水产品中孔雀石绿残留检测前处理方法研究与优化
曹秀梅
摘要：以渭河第二大支流-北洛河为研究对象，于2012年9月对整个水系内13个点位的浮游动物群落进行了调查。结果表明，该流域浮游动物种类有31属49种，其中轮虫最多，原生动物次之，分别占种类总数的83.67%和8.16%，浮游动物密度为1.8～479.4 ind./L，平均值为57.7 ind./L，生物量为0.002～0.604 mg/L，平均值为0.070 mg/L。各采样点浮游动物群落结构存在明显的空间异质性。基于浮游动物的群落结构特征，根据浮游生物物种多样性指数结果，对该流域水质状况进行简单评价表明，北洛河流域水质处于中度污染，浮游动物群落结构较简单，需要加大河道管理，防止污染加重。
关键词：北洛河；浮游动物；群落结构；水质评价
北洛河为渭河第二大支流，发源于陕西省榆林地区定边县，自西北向东南流经定边、靖边、吴旗、志丹、甘泉、富县、洛川、黄陵、宜君、白水、澄城、蒲城、大荔等13县，在三河口附近注入渭河，河长680 km。 流域平均宽80 km，总面积2.69 km2，占渭河流域面积的20%。浮游动物（zooplankton）是水域生态系统中重要的生物组成部分，在食物链、物质转化、能量流动、信息传递等水域生态过程中起着至关重要的作用［1-2］。目前，在渭河流域水生态环境评价中对浮游动物的关注较少，尤其在北洛河流域，对浮游动物的调查研究几乎是空白。基于此，本文通过调查浮游动物的种类组成、现存量和多样性指数等方面对北洛河浮游动物群落结构特征和水体质量进行研究和初步评价，以期为渭河流域水生态系统健康的维护及渔业管理提供基础数据。
1材料与方法
1.1采样时间及点位设置
调查于2012年9月进行，根据北洛河水系地形特点，在调查水域共设置13个点位进行样品采集，这13个点位分别设置在主干流和支流上，其中主干流设置7个点位，各支流设置6个点位（见图1）。
图1北洛河流域示意图
1.2样品采集与观察
样品以采水器在各水层采混合水样100 L，用25号浮游生物网过滤，将滤取的样本放入100 mL标本瓶中，加4%～5% 的甲醛溶液固定［3］。固定的样本在室内静置24 h后虹吸上清液，浓缩至30 mL。混匀沉淀样品依据文献［4-10］，在100～400倍生物显微镜（Olympus-CX21）下鉴定浮游动物种类，并记录个体密度。运用软件Biodiversity Professional 2.0计算浮游动物多样性指数：Shannon – Weiner物种多样性指数（H）、Margalef物种丰富度指数（M）和Pielou均匀度指数（J）。
2结果与分析
2.1浮游动物种类组成及现存量
图2北洛河流域丰水期浮游动物种类组成
本次调查中，北洛河全流域共鉴定出浮游动物31属49种，其中原生动物3属4种，占浮游动物总物种数的8.16% ；轮虫27属41种，占总浮游动物总种数的83.67% ；枝角类2属2种，占总浮游动物总物种数的4.08% ；桡足类2属2种，占总浮游动物总物种数的4.08%（见图2）。北洛河流域浮游动物的密度在1.8～479.4 ind./L，平均为57.7 ind./L，浮游动物总密度的高低主要取决于轮虫的密度。浮游动物生物量为0002～0604 mg/L，平均为0.070 mg/L，轮虫生物量同样是北洛河流域浮游动物生物量的主体（见图3）。
图3北洛河流域丰水期浮游动物各类群密度和生物量百分比组成
从图4可以看出，北洛河流域浮游动物多样性指数（H）变化幅度较大，最大值出现在L5采样点，指数为3.664，最小值出现在L2和L6采样点，指数为1.697，平均值2.671。浮游动物丰富度指数（M）变化幅度也较大，最大值出现在L1采样点，指数值为3.073，最小值出现在L6采样点，指数为0.768，平均值为1.652。浮游动物均匀度指数（J）变化幅度较小，平均值为0.749。
2.2浮游动物物种多样性
图4北洛河流域丰水期浮游动物多样性
表1浮游生物多样性指数水质评价标准［11］
生物多样性指数
无污染
轻度污染
β-中污染
α-中污染
重污染
H＞4.54.5～33～22～1＜1
