荧光增强型量子点探针检测痕量谷氨酸脱氢酶
杨敏+余涛+张忠平+王素华+蒋辉
摘 要 建立了荧光增强型量子点探针检测痕量谷氨酸脱氢酶（GLDH）的方法， GLDH是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的酶分子，具有氧化性的NAD+通过电子转移淬灭CdTe量子点的荧光，而GLDH催化的生物化学反应可以消耗NAD+。 在所采用的NAD+/GLDH体系中，量子点的荧光先被NAD+淬灭，加入GLDH消耗NAD+，荧光会因NAD+的减少而增强。利用这种高选择性的酶促反应可以检测浓度范围比较宽的GLDH（10～1000 U/L）。对于这个浓度范围GLDH的检测在临床上有重要意义，可用于诊断不同类型的肝脏疾病。
关键词 荧光分析法； 量子点； 谷氨酸脱氢酶； NAD； 肝损伤
1 引 言
基于半导体纳米颗粒的量子点因其独特的电子性质和光学特性已被用于许多领域的研究中[1，2]，其具有较宽的吸收光谱、较窄的发射谱带和抗光漂白特性。这些优点使其适用于生物学的研究，例如体外成像[3～7]、体内跟踪[8，9]，生物分析[9]和生物传感器的研究[10，11]。 近年来，已有多种基于荧光分子探针和量子点的生物传感器用于不同分析物的检测，如检测金属离子（Ag+， Cu2+， Pb2+）、活性小分子（NO和HClO）、生物活性大分子（DNA、蛋白质、酶）等[12～19]。
本研究利用CdTe量子点检测谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase， GLDH）。GLDH是线粒体酶，存在于所有组织的细胞中，其中以肝脏细胞线粒体内的GLDH活性最高，当肝细胞发生损害时，GLDH会进入血液，因此临床上通过测定血清GLDH的含量作为诊断肝细胞损伤病变的指标分子[20]。同其它用于诊断肝疾病的标记分子，如ALT， AST， SDH， ALP[21，22]相比，GLDH的特异性更高，肝细胞发生损伤时GLDH上升量更多，因此对肝细胞损伤的诊断更为灵敏[23]。现有的用于检测GLDH的方法有比色法、分光光度法及酶联免疫吸附法（ELISA）。这些方法存在灵敏度低、假阳性等缺陷。基于增强型荧光体系的分析方法主要基于荧光共振能量转移和光诱导电子转移两种机理，其灵敏度高、干扰少，因此是检测多肽和酶等生物分子的有效技术[24]。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Perkin Elmer LS 55荧光光谱仪测定（美国PE公司）。Shimadzu UV 2550光谱仪（日本岛津公司）。
3 巯基丙酸（3 Mercaptopropionic acid， MPA）和谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase， GLDH，type II）购自Sigma公司；碲粉（Tellurium）、L谷氨酸（Lglutamate）、NaHB4、CdCl2·2.5H2O（国药集团化学公司）。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+，上海生工有限公司）。所有试剂都是分析纯，未经纯化直接使用。超纯水（18.2 MΩ
SymbolWC@ cm）来自于Millipore纯水系统（美国Millipore公司）。
2.2 实验方法
MPA CdTe量子点是通过对文献＼[25] 的方法改进合成得到的。将0.0319 g碲粉和0.05 g NaHB4加入到通N2保护的超纯水中，形成黑色的混合液，混合液在冰浴中搅拌直至液体澄清；将0.2284 g CdCl2·2.5H2O和0.21 mL 3 巯基丙酸（MPA）溶解在超纯水中，用NaOH将溶液调至pH=9，溶液通入N2除O2；向碲粉和NaHB4的混合液中加入适量0.5 mol/L H2SO4，产生白色的H2Te气体，将H2Te气体通入到CdCl2
SymbolWC@ 溶液中，搅拌20 min，通过控制回流时间可以得到不同尺寸的CdTe量子点。回流约1 h就得到绿色的CdTe量子点。制备好的量子点用丙酮进行纯化。
检测过程如下： 首先将8 μL 绿色量子点溶解在2 mL超纯水中，混匀后测量其荧光强度，记录为I0。加入不同浓度的NAD+（0～14.71 μmol/L）， 10 min后，测量混合液的荧光强度，记录为I， 从而得到量子点荧光强度猝灭不同百分比所需要的NAD+浓度。GLDH的检测顺序：根据前面的实验结论，确定辅因子NAD+的固定用量，并与相同量的底物L谷氨酸混合，再加入不同量的GLDH，在25 ℃水浴下反应10 min。 将反应混合液分别加入到CdTe量子点溶液中，5 min后测量荧光强度，记录为Ij （j表示谷氨酸脱氢酶（GLDH）的浓度，j=0， 10， 25， 50， 100， 250， 500， 750和1000 U/L）。所有的荧光光谱都用400 nm波长激发，扫描范围为450～650 nm，扫描速度为500 nm/min。
3 结果与讨论
3.1 NAD+对MPA CdTe量子点荧光的淬灭
