到了产蛋白酶的枯草芽孢杆菌,为进一步提高该菌产中性蛋白酶的能力奠定了基础,在接下来的试验中,计划筛选出高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株,并对其进行优化,提高酶活力,增强稳定性,使其作为酶制剂尽快应用于饲料添加剂产业。

    参考文献:

    [1]郭兴华,益生菌—基础与应用[M].北京:北京科学技术出版社,2002.

    [2]汤保贵,徐中文,张金燕,等.枯草芽孢杆菌的培养条件及对水质的净化作用[J].淡水鱼业,2007,37(3):45 48.

    [3]雷爱莹.枯草芽孢杆菌的分离和净化水质的研究[J].广西农业科学,2005(3):20 22.

    [4]温海燕.枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].兽医科技,2012(2):118 119.

    摘要:从月季花下、草坪上及大树下采集土壤,然后对其进行分离得到枯草芽孢杆菌。通过对枯草芽苞杆菌利用酪蛋白培养基产蛋白酶能力的比较,发现月季花下土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力最强。

    关键词:枯草芽孢杆菌;蛋白酶;纯化

    中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1007-273X(2014)03-0012-02

    随着饲用酶制剂应用研究的不断深入,人们逐渐发现了蛋白酶在动物营养上的独特作用,蛋白酶也因此受到了越来越多的关注。根据来源的不同,蛋白酶可分为动物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等[1]。其中微生物蛋白酶既有通过细菌(如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌)培养提取的,也有通过真菌(如黑曲霉、酵母)发酵提取的。微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生产成本相对低廉,在多种工业(如饲料、食品等)上得到了广泛应用。本试验通过对不同位置的新鲜土壤进行分离,筛选出产蛋白酶活力较高的菌株,为微生物蛋白酶的研究奠定了基础。

    1材料与方法

    1.1土壤

    试验用3份新鲜土壤:采自黄淮学院某月季花下、草坪上及大树下,距土壤表层约10 cm。

    1.2方法

    1.2.1菌株分离 将土样平摊于一干净的四方纸上,从纸的四角及中间各取适量的土样,混匀。称取1.0 g混匀土样与20 mL肉汤培养基于锥形瓶中混合,封口。再将其放入80 ℃恒温水浴锅中加热处理10 min,然后于恒温摇床内30 ℃,150 r/min振荡培养24 h。

    用接种环接种于营养琼脂培养基上,30 ℃条件下培养24 h[2,3]。

    1.2.2革兰氏染色 将上述营养琼脂培养基上的菌落进行涂片镜检。

    在已干燥的抹片上滴加草酸铵结晶紫染色液,染色1 min,水洗;加路戈碘液进行媒染2 min,水洗;加95%乙醇进行脱色30 s,水洗;加10倍稀释的石碳酸复红染液,复染1 min,水洗;吸干、烘干,镜检。

    1.2.3生化试验

    (1)接触酶试验。用接种环取一小环符合上述要求的菌落涂抹于已滴有10%过氧化氢溶液的载玻片上,观察载玻片上是否有大量气泡产生。

    (2)V-P试验。将符合上述要求的菌落接种于V-P反应培养液中,37 ℃培养4 d后,取2 mL培养液和等量的40%NaOH溶液混合,充分振荡后观察培养液是否呈红色。

    (3)水解淀粉试验。取符合上述要求的菌落接种于淀粉培养基上,于37 ℃培养4 d后,在平板上滴加卢氏碘液(需铺满菌落),观察平板是否呈蓝色,菌落周围有无无色透明圈出现。

    (4)柠檬酸盐试验。将符合上述要求的菌落接种于柠檬酸盐培养基上,37 ℃培养4 d,观察平板是否呈现蓝色或桃红色。

    (5)分解酪素试验。将符合各个生化鉴定结果的菌落接种于肉汤培养基中,置于恒温摇床机内30 ℃、150 r/min振荡富集培养24 h。然后再将其置于80℃水浴锅中加热10 min。取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释为10 4、10 5、10 6。分别取0.1 mL菌液涂布于酪素培养基上。倒置于恒温培养箱中30 ℃培养24 h。