M＞66～44～22～11～0
J＞0.80.8～0.50.5～0.30.3～0.1＜0.1
根据浮游生物多样性指数水质评价标准（见表1），综合三种多样性指数结果，可判断出北洛河流域丰水期水环境质量属于轻度污染-中度污染，但个别采样点位水质属于中污染-重污染。
3讨论
调查发现，北洛河流域浮游动物群落结构在种类组成上主要以轮虫为主，轮虫有41个种，占种类数的83.67%。这一调查结果与国内其他流水性河流浮游动物群落的组成较相似，符合典型河流型浮游动物群落组成［12］。从现存量来看，轮虫密度为719.9 ind./L，占中密度的95.98%，在生物量上轮虫和原生动物的百分比有所下降，而枝角类和桡足类的比重有所上升，这要是因为轮虫和原生动物体型较小，它们的相对湿重较体型较大的枝角类和桡族类偏低。
根据浮游生物多样性指数水质评价标准评价北洛河流域水质发现，多样性指数显示水环境质量为β-中污染，而丰富度指数显示水环境质量为α-中污染，均匀度指数显示水质为轻度污染。Margalef物种丰富度指数（M）是表示群落种类的丰富程度，一般情况下，在健康的环境种类丰富度高，在受污染环境中种类丰富度
摘要：采用高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿的残留量，参考GB/T 20361-2006的方法，将前处理步骤部分进行了优化，将样品前处理的匀浆提取改为样品涡动和离心；增加50 mL实验用水，去掉二次萃取乙腈，不用过滤膜过滤直接上机进行测定。结果表明：经添加回收实验，回收率在80%左右，本方法操作简便，消除了乳化现象，提高回收率，偏差小。
关键词：水产品；孔雀石绿；前处理；优化
水产品营养丰富，味道鲜美，深受人们喜爱。近年来水产养殖业迅猛发展，水产品中药物残留对人类健康的危害已成为当今突出的食品安全问题［1］，许多商者为了增加收益，在水产品中添加孔雀石绿药物对其新鲜度和完好性进行防御。孔雀石绿是带有金属光泽的绿色结晶体，可用于治理鱼类、鱼卵寄生虫、真菌或细菌感染，在养殖与运输中被常常用到，是廉价、疗效好的药物，然而其具有难代谢、残留时间长、高毒性、高残留、可致癌、致畸形等多种副作用，危害人们的身体健康，被许多国家纷纷禁止使用。为了防止滥用孔雀石绿，许多国家也都制定了相应的法规措施及检测标准。目前对孔雀石绿的检测主要有高效液相色谱法，有的省部级单位开始用液质联用检测仪，虽然有较低的检测限，但是仪器价格昂贵，技术要求较高。而且，我们在采用国标GB/T20361-2006的荧光检测方法实验过程中发现了一些问题，为提高检测工作效率，保障检测结果的准确性、可靠性，我们在此基础上进行了部分改进。经过研究能满足水产品孔雀石绿残留量测定的要求，可为保护广大消费者的身体健康、为农业执法提供重要的技术保障。
1实验部分
1.1仪器与设备
岛津LC20A液相色谱仪，荧光检测器；高速离心机：TGL-20M；旋转蒸发仪。
1.2色谱条件
参照GB/T 20361-2006［2］的色谱条件。
1.3样品制备
参照GB/T 20361-2006［2］的样品提取、萃取、净化等步骤，结合优化步骤进行处理操作，符合检测标准要求。
2结果与讨论
实验结果以色谱图中保留时间定性，外标法定量。
2.1样品提取改进
本方法将GB/T 20361-2006中的1 000 r/min匀浆提取30 s改为加标静置10 min，防止用匀浆机匀浆增加加标损失，影响回收率，并用3 000 r/min涡动2 min，4 000 r/min离心3 min，使孔雀石绿提取完全，增加它的溶出效果，从而增加实验的回收率效果。
2.2样品萃取改进
因GB/T 20361-2006方法萃取乳化现象严重，第二次萃取分层不明显，因此第一次萃取加入50 mL水；由于乙腈对水的溶解度较大，第二次将5 mL乙腈去掉， 不用离心第二次分层效果非常明显，缩短了时间，提取分离效果也提高了。
2.3样品过滤膜改进
由于市面上的滤膜质量参差不齐，有时出现一些滤膜的杂峰［3］，干扰出峰，使得谱图不美观，所以本方法将过柱提取液直接于刻度管中定容上机测定，节约了成本，提高了效率。