NAD+可以通过电子转移途径有效淬灭量子点的荧光。NAD+对量子点荧光的淬灭随着时间的变化关系见图1。NAD+的加入会引起CdTe量子点的荧光强度的降低，随着作用时间的增长，量子点的荧光强度也会逐渐减弱。10 min后，量子点的荧光强度会达到一个稳定值。不同浓度的NAD+引起的CdTe量子点荧光强度的变化见图2，量子点的荧光强度随着NAD+的浓度的增加而降低。图中的插图为量子点荧光强度的比值I/I0（I是加入NAD+后量子点的荧光强度，I0是量子点的初始荧光值）与NAD+浓度关系的标准曲线。从上述实验结果可以看出，NAD+可以淬灭MPA CdTe的荧光，基于这个现象，可以采用量子点来检测GLDH。
3.2 荧光检测GLDH
GLDH以NAD+为辅酶，在体内催化谷氨酸生成α酮戊二酸的反应及其逆反应。将GLDH与L谷氨酸加入到含有NAD+的溶液中，NAD+会随着反应的进行而被消耗，氧化态的NAD+转变为还原态的NADH。如体系中预先加入了CdTe量子点，NAD+的减少会使之前被NAD+淬灭的CdTe量子点的荧光增强。基于此，设计了一种光学检测体系用于GLDH的检测。图3为量子点检测GLDH的实验原理。研究表明，NAD+在磷酸盐缓冲体系中不能发挥其淬灭CdTe量子点荧光的作用。图4是以pH 7.2的磷酸盐缓冲液作为溶剂，NAD+对CdTe量子点荧光的淬灭。从图4可见，CdTe量子点的荧光强度基本不发生变化。为了证明NAD+在磷酸盐缓冲液中是否发生分解，从而影响其对量子点荧光的淬灭作用，对比了分别用超纯水和磷酸盐缓冲液作为溶剂时NAD+的紫外 可见吸收光谱。图5中实线为NAD+在超纯水中的吸收谱图，虚线为NAD+在磷酸盐缓冲液中的吸收谱图。两条线是重合的，由此得出，NAD+在磷酸盐缓冲液中并没有发生分解。
为了解决上述问题，设计了两步法，将酶催化反应和荧光检测过程分别进行。第一步是GLDH酶的催化反应，将底物L谷氨酸、辅因子NAD+，及不同量的GLDH混合在PCR管中反应；第二步是将上述混合物分别加入到含有CdTe量子点的溶液中，混合5 min后，记录量子点的荧光强度为Ij，量子点的初始荧光值被记录为Ii（i，j= 0，10， 25， 50， 100， 250， 500， 750和1000 U/L）。图6展示了不同的GLDH对CdTe量子点荧光强度的恢复情况。在低浓度的GLDH时，因为只有少量NAD+会因为GLDH的酶催化反应被消耗，所以量子点荧光增强的程度很微弱。随着GLDH的增加，NAD+的量大大减少，量子点的荧光逐步恢复到初始强度。图6插图是反应产物加入前后量子点荧光强度的比值同GLDH浓度的关系。本实验检测的GLDH浓度范围为10～1000 U/L，这个区间在医学诊断上有重要的应用，可以根据GLDH浓度区分不同类型的肝损疾病。
从图6可见，随着GLDH浓度增加，量子点的荧光强度增强，而且超出了初始值。实验表明，GLDH本身也可以增强量子点的荧光，如图7所示。单独加入100 U/L GLDH会增加CdTe量子点的荧光强度，增强幅度接近2倍（I/I0=2，I0和I分别为加入GLDH前后的量子点荧光值）。而在酶促反应体系中，加入100 U/L GLDH、NAD+、谷氨酸，得到的I/I0=0.96，只约为单独GLDH增强作用1/2。这说明GLDH优先与NAD+发生反应，导致被NAD+猝灭的量子点荧光得到大部分的恢复，但低浓度的GLDH酶表现出明显的荧光增强作用。在酶促反应检测体系中，GLDH主要用于催化谷氨酸的脱氨反应而消耗NAD+，继续增加GLDH的含量，直至NAD+被反应消耗完全，酶催化反应结束，多余的GLDH进一步增强量子点的荧光，在采用高浓度的GLDH时，其荧光增强作用表现的比较明显，这与本实验现象吻合。
采用NAD+/GLDH体系，将量子点的独特的光学特性和酶的特异性、高效性相结合，实现了对GLDH简单、快速的检测。GLDH作为肝损伤的重要指标分子，在诊断不同的肝脏疾病中有重要的应用。本检测方法可以实现对GLDH较大浓度区间（10～1000 U/L）的测定，在临床中有潜在的应用价值。
References
1 Alivisatos A P.Science，1996， 271（5251）： 933-937
2 Bera D， Qian L， Tseng T K， Holloway P H.Materials， 2010， 3（4）： 2260-2345
3 Drbohlavova J， Adam V， Kizek R， Hubalek J.Int. J. Mol. Sci.， 2009， 10（2）： 656-673
4 Resch Resch U， Grabolle M， Cavaliere Jaricot， Nitschke R， Nann T.Nat. Methods， 2008， 5（9）： 763-775
5 Ghasemi Y， Peymani P， Afifi S.Acta Biomed.， 2009， 80（2）： 156-165
6 Jin T， Fujii F， Komai Y， Seki J， Seiyama A， Yishioka Y.Int. J. Mol. Sci.， 2008， 9（10）： 2044-2061
