多抗转基因马铃薯植株的获得及农杆菌介导试管薯遗传转化体系优化

    齐恩芳 贾小霞 刘石 陈晓艳 黄伟 刘世海

    

    

    

    摘要：以马铃薯品种陇薯11号试管薯为受体材料，通过农杆菌介导法，将PVX、PVS、PVY和PLRV 4种病毒CP融合基因导入马铃薯，并对影响遗传转化的因素进行了优化。结果表明，薯片分化和生根阶段的选择压分别为Kan 50、75 mg/L，薯片分化和生根阶段有效抑菌浓度分别为Cb 500、200 mg/L，农杆菌活化时间为4.5 h、侵染时间为7 min、共培养时间为2 d时利于遗传转化。通过该体系将4种病毒CP融合基因导入马铃薯，获得了具卡那霉素抗性的转化植株，经PCR检测，外源基因已导入马铃薯基因组中。

    关键词：马铃薯;试管薯;农杆菌介导;遗传转化

    中图分类号：S532? ? ? ? ?文献标志码：A? ? ? ? ?文章编号：1001-1463（2020）11-0001-06

    doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.11.001

    Abstract：The CP fusion genes of PVX， PVS， PVY and PLRV were transferred into Longshu 11 test tube potato through the agrobacterium-mediated method， and condtions of which was also optimized. The results showed the optimal Kan selective concentration is 50 mg/L and 75 mg/L for potato chip differentiation and root germination respectively， and Cb is 500 mg/L and 200 mg/L. The optimal transformation conditions： agrobacterium should be actived for 4.5 hours， transfection for 7 minutes， and co-cultivation time for 2 days， it was beneficial to genetic transformation. Via this system， four viral CP fusion gene were introduced into potatoes， and later transformed plants with kanamycin resistance were obtained. PCR detection confirmed the fusion gene had been successfully introduced into those potato genome.

    Key words：Potato;Tube potato;Agrobacterium mediated;Genetic transformation

    馬铃薯是一种产量高、适应性强、分布广、营养丰富、经济价值高的宜粮、宜菜、宜饲、宜作工业原料的经济作物[1 - 2 ]。马铃薯在生长期间易受多种病毒的危害，病毒侵染造成马铃薯种质退化，产量严重降低。迄今为止，几乎没有有效的化学药剂来防治病毒病，目前解决马铃薯退化的有效途径是组培脱毒，但该法成本高且工作量大，不能解决病毒的再侵染问题，能维护无毒或低毒的有效期不长，2～3 a后产量又会严重下降。马铃薯是同源四倍体作物，若采用常规方法选育抗病毒品种，则存在天然抗性基因资源缺乏，且育种周期长、抗性基因的遗传不稳定以及远缘杂交种间障碍等问题。马铃薯抗病毒基因工程的发展解决了这一难题，通过基因工程改良马铃薯品种具有基因明确、产物已知、目标具体、准确快速、可预见性强等优势，且马铃薯是无性繁殖植物，转基因植株无性后代不发生分离，给转基因植株的检测、鉴定带来诸多方便。

    建立高效的遗传转化体系对于获得转基因植株至关重要。在马铃薯遗传转化中以叶片、茎段、薯片作为受体已广泛应用，其中试管薯片作为受体材料伤口面积大，且薯块本身含有较高含量的酚类物质，有助于农杆菌的侵染和转化[3 - 5 ]，不经愈伤化可直接诱导芽再生。薯片转化过程中不需要预培养，操作简单方便，周期短，但针对不同基因型转化的适宜条件有一定差异。我们以马铃薯品种陇薯11号脱毒试管苗为材料，采用农杆菌菌株LBA4404为介导，将PVX、PVS、PVY和PLRV 4种病毒外壳蛋白融合基因导入马铃薯，并通过对选择压、抗菌素浓度、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间等因素进行选择，建立了一套优化的高效转化体系。