    观察酪素平板上菌落周围是否产生透明圈,挑H/C(透明圈直径/菌落直径)比值大的菌种接入斜面培养基上。30 ℃培养24 h,备用。

    1.2.4菌种纯化 平板划线分离法在牛肉膏蛋白胨培养基上分离纯化挑选出的菌株。

    2结果与分析

    2.1菌种分离

    革兰氏染色阳性;镜检结果为短杆状、芽孢端生,形状椭圆。

    2.2菌种鉴定

    生化试验鉴定结果见表1。有表1可见,该菌对接触酶试验、V-P试验、水解淀粉试验、柠檬酸盐试验均呈阳性。

    由表2可见,月季花下分离后菌株在酵素平板上的H/C值最大。该菌能分解酪素,在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈H/C结果见表2。

    根据各项指标的检测结果,依照《伯杰氏细菌鉴定手册》,可以认为筛选到的菌株为枯草芽孢杆菌[4],其中月季花下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最强,草坪上纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力次之,大树下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最弱。

    3讨论

    催化蛋白质水解的酶种类很多,重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。许多行业已开始大量利用蛋白酶,因为它既可以节省时间,又能改善劳动卫生条件。蛋白酶可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。临床上可作药用,如用胃蛋白酶治疗消化不良,用酸性蛋白酶治疗支气管炎;加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品,含碱性蛋白酶,能去除衣物上的血渍和蛋白污物,但使用时应注意不要接触皮肤,以免损伤皮肤表面的蛋白质,引起皮疹、湿疹等过敏现象。

    本试验通过对菌株分离、鉴定的研究,得到了产蛋白酶的枯草芽孢杆菌,为进一步提高该菌产中性蛋白酶的能力奠定了基础,在接下来的试验中,计划筛选出高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株,并对其进行优化,提高酶活力,增强稳定性,使其作为酶制剂尽快应用于饲料添加剂产业。

    参考文献:

    [1]郭兴华,益生菌—基础与应用[M].北京:北京科学技术出版社,2002.

    [2]汤保贵,徐中文,张金燕,等.枯草芽孢杆菌的培养条件及对水质的净化作用[J].淡水鱼业,2007,37(3):45 48.

    [3]雷爱莹.枯草芽孢杆菌的分离和净化水质的研究[J].广西农业科学,2005(3):20 22.

    [4]温海燕.枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].兽医科技,2012(2):118 119.

    摘要:从月季花下、草坪上及大树下采集土壤,然后对其进行分离得到枯草芽孢杆菌。通过对枯草芽苞杆菌利用酪蛋白培养基产蛋白酶能力的比较,发现月季花下土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力最强。

    关键词:枯草芽孢杆菌;蛋白酶;纯化

    中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1007-273X(2014)03-0012-02

    随着饲用酶制剂应用研究的不断深入,人们逐渐发现了蛋白酶在动物营养上的独特作用,蛋白酶也因此受到了越来越多的关注。根据来源的不同,蛋白酶可分为动物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶等[1]。其中微生物蛋白酶既有通过细菌(如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌)培养提取的,也有通过真菌(如黑曲霉、酵母)发酵提取的。微生物蛋白酶和植物蛋白酶由于生产成本相对低廉,在多种工业(如饲料、食品等)上得到了广泛应用。本试验通过对不同位置的新鲜土壤进行分离,筛选出产蛋白酶活力较高的菌株,为微生物蛋白酶的研究奠定了基础。

    1材料与方法

    1.1土壤

    试验用3份新鲜土壤:采自黄淮学院某月季花下、草坪上及大树下,距土壤表层约10 cm。

    1.2方法

    1.2.1菌株分离 将土样平摊于一干净的四方纸上,从纸的四角及中间各取适量的土样,混匀。称取1.0 g混匀土样与20 mL肉汤培养基于锥形瓶中混合,封口。再将其放入80 ℃恒温水浴锅中加热处理10 min,然后于恒温摇床内30 ℃,150 r/min振荡培养24 h。