2.4标准曲线及加标回收情况
以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做标准曲线，在0.1～500 ng/mL线性范围内良好，线性范围良好。标准品谱图见图1。
图1孔雀石绿标准谱图
取大菱鲆7份样品，分别按加入1 mL 500 ng/mL；2 mL 500 ng/mL标准工作液，进行加标回收实验，每个溶度重复3次，另外一份为空白对照，按照改进的方法进行测定，结果如表1 。
表1大菱鲆加标回收结果
添加物质
添加量/ng·g-1
样品平均含量/ng·g-1
平均回收率/%
RSD/%
孔雀石绿
100200
87.5
178.2
87.5
89.1
2.2
1.8
3结论
本实验在GB/T 20361-2006的基础上进行了改进。将样品前处理的匀浆提取改为样品涡动和离心；提高了目标物的溶出效果，减少了匀浆带来的损失，提高了回收率，同时在萃取步骤增加50 mL实验用水，去掉5 mL乙腈，减少了试剂的使用，防止了乳化现象的出现，增加了萃取分层的效果；实验最后不用过滤膜过滤直接上机进行测定，节省了消耗品的成本，也避免了杂峰的干扰。结果表明，经改进的方法用于检测水产品中的孔雀石绿成分，简便、偏差小、提高了回收率、提高了工作效率。而且通过从事检测工作不同工作年限的试验人员的多次比对，回收率也能达到80%左右，说明改进后的方法适用于水产品中的孔雀石绿成分残留量的检测。
参考文献：
［1］
郑斌.水产品中几种常用药物残留的液相色谱检测方法研究［D］.青岛：中国海洋大学，2008
［2］ GB/T 20361-2006.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法［S］.北京：中国标准出版社，2006
［3］ 曲娜.水产品中孔雀石绿检测方法研究与改进［J］.农业开发与装备；2013（03）：125+122
1.2色谱条件
参照GB/T 20361-2006［2］的色谱条件。
1.3样品制备
参照GB/T 20361-2006［2］的样品提取、萃取、净化等步骤，结合优化步骤进行处理操作，符合检测标准要求。
2结果与讨论
实验结果以色谱图中保留时间定性，外标法定量。
2.1样品提取改进
本方法将GB/T 20361-2006中的1 000 r/min匀浆提取30 s改为加标静置10 min，防止用匀浆机匀浆增加加标损失，影响回收率，并用3 000 r/min涡动2 min，4 000 r/min离心3 min，使孔雀石绿提取完全，增加它的溶出效果，从而增加实验的回收率效果。
2.2样品萃取改进
因GB/T 20361-2006方法萃取乳化现象严重，第二次萃取分层不明显，因此第一次萃取加入50 mL水；由于乙腈对水的溶解度较大，第二次将5 mL乙腈去掉， 不用离心第二次分层效果非常明显，缩短了时间，提取分离效果也提高了。
2.3样品过滤膜改进
由于市面上的滤膜质量参差不齐，有时出现一些滤膜的杂峰［3］，干扰出峰，使得谱图不美观，所以本方法将过柱提取液直接于刻度管中定容上机测定，节约了成本，提高了效率。
2.4标准曲线及加标回收情况
以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做标准曲线，在0.1～500 ng/mL线性范围内良好，线性范围良好。标准品谱图见图1。
图1孔雀石绿标准谱图
取大菱鲆7份样品，分别按加入1 mL 500 ng/mL；2 mL 500 ng/mL标准工作液，进行加标回收实验，每个溶度重复3次，另外一份为空白对照，按照改进的方法进行测定，结果如表1 。
表1大菱鲆加标回收结果
添加物质
添加量/ng·g-1
样品平均含量/ng·g-1
平均回收率/%
RSD/%
孔雀石绿
100200
87.5
178.2
87.5
89.1
2.2
1.8
3结论