7 Smith A M， Gao X H， Nie S M.Photochemistry and Photobiology， 2004， 80（3）： 377-385
8 Gao X H， Cui Y Y， Levenson R M， Chung L W， Nie S M.Nat. Biotechnol.， 2004， 22（8）： 969-976
9 ZENG Qing Hui， ZHANG You Lin， DU Chuang， SONG Kai， SUN Ya Juan， LIU Xiao Min， KONG Xiang Gui.Chem. J. Chinese Universities， 2009， 30（6）： 1158-1161
曾庆辉， 张友林， 杜 创， 宋 凯， 孙雅娟， 刘晓敏， 孔祥贵. 高等学校化学学报， 2009， 30（6）： 1158-1161
10 ZHANG Peng Fei， SONG Jie， CHEN Jia， LU Hui Qi， HAN Huan Xing.Chinese J. Anal. Chem.，2013， 41（6）： 846-850
张鹏飞， 宋 杰， 陈 佳， 陆慧琦， 韩焕兴. 分析化学， 2013， 41（6）： 846-850
11 HAI Hong， YANG Feng， LI Jian Ping.Chinese J. Anal. Chem.，2012， 40（6）： 841-846
海 洪， 杨 峰， 李建平. 分析化学， 2012， 40（6）： 841-846
12 Smith A M， Dave S， Nie S， True L， Gao X H.Expert Rev. Mol. Diagn.， 2006， 6（2）： 231-244
13 Yan Y， Wang S H， Liu Z W， Wang H Y， Huang D J.Anal. Chem.， 2010， 82（23）： 9775-9781
14 Yan X Q， Shang Z B， Zhang Z， Wang Y， Jin W J.Luminescence， 2009， 24（4）： 255-259
15 Wang S H， Han M Y， Huang D J.J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（33）： 11692-11694
16 Zhang F， Ali Z， Amin F， Riedinger A， Parak W J.Anal. Bioanal. Chem.， 2010， 397（3）： 935-942
17 Yu Z， Schmaltz R M， Bozeman T C， Paul R， Rishel M J， Tsosie K S， Hecht S M.J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（8）： 2883-2886
18 Chen Y J， Yan X P.Small， 2009， 5（17）： 2012-2018
19 Yu Z， Kabashima T， Tang C， Shibata T， Kitazato K， Kobayashi N， Lee M K， Kai M.Anal Biochem.， 2010， 397（2）： 197-201
20 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R， Kramer K.Lab Anim.， 2002， 36（3）： 313-321
21 Ozer J， Ratner M， Shaw M.Toxicology， 2008， 245（3）： 194-205
22 SONG Zheng Yu， CAI Jun.Chinese Journal of Medical Laboratory Technology， 2005， 6（2）： 114-115
宋振玉， 蔡 军. 中国医学检验杂志， 2005， 6（2）： 114-115
23 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R.Laboratory Animals， 2002， 36（3）： 313-321
24 KabashimaT， Yu Z， Tang C， Nakagawa Y， Okumura K， ShibataT， Lu J， Kai M.Peptides， 2008， 29（3）： 356-363
25 Zhang K， Zhou H B， Wang S H， Guan G J， Liu R Y， Zhang J， Zhang Z P.J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（22）： 8424-8427
15 Wang S H， Han M Y， Huang D J.J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（33）： 11692-11694