    用接种环接种于营养琼脂培养基上,30 ℃条件下培养24 h[2,3]。

    1.2.2革兰氏染色 将上述营养琼脂培养基上的菌落进行涂片镜检。

    在已干燥的抹片上滴加草酸铵结晶紫染色液,染色1 min,水洗;加路戈碘液进行媒染2 min,水洗;加95%乙醇进行脱色30 s,水洗;加10倍稀释的石碳酸复红染液,复染1 min,水洗;吸干、烘干,镜检。

    1.2.3生化试验

    (1)接触酶试验。用接种环取一小环符合上述要求的菌落涂抹于已滴有10%过氧化氢溶液的载玻片上,观察载玻片上是否有大量气泡产生。

    (2)V-P试验。将符合上述要求的菌落接种于V-P反应培养液中,37 ℃培养4 d后,取2 mL培养液和等量的40%NaOH溶液混合,充分振荡后观察培养液是否呈红色。

    (3)水解淀粉试验。取符合上述要求的菌落接种于淀粉培养基上,于37 ℃培养4 d后,在平板上滴加卢氏碘液(需铺满菌落),观察平板是否呈蓝色,菌落周围有无无色透明圈出现。

    (4)柠檬酸盐试验。将符合上述要求的菌落接种于柠檬酸盐培养基上,37 ℃培养4 d,观察平板是否呈现蓝色或桃红色。

    (5)分解酪素试验。将符合各个生化鉴定结果的菌落接种于肉汤培养基中,置于恒温摇床机内30 ℃、150 r/min振荡富集培养24 h。然后再将其置于80℃水浴锅中加热10 min。取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释为10 4、10 5、10 6。分别取0.1 mL菌液涂布于酪素培养基上。倒置于恒温培养箱中30 ℃培养24 h。

    观察酪素平板上菌落周围是否产生透明圈,挑H/C(透明圈直径/菌落直径)比值大的菌种接入斜面培养基上。30 ℃培养24 h,备用。

    1.2.4菌种纯化 平板划线分离法在牛肉膏蛋白胨培养基上分离纯化挑选出的菌株。

    2结果与分析

    2.1菌种分离

    革兰氏染色阳性;镜检结果为短杆状、芽孢端生,形状椭圆。

    2.2菌种鉴定

    生化试验鉴定结果见表1。有表1可见,该菌对接触酶试验、V-P试验、水解淀粉试验、柠檬酸盐试验均呈阳性。

    由表2可见,月季花下分离后菌株在酵素平板上的H/C值最大。该菌能分解酪素,在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈H/C结果见表2。

    根据各项指标的检测结果,依照《伯杰氏细菌鉴定手册》,可以认为筛选到的菌株为枯草芽孢杆菌[4],其中月季花下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最强,草坪上纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力次之,大树下纯化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力最弱。

    3讨论

    催化蛋白质水解的酶种类很多,重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。许多行业已开始大量利用蛋白酶,因为它既可以节省时间,又能改善劳动卫生条件。蛋白酶可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。临床上可作药用,如用胃蛋白酶治疗消化不良,用酸性蛋白酶治疗支气管炎;加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品,含碱性蛋白酶,能去除衣物上的血渍和蛋白污物,但使用时应注意不要接触皮肤,以免损伤皮肤表面的蛋白质,引起皮疹、湿疹等过敏现象。

    本试验通过对菌株分离、鉴定的研究,得到了产蛋白酶的枯草芽孢杆菌,为进一步提高该菌产中性蛋白酶的能力奠定了基础,在接下来的试验中,计划筛选出高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株,并对其进行优化,提高酶活力,增强稳定性,使其作为酶制剂尽快应用于饲料添加剂产业。

    参考文献:

    [1]郭兴华,益生菌—基础与应用[M].北京:北京科学技术出版社,2002.

    [2]汤保贵,徐中文,张金燕,等.枯草芽孢杆菌的培养条件及对水质的净化作用[J].淡水鱼业,2007,37(3):45 48.

    [3]雷爱莹.枯草芽孢杆菌的分离和净化水质的研究[J].广西农业科学,2005(3):20 22.

    [4]温海燕.枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].兽医科技,2012(2):118 119.

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