本实验在GB/T 20361-2006的基础上进行了改进。将样品前处理的匀浆提取改为样品涡动和离心；提高了目标物的溶出效果，减少了匀浆带来的损失，提高了回收率，同时在萃取步骤增加50 mL实验用水，去掉5 mL乙腈，减少了试剂的使用，防止了乳化现象的出现，增加了萃取分层的效果；实验最后不用过滤膜过滤直接上机进行测定，节省了消耗品的成本，也避免了杂峰的干扰。结果表明，经改进的方法用于检测水产品中的孔雀石绿成分，简便、偏差小、提高了回收率、提高了工作效率。而且通过从事检测工作不同工作年限的试验人员的多次比对，回收率也能达到80%左右，说明改进后的方法适用于水产品中的孔雀石绿成分残留量的检测。
参考文献：
［1］
郑斌.水产品中几种常用药物残留的液相色谱检测方法研究［D］.青岛：中国海洋大学，2008
［2］ GB/T 20361-2006.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法［S］.北京：中国标准出版社，2006
［3］ 曲娜.水产品中孔雀石绿检测方法研究与改进［J］.农业开发与装备；2013（03）：125+122
1.2色谱条件
参照GB/T 20361-2006［2］的色谱条件。
1.3样品制备
参照GB/T 20361-2006［2］的样品提取、萃取、净化等步骤，结合优化步骤进行处理操作，符合检测标准要求。
2结果与讨论
实验结果以色谱图中保留时间定性，外标法定量。
2.1样品提取改进
本方法将GB/T 20361-2006中的1 000 r/min匀浆提取30 s改为加标静置10 min，防止用匀浆机匀浆增加加标损失，影响回收率，并用3 000 r/min涡动2 min，4 000 r/min离心3 min，使孔雀石绿提取完全，增加它的溶出效果，从而增加实验的回收率效果。
2.2样品萃取改进
因GB/T 20361-2006方法萃取乳化现象严重，第二次萃取分层不明显，因此第一次萃取加入50 mL水；由于乙腈对水的溶解度较大，第二次将5 mL乙腈去掉， 不用离心第二次分层效果非常明显，缩短了时间，提取分离效果也提高了。
2.3样品过滤膜改进
由于市面上的滤膜质量参差不齐，有时出现一些滤膜的杂峰［3］，干扰出峰，使得谱图不美观，所以本方法将过柱提取液直接于刻度管中定容上机测定，节约了成本，提高了效率。
2.4标准曲线及加标回收情况
以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做标准曲线，在0.1～500 ng/mL线性范围内良好，线性范围良好。标准品谱图见图1。
图1孔雀石绿标准谱图
取大菱鲆7份样品，分别按加入1 mL 500 ng/mL；2 mL 500 ng/mL标准工作液，进行加标回收实验，每个溶度重复3次，另外一份为空白对照，按照改进的方法进行测定，结果如表1 。
表1大菱鲆加标回收结果
添加物质
添加量/ng·g-1
样品平均含量/ng·g-1
平均回收率/%
RSD/%
孔雀石绿
100200
87.5
178.2
87.5
89.1
2.2
1.8
3结论
本实验在GB/T 20361-2006的基础上进行了改进。将样品前处理的匀浆提取改为样品涡动和离心；提高了目标物的溶出效果，减少了匀浆带来的损失，提高了回收率，同时在萃取步骤增加50 mL实验用水，去掉5 mL乙腈，减少了试剂的使用，防止了乳化现象的出现，增加了萃取分层的效果；实验最后不用过滤膜过滤直接上机进行测定，节省了消耗品的成本，也避免了杂峰的干扰。结果表明，经改进的方法用于检测水产品中的孔雀石绿成分，简便、偏差小、提高了回收率、提高了工作效率。而且通过从事检测工作不同工作年限的试验人员的多次比对，回收率也能达到80%左右，说明改进后的方法适用于水产品中的孔雀石绿成分残留量的检测。
参考文献：
［1］
郑斌.水产品中几种常用药物残留的液相色谱检测方法研究［D］.青岛：中国海洋大学，2008
［2］ GB/T 20361-2006.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法［S］.北京：中国标准出版社，2006
［3］ 曲娜.水产品中孔雀石绿检测方法研究与改进［J］.农业开发与装备；2013（03）：125+122