16 Zhang F， Ali Z， Amin F， Riedinger A， Parak W J.Anal. Bioanal. Chem.， 2010， 397（3）： 935-942
17 Yu Z， Schmaltz R M， Bozeman T C， Paul R， Rishel M J， Tsosie K S， Hecht S M.J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（8）： 2883-2886
18 Chen Y J， Yan X P.Small， 2009， 5（17）： 2012-2018
19 Yu Z， Kabashima T， Tang C， Shibata T， Kitazato K， Kobayashi N， Lee M K， Kai M.Anal Biochem.， 2010， 397（2）： 197-201
20 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R， Kramer K.Lab Anim.， 2002， 36（3）： 313-321
21 Ozer J， Ratner M， Shaw M.Toxicology， 2008， 245（3）： 194-205
22 SONG Zheng Yu， CAI Jun.Chinese Journal of Medical Laboratory Technology， 2005， 6（2）： 114-115
宋振玉， 蔡 军. 中国医学检验杂志， 2005， 6（2）： 114-115
23 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R.Laboratory Animals， 2002， 36（3）： 313-321
24 KabashimaT， Yu Z， Tang C， Nakagawa Y， Okumura K， ShibataT， Lu J， Kai M.Peptides， 2008， 29（3）： 356-363
25 Zhang K， Zhou H B， Wang S H， Guan G J， Liu R Y， Zhang J， Zhang Z P.J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（22）： 8424-8427
15 Wang S H， Han M Y， Huang D J.J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（33）： 11692-11694
16 Zhang F， Ali Z， Amin F， Riedinger A， Parak W J.Anal. Bioanal. Chem.， 2010， 397（3）： 935-942
17 Yu Z， Schmaltz R M， Bozeman T C， Paul R， Rishel M J， Tsosie K S， Hecht S M.J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（8）： 2883-2886
18 Chen Y J， Yan X P.Small， 2009， 5（17）： 2012-2018
19 Yu Z， Kabashima T， Tang C， Shibata T， Kitazato K， Kobayashi N， Lee M K， Kai M.Anal Biochem.， 2010， 397（2）： 197-201
20 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R， Kramer K.Lab Anim.， 2002， 36（3）： 313-321
21 Ozer J， Ratner M， Shaw M.Toxicology， 2008， 245（3）： 194-205
22 SONG Zheng Yu， CAI Jun.Chinese Journal of Medical Laboratory Technology， 2005， 6（2）： 114-115
宋振玉， 蔡 军. 中国医学检验杂志， 2005， 6（2）： 114-115
23 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R.Laboratory Animals， 2002， 36（3）： 313-321
24 KabashimaT， Yu Z， Tang C， Nakagawa Y， Okumura K， ShibataT， Lu J， Kai M.Peptides， 2008， 29（3）： 356-363
25 Zhang K， Zhou H B， Wang S H， Guan G J， Liu R Y， Zhang J， Zhang Z P.J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（22）： 8424-8427