    1? ?材料与方法

    1.1? ?试验材料

    供试材料为马铃薯品种陇薯11号脱毒苗，由甘肃省农业科学院马铃薯研究所种质资源与生物技术研究室提供。供试菌株LBA4404含有质粒pART27-XSYV-rh（甘肃省马铃薯种质资源创新工程实验室构建）[6 ]，pART27- XSYV-rh含4 种病毒（PVX、PVS、PVY 和 PLRV）CP基因片段，抗性标记为卡拉霉素（Kan）。DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、植物总RNA提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司。培养基基础成分、植物激素、抗生素、添加剂均购自美国Sigma 公司。其他试剂均为国产分析纯。

    1.2? ?培养基

    YEP液体培养基为10 g/L酵母提取物+ 10 g/L蛋白胨+5 g/L牛肉膏。试管薯诱导培养基为MS培养基+6-苄氨基嘌呤（6-BA）5 mg/L。试管薯片分化培养基为MS培养基+吲哚乙酸（IAA）1.0 mg/L+赤霉素（GA3）0.2 mg/L+6-苄氨基嘌呤（6-BA）0.5 mg/L+玉米素核苷（ZT）2.0 mg/L。生根培养基为1/2 MS培养基。

    1.3? ?转化外植体的获得

    将陇薯11号试管苗在MS固体培养基上培养21 d，長成壮苗后用于诱导试管薯。参照“固体+液体”的方法诱导试管苗结薯[7 ]。

    1.4? ?遗传转化体系优化

    1.4.1? ? 诱导芽与生根选择压确定? ? 无菌条件下取直径约为0.5 cm的陇薯11号试管薯，切成厚度为2 mm左右的薄片，分别接种于附加0、25、50、75、100 mg/L 卡拉霉素（Kanamycin，Kan）的试管薯片分化培养基中，每处理接种20块，3次重复，间隔14 d继代1次，接种28 d后观察薯片生长情况并统计出芽率，确定抑制芽分化的最低Kan浓度。将陇薯11号试管苗剪成带2个腋芽的茎段，分别接到含Kan浓度0、25、50、75、100 mg/L的生根培养基中，3个重复，21 d后观察并记录生根状况，确定抑制生根最适Kan浓度。

    1.4.2? ? 农杆菌工程菌生长曲线? ? 挑取农杆菌菌种，接种于含Kan 50 mg/L、链霉素（Streptomycin，Str）50 mg/L和利福平（Rifampicin，Rif）20 mg/L的YEP平板上，置28 ℃暗培养，2 d后挑取单菌落放入5 mL含有同样抗生素的YEP液体培养基中，于28 ℃、260 rpm条件下避光振荡培养约24～36 h。将活化好的菌液按1∶50放大培养（即取1 mL活化好的菌液加入到50 mL含Kan 50 mg/L、Str 50 mg/L、Rif 20 mg/L的YEP液体培养基中，再置于28 ℃恒温摇床，260 rpm条件下避光振荡培养），分别设1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 h共13个时间梯度，每个时间段各取2 mL菌液，在波长600 nm下用分光光度计测定其紫外吸收值OD600，每处理3次重复，用未加菌液的YEP液体培养基调零，计算3次重复样品的OD600平均值，最终确定农杆菌达到对数生长期所需的摇菌时间（即OD600=0.5左右的临界点）。

    1.4.3? ? 侵染时间? ? 用OD600=0.5的农杆菌菌液侵染薯片，侵染时间设为3、5、7、9、11、13、15 min，接种于试管薯片分化培养基上，每个培养皿20块，每处理3次重复，20 d后统计薯块出芽率、污染率及褐化率。

    出芽率=（出抗性芽薯块数/接种薯块总数）×100%

    污染率=（污染的薯块数/接种薯块总数）×100%

    褐化率=（褐化的薯块数/接种薯块总数）×100%

    1.4.4? ? 共培养时间? ? 选择侵染7 min的处理置于28 ℃、黑暗条件下共培养，共培养时间设为1、2、3、4 d，30 d后观察薯块生长状态，统计出芽率。