摘 要 建立了荧光增强型量子点探针检测痕量谷氨酸脱氢酶（GLDH）的方法， GLDH是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的酶分子，具有氧化性的NAD+通过电子转移淬灭CdTe量子点的荧光，而GLDH催化的生物化学反应可以消耗NAD+。 在所采用的NAD+/GLDH体系中，量子点的荧光先被NAD+淬灭，加入GLDH消耗NAD+，荧光会因NAD+的减少而增强。利用这种高选择性的酶促反应可以检测浓度范围比较宽的GLDH（10～1000 U/L）。对于这个浓度范围GLDH的检测在临床上有重要意义，可用于诊断不同类型的肝脏疾病。
关键词 荧光分析法； 量子点； 谷氨酸脱氢酶； NAD； 肝损伤
1 引 言
基于半导体纳米颗粒的量子点因其独特的电子性质和光学特性已被用于许多领域的研究中[1，2]，其具有较宽的吸收光谱、较窄的发射谱带和抗光漂白特性。这些优点使其适用于生物学的研究，例如体外成像[3～7]、体内跟踪[8，9]，生物分析[9]和生物传感器的研究[10，11]。 近年来，已有多种基于荧光分子探针和量子点的生物传感器用于不同分析物的检测，如检测金属离子（Ag+， Cu2+， Pb2+）、活性小分子（NO和HClO）、生物活性大分子（DNA、蛋白质、酶）等[12～19]。
本研究利用CdTe量子点检测谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase， GLDH）。GLDH是线粒体酶，存在于所有组织的细胞中，其中以肝脏细胞线粒体内的GLDH活性最高，当肝细胞发生损害时，GLDH会进入血液，因此临床上通过测定血清GLDH的含量作为诊断肝细胞损伤病变的指标分子[20]。同其它用于诊断肝疾病的标记分子，如ALT， AST， SDH， ALP[21，22]相比，GLDH的特异性更高，肝细胞发生损伤时GLDH上升量更多，因此对肝细胞损伤的诊断更为灵敏[23]。现有的用于检测GLDH的方法有比色法、分光光度法及酶联免疫吸附法（ELISA）。这些方法存在灵敏度低、假阳性等缺陷。基于增强型荧光体系的分析方法主要基于荧光共振能量转移和光诱导电子转移两种机理，其灵敏度高、干扰少，因此是检测多肽和酶等生物分子的有效技术[24]。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Perkin Elmer LS 55荧光光谱仪测定（美国PE公司）。Shimadzu UV 2550光谱仪（日本岛津公司）。
3 巯基丙酸（3 Mercaptopropionic acid， MPA）和谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase， GLDH，type II）购自Sigma公司；碲粉（Tellurium）、L谷氨酸（Lglutamate）、NaHB4、CdCl2·2.5H2O（国药集团化学公司）。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+，上海生工有限公司）。所有试剂都是分析纯，未经纯化直接使用。超纯水（18.2 MΩ
SymbolWC@ cm）来自于Millipore纯水系统（美国Millipore公司）。
2.2 实验方法
MPA CdTe量子点是通过对文献＼[25] 的方法改进合成得到的。将0.0319 g碲粉和0.05 g NaHB4加入到通N2保护的超纯水中，形成黑色的混合液，混合液在冰浴中搅拌直至液体澄清；将0.2284 g CdCl2·2.5H2O和0.21 mL 3 巯基丙酸（MPA）溶解在超纯水中，用NaOH将溶液调至pH=9，溶液通入N2除O2；向碲粉和NaHB4的混合液中加入适量0.5 mol/L H2SO4，产生白色的H2Te气体，将H2Te气体通入到CdCl2
SymbolWC@ 溶液中，搅拌20 min，通过控制回流时间可以得到不同尺寸的CdTe量子点。回流约1 h就得到绿色的CdTe量子点。制备好的量子点用丙酮进行纯化。
检测过程如下： 首先将8 μL 绿色量子点溶解在2 mL超纯水中，混匀后测量其荧光强度，记录为I0。加入不同浓度的NAD+（0～14.71 μmol/L）， 10 min后，测量混合液的荧光强度，记录为I， 从而得到量子点荧光强度猝灭不同百分比所需要的NAD+浓度。GLDH的检测顺序：根据前面的实验结论，确定辅因子NAD+的固定用量，并与相同量的底物L谷氨酸混合，再加入不同量的GLDH，在25 ℃水浴下反应10 min。 将反应混合液分别加入到CdTe量子点溶液中，5 min后测量荧光强度，记录为Ij （j表示谷氨酸脱氢酶（GLDH）的浓度，j=0， 10， 25， 50， 100， 250， 500， 750和1000 U/L）。所有的荧光光谱都用400 nm波长激发，扫描范围为450～650 nm，扫描速度为500 nm/min。
3 结果与讨论
3.1 NAD+对MPA CdTe量子点荧光的淬灭
NAD+可以通过电子转移途径有效淬灭量子点的荧光。NAD+对量子点荧光的淬灭随着时间的变化关系见图1。NAD+的加入会引起CdTe量子点的荧光强度的降低，随着作用时间的增长，量子点的荧光强度也会逐渐减弱。10 min后，量子点的荧光强度会达到一个稳定值。不同浓度的NAD+引起的CdTe量子点荧光强度的变化见图2，量子点的荧光强度随着NAD+的浓度的增加而降低。图中的插图为量子点荧光强度的比值I/I0（I是加入NAD+后量子点的荧光强度，I0是量子点的初始荧光值）与NAD+浓度关系的标准曲线。从上述实验结果可以看出，NAD+可以淬灭MPA CdTe的荧光，基于这个现象，可以采用量子点来检测GLDH。
3.2 荧光检测GLDH
GLDH以NAD+为辅酶，在体内催化谷氨酸生成α酮戊二酸的反应及其逆反应。将GLDH与L谷氨酸加入到含有NAD+的溶液中，NAD+会随着反应的进行而被消耗，氧化态的NAD+转变为还原态的NADH。如体系中预先加入了CdTe量子点，NAD+的减少会使之前被NAD+淬灭的CdTe量子点的荧光增强。基于此，设计了一种光学检测体系用于GLDH的检测。图3为量子点检测GLDH的实验原理。研究表明，NAD+在磷酸盐缓冲体系中不能发挥其淬灭CdTe量子点荧光的作用。图4是以pH 7.2的磷酸盐缓冲液作为溶剂，NAD+对CdTe量子点荧光的淬灭。从图4可见，CdTe量子点的荧光强度基本不发生变化。为了证明NAD+在磷酸盐缓冲液中是否发生分解，从而影响其对量子点荧光的淬灭作用，对比了分别用超纯水和磷酸盐缓冲液作为溶剂时NAD+的紫外 可见吸收光谱。图5中实线为NAD+在超纯水中的吸收谱图，虚线为NAD+在磷酸盐缓冲液中的吸收谱图。两条线是重合的，由此得出，NAD+在磷酸盐缓冲液中并没有发生分解。
为了解决上述问题，设计了两步法，将酶催化反应和荧光检测过程分别进行。第一步是GLDH酶的催化反应，将底物L谷氨酸、辅因子NAD+，及不同量的GLDH混合在PCR管中反应；第二步是将上述混合物分别加入到含有CdTe量子点的溶液中，混合5 min后，记录量子点的荧光强度为Ij，量子点的初始荧光值被记录为Ii（i，j= 0，10， 25， 50， 100， 250， 500， 750和1000 U/L）。图6展示了不同的GLDH对CdTe量子点荧光强度的恢复情况。在低浓度的GLDH时，因为只有少量NAD+会因为GLDH的酶催化反应被消耗，所以量子点荧光增强的程度很微弱。随着GLDH的增加，NAD+的量大大减少，量子点的荧光逐步恢复到初始强度。图6插图是反应产物加入前后量子点荧光强度的比值同GLDH浓度的关系。本实验检测的GLDH浓度范围为10～1000 U/L，这个区间在医学诊断上有重要的应用，可以根据GLDH浓度区分不同类型的肝损疾病。
从图6可见，随着GLDH浓度增加，量子点的荧光强度增强，而且超出了初始值。实验表明，GLDH本身也可以增强量子点的荧光，如图7所示。单独加入100 U/L GLDH会增加CdTe量子点的荧光强度，增强幅度接近2倍（I/I0=2，I0和I分别为加入GLDH前后的量子点荧光值）。而在酶促反应体系中，加入100 U/L GLDH、NAD+、谷氨酸，得到的I/I0=0.96，只约为单独GLDH增强作用1/2。这说明GLDH优先与NAD+发生反应，导致被NAD+猝灭的量子点荧光得到大部分的恢复，但低浓度的GLDH酶表现出明显的荧光增强作用。在酶促反应检测体系中，GLDH主要用于催化谷氨酸的脱氨反应而消耗NAD+，继续增加GLDH的含量，直至NAD+被反应消耗完全，酶催化反应结束，多余的GLDH进一步增强量子点的荧光，在采用高浓度的GLDH时，其荧光增强作用表现的比较明显，这与本实验现象吻合。
采用NAD+/GLDH体系，将量子点的独特的光学特性和酶的特异性、高效性相结合，实现了对GLDH简单、快速的检测。GLDH作为肝损伤的重要指标分子，在诊断不同的肝脏疾病中有重要的应用。本检测方法可以实现对GLDH较大浓度区间（10～1000 U/L）的测定，在临床中有潜在的应用价值。
References
1 Alivisatos A P.Science，1996， 271（5251）： 933-937
2 Bera D， Qian L， Tseng T K， Holloway P H.Materials， 2010， 3（4）： 2260-2345
3 Drbohlavova J， Adam V， Kizek R， Hubalek J.Int. J. Mol. Sci.， 2009， 10（2）： 656-673
4 Resch Resch U， Grabolle M， Cavaliere Jaricot， Nitschke R， Nann T.Nat. Methods， 2008， 5（9）： 763-775
5 Ghasemi Y， Peymani P， Afifi S.Acta Biomed.， 2009， 80（2）： 156-165
6 Jin T， Fujii F， Komai Y， Seki J， Seiyama A， Yishioka Y.Int. J. Mol. Sci.， 2008， 9（10）： 2044-2061