    1.4.5? ? 抑菌剂浓度? ? 将共培养后的薯块分别转接到附加羧苄青霉素（Carbenicillin，Cb）100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的试管薯片分化培养基中，光照时间为14 h/d，培养温度为（25±2） ℃，7 d后观察农杆菌溢出情况。将分化出的芽分别转接到附加Cb 100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的生根培养基中，7 d后观察农杆菌溢出情况。

    1.5? ?转基因植株鉴定

    采用CTAB法提取待检测植株和对照植株叶片总DNA，参照贾小霞等[8 ]的方法对转基因马铃薯植株进行PCR鉴定。以非转基因马铃薯植株为阴性对照，pART27- XSYV-rh质粒为阳性对照。反应程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 60 s，循环35次，72 ℃ 10 min。取5 uL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，分离并观察扩增产物。

    2? ?结果与分析

    2.1? ?Kan浓度对试管薯片芽分化及生根的影响

    观察发现，试管薯片在芽分化培养基上培养14～21 d后，不加Kan的薯片直接分化长出绿色健壮小芽。Kan浓度为25 mg/L时，薯片增厚、变大、颜色鲜绿，分化出芽情况与不加Kan无明显差异;Kan浓度为50 mg/L时，薯片稍有膨大，颜色暗绿，不能分化出芽;Kan浓度为75 mg/L时，部分薯片膨大，颜色发暗，褐化严重;Kan浓度为100 mg/L时，薯片全部褐化死亡。因此确定芽诱导时Kan浓度为50 mg/L。

    在抗性芽生根阶段仍需要加入Kan，以防止产生大量假阳性植株。接种28 d后，不加Kan的植株生长旺盛，根系发达，而加入Kan的处理虽然也有植株生长，但是随着Kan浓度的增加生根受限。Kan浓度为25 mg/L时，植株生根正常;Kan浓度为50 mg/L时，能正常生根，但植株生长缓慢;Kan浓度为75 mg/L时，部分植株生根，叶片发黄;Kan浓度为100 mg/L时，几乎没有根系，叶片全部发黄。因此确定生根时 Kan浓度为75 mg/L。

    2.2? ?农杆菌工程菌活化时间确定

    农杆菌液活化时间对于遗传转化的效果至关重要，活化时间短，菌液浓度过低，不利于侵染，转化率较低，菌液浓度过高，容易使薯片伤口褐化死亡。从含有质粒pART27-XSYV-rh的农杆菌LBA4404- pART27- XSYV- rh的生长曲线测定结果（表1）。可以看出，活化培养时间为4.5 h左右时农杆菌生长最快。

    2.3? ?侵染时间对转化的影响

    侵染时间影响转化效率，时间太短不利于农杆菌的附着，时间过长，容易导致菌的滋生，溢出的菌液会过多而无法控制，下一步除菌时不容易清除干净，易导致薯片褐化死亡。通过表2可以看出，侵染时间为7 min时出芽率达到50.0%，褐化率、污染率相对较低，因此选择侵染7 min为转化条件。

    2.4? ?共培养时间对转化的影响

    共培养时间对薯块诱导出芽有很大影响，随着共培养时间的延长，污染加重，出芽率下降。可能是因为农杆菌与外植体共培养的时间过长，农杆菌过度繁殖使其生长速率远远超过外植体细胞的分裂分化能力，致使外植体发生重度感染而出现软腐现象，最终失去再生愈伤能力。通过表3可以看出，试管薯块最佳共培养时间为2 d时最佳，出芽率达到75.0%，污染率为10.0%。

    2.5? ?Cb对转化的影响

    抗性愈伤筛选过程中需要及时去除农杆菌，否则整个外植体将会腐烂致死，无法再生，严重影响转化。为了抑制和杀死农杆菌菌株，需要在抗性愈伤筛选过程中加入一定浓度的抗生素。不同抗生素对农杆菌的抑制效果不同，同种抗生素不同浓度对农杆菌的抑制效果也不同。在芽分化和生根阶段加入不同浓度Cb的结果（表4）表明，当Cb浓度为500 mg/L时，才能有效抑制薯块芽分化阶段的农杆菌溢出，植株生长表面无不良反应，生长变慢，但基本上不影响出芽;而在生根阶段，Cb浓度为200 mg/L时就能很好地抑制农杆菌的溢出，不影响植株生长。