7 Smith A M， Gao X H， Nie S M.Photochemistry and Photobiology， 2004， 80（3）： 377-385
8 Gao X H， Cui Y Y， Levenson R M， Chung L W， Nie S M.Nat. Biotechnol.， 2004， 22（8）： 969-976
9 ZENG Qing Hui， ZHANG You Lin， DU Chuang， SONG Kai， SUN Ya Juan， LIU Xiao Min， KONG Xiang Gui.Chem. J. Chinese Universities， 2009， 30（6）： 1158-1161
曾庆辉， 张友林， 杜 创， 宋 凯， 孙雅娟， 刘晓敏， 孔祥贵. 高等学校化学学报， 2009， 30（6）： 1158-1161
10 ZHANG Peng Fei， SONG Jie， CHEN Jia， LU Hui Qi， HAN Huan Xing.Chinese J. Anal. Chem.，2013， 41（6）： 846-850
张鹏飞， 宋 杰， 陈 佳， 陆慧琦， 韩焕兴. 分析化学， 2013， 41（6）： 846-850
11 HAI Hong， YANG Feng， LI Jian Ping.Chinese J. Anal. Chem.，2012， 40（6）： 841-846
海 洪， 杨 峰， 李建平. 分析化学， 2012， 40（6）： 841-846
12 Smith A M， Dave S， Nie S， True L， Gao X H.Expert Rev. Mol. Diagn.， 2006， 6（2）： 231-244
13 Yan Y， Wang S H， Liu Z W， Wang H Y， Huang D J.Anal. Chem.， 2010， 82（23）： 9775-9781
14 Yan X Q， Shang Z B， Zhang Z， Wang Y， Jin W J.Luminescence， 2009， 24（4）： 255-259
15 Wang S H， Han M Y， Huang D J.J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（33）： 11692-11694
16 Zhang F， Ali Z， Amin F， Riedinger A， Parak W J.Anal. Bioanal. Chem.， 2010， 397（3）： 935-942
17 Yu Z， Schmaltz R M， Bozeman T C， Paul R， Rishel M J， Tsosie K S， Hecht S M.J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（8）： 2883-2886
18 Chen Y J， Yan X P.Small， 2009， 5（17）： 2012-2018
19 Yu Z， Kabashima T， Tang C， Shibata T， Kitazato K， Kobayashi N， Lee M K， Kai M.Anal Biochem.， 2010， 397（2）： 197-201
20 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R， Kramer K.Lab Anim.， 2002， 36（3）： 313-321
21 Ozer J， Ratner M， Shaw M.Toxicology， 2008， 245（3）： 194-205
22 SONG Zheng Yu， CAI Jun.Chinese Journal of Medical Laboratory Technology， 2005， 6（2）： 114-115
宋振玉， 蔡 军. 中国医学检验杂志， 2005， 6（2）： 114-115
23 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R.Laboratory Animals， 2002， 36（3）： 313-321
24 KabashimaT， Yu Z， Tang C， Nakagawa Y， Okumura K， ShibataT， Lu J， Kai M.Peptides， 2008， 29（3）： 356-363
25 Zhang K， Zhou H B， Wang S H， Guan G J， Liu R Y， Zhang J， Zhang Z P.J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（22）： 8424-8427
15 Wang S H， Han M Y， Huang D J.J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（33）： 11692-11694
16 Zhang F， Ali Z， Amin F， Riedinger A， Parak W J.Anal. Bioanal. Chem.， 2010， 397（3）： 935-942
17 Yu Z， Schmaltz R M， Bozeman T C， Paul R， Rishel M J， Tsosie K S， Hecht S M.J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（8）： 2883-2886
18 Chen Y J， Yan X P.Small， 2009， 5（17）： 2012-2018
19 Yu Z， Kabashima T， Tang C， Shibata T， Kitazato K， Kobayashi N， Lee M K， Kai M.Anal Biochem.， 2010， 397（2）： 197-201
20 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R， Kramer K.Lab Anim.， 2002， 36（3）： 313-321
21 Ozer J， Ratner M， Shaw M.Toxicology， 2008， 245（3）： 194-205
22 SONG Zheng Yu， CAI Jun.Chinese Journal of Medical Laboratory Technology， 2005， 6（2）： 114-115
宋振玉， 蔡 军. 中国医学检验杂志， 2005， 6（2）： 114-115
23 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R.Laboratory Animals， 2002， 36（3）： 313-321
24 KabashimaT， Yu Z， Tang C， Nakagawa Y， Okumura K， ShibataT， Lu J， Kai M.Peptides， 2008， 29（3）： 356-363
25 Zhang K， Zhou H B， Wang S H， Guan G J， Liu R Y， Zhang J， Zhang Z P.J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（22）： 8424-8427
15 Wang S H， Han M Y， Huang D J.J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（33）： 11692-11694
16 Zhang F， Ali Z， Amin F， Riedinger A， Parak W J.Anal. Bioanal. Chem.， 2010， 397（3）： 935-942
17 Yu Z， Schmaltz R M， Bozeman T C， Paul R， Rishel M J， Tsosie K S， Hecht S M.J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（8）： 2883-2886
18 Chen Y J， Yan X P.Small， 2009， 5（17）： 2012-2018
19 Yu Z， Kabashima T， Tang C， Shibata T， Kitazato K， Kobayashi N， Lee M K， Kai M.Anal Biochem.， 2010， 397（2）： 197-201
20 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R， Kramer K.Lab Anim.， 2002， 36（3）： 313-321
21 Ozer J， Ratner M， Shaw M.Toxicology， 2008， 245（3）： 194-205
22 SONG Zheng Yu， CAI Jun.Chinese Journal of Medical Laboratory Technology， 2005， 6（2）： 114-115
宋振玉， 蔡 军. 中国医学检验杂志， 2005， 6（2）： 114-115
23 Brien P J， Slaughter M R， Polley S R.Laboratory Animals， 2002， 36（3）： 313-321
24 KabashimaT， Yu Z， Tang C， Nakagawa Y， Okumura K， ShibataT， Lu J， Kai M.Peptides， 2008， 29（3）： 356-363
25 Zhang K， Zhou H B， Wang S H， Guan G J， Liu R Y， Zhang J， Zhang Z P.J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（22）： 8424-8427