    2.6? ?转基因植株的PCR检测

    试管薯薄片分化出芽后（图1A），待抗性芽长至1～2 cm时剪下接入附加有Kan 75 mg/L 和Cb 200 mg/L 的生根培养基上培养，14 d后生根生长则继续转接，经3次相同浓度Kan抗性生根筛选后，获得正常生长的20株抗性植株（图1B）。PCR扩增产物的电泳分析结果（图2）表明，6株抗性苗DNA能扩增出分子量约为1 200 bp左右的特异性目的片段，而非转化植株未扩增出相应条带，初步证明这6株再生植株为转基因植株。

    3? ?小结与讨论

    农杆菌介导马铃薯遗传转化方法已广泛应用，但针对不同的基因型、不同的外植体，转化效果差异仍很大，要根据具体基因型和外植体进行优化选择。作为遗传转化的受体材料，必须具备来源充足、再生频率高、再生稳定、遗传稳定性好、培养时间短和对标记选择性抗生素敏感等特点[9 ]。在马铃薯的遗传转化体系中，以茎段、叶片、块茎和试管薯为受体的Ti质粒转化均已获得成功。李晶等[10 ]对马铃薯再生培养基、基因型、外植体类型进行了系统筛选，将几丁质酶（chi）基因成功导入马铃薯东农303;邢小萍[11 ]以叶盘、茎段、叶柄为外植体，将抗菌肽基因导入马铃薯甘农薯 1号，并对影响转化效率的主要条件进行了筛选;尤佳 等[12 ]用马铃薯栽培品种陇薯3号和甘农薯2号试管薯为外植体，获得了转基因植株;李珺等[13 ]用蜡质马铃薯突变植株的茎段作为外植体，获得了转基因植株，其转化率约为34%。本试验以马铃薯品种“陇薯11号”试管薯为外植体，通过根癌农杆菌介导的方法成功转化马铃薯，并对遗传转化体系中关键因素进行了优化。

    在植物转化过程中，既能够有效地去除农杆菌侵染所造成的污染又要不影响植株正常生长，同时又能够有效选择出转基因阳性植株。此过程涉及抗生素种类和浓度的正确选择过程，该阶段也是转化试验顺利进行的一个前提条件。抑菌素种类的选用与农杆菌的类型有关，有研究表明Cb对多个农杆菌菌株都有较强的抑制作用[13 ]。本试验选用Cb来抑制遗传转化过程中农杆菌的滋生，在芽分化和生根阶段分别用Cb 500 mg/L和200 mg/L来抑制农杆菌的生长，与张宁等[4 ]、尤佳等[12 ]的研究结果一致。因为本试验选用的载体pBI121所含的选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因（npt-Ⅱ），该基因为Kan抗性基因，其转化的组织或器官能在含有一定浓度的Kan培养基上生长，反之未被转化的组织或器官将会死亡。试验选用Kan 50 mg/L 作为芽分化阶段的筛选压力，选用Kan 75 mg/L作为生根阶段筛选压力。侵染和共培养时间在遗传转化中举足轻重，侵染时间太短，共培养时无农杆菌生长，转化失败;侵染时间太长，常因农杆菌毒害缺氧而软腐，确定农杆菌活化时间为4.5 h，薯块侵染时间为7 min，有助于减轻后续培养中细菌对植物的毒害作用，提高转化效率。共培养过程是为了使农杆菌能够很好地在外植体上附着，在恰当的时间将质粒T-DNA转移到外植体的细胞中，从而完成转化过程。最佳共培养时间的确定是为了使农杆菌附着外植体表面后有足够的时间在创伤部位诱发肿瘤，因此共培养时间不能太短;若共培养时间过长则会由于农杆菌的过度生长而使外植体受到毒害死亡，即便不死亡也会在后续培养中难以控制。本试验确定共培养时间为2 d，此时外植体周围刚出现白色菌落，选择这个时间既能提高转化效率，又易去除农杆菌。

    参考文献：

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    （本文责编：陈? ? 伟）