高效液相色谱 电感耦合等离子质谱法分析雄黄在大鼠脏器中代谢的砷形态
陈绍占+杜振霞+刘丽萍+姜泓
摘 要 采用HPLC ICP MS 联用技术建立了大鼠脏器中AsB， As， MMA， DMA和As等砷形态的分析方法。采用超声水浴提取对样品进行前处理，Dionex IonPac AS19 阴离子交换柱，20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH 9.7）为流动相，对雄黄染毒后大鼠肝肾中的砷形态进行分析。实验表明，方法不受40Ar35Cl+干扰，常见的5 种砷形态化合物的线性范围为1～300 μg/L，相关系数（R2）均大于0.999，检出限为0.3～0.5 （μg/L）， RSD 均小于5%，加标回收率为83.8%～111.7%。通过对肝肾的形态分析，表明经雄黄染毒后大鼠肝脏中的砷形态主要为DMA、As和未知物2；肾脏中的砷形态主要为DMA、MMA、As、未知物1、未知物2 和未知物3。综合表明，此方法适用于雄黄代谢后的主要砷形态分析。
关键词 雄黄； 砷形态； 脏器； 高效液相色谱 电感耦合等离子质谱
1 引言
近年来，中药慢性中毒问题受到人们的高度重视。中药雄黄在我国传统医学中有着悠久的历史，具有解毒杀虫，燥湿祛痰，截疟等功效[1]。2010 年版《中国药典》[1]规定雄黄饮片中As2S2的含量应不低于90%，并对As2O3的量进行了限制。现代医学研究表明，雄黄在治疗白血病[2]、癌症[3]等恶性疾病方面也有不错的疗效。尽管雄黄具有这种独特的疗效，但由于其属于含砷矿物药，使其具有一定的毒性，而其毒性大小与砷的化学形态密切相关[4～6]。Rana等[7]报道了，砷暴露可通过干扰抗氧化防御系统和减小SOD2 的基因表达，从而对肝、肾造成损伤。
目前，测定砷形态的分析方法主要有高效液相色谱与电感耦合等离子质谱联用技术（HPLC ICP MS）[8～10]、高效液相色谱与氢化物发生 原子荧光联用技术（HPLC HG AFS）[11，12]、高效液相色谱与氢化物发生 原子吸收联用技术（HPLC HG AAS）[13]、毛细管电泳与电感耦合等离子质谱联用技术（CE ICP MS）[14，15]、高效液相色谱与电喷雾离子质谱联用技术（HPLC ESI MS）[16]，主要用于食品等领域的测定，未见在雄黄代谢中应用的报道。
本实验建立了HPLC ICP MS测定雄黄在大鼠肝肾中代谢砷形态的方法，为研究雄黄在大鼠体内的代谢提供支持，同时考察了样品前处理过程中砷形态之间的转化，并运用此法对雄黄在大鼠肝、肾中代谢后的砷形态进行了初步研究，为进一步研究雄黄的药代动力学提供合适的方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1200 型高效液相色谱仪及7500a 型电感耦合等离子体质谱仪（ICP MS，美国Agilent 公司）；Dionex IonPac AS19 阴离子交换柱（250 mm × 4 mm， 10 μm）；Milliplus 2150 超纯水处理系统（美国Millipore 公司）；数控超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）。
（NH4）2CO3， NH3·H2O， H2O2（30%）、冰醋酸、NaCl均为优级纯；砷标准物质：亚砷酸根离子＼[As]、 砷酸根离子＼[As]、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷甜菜碱（AsB），均购于中国计量科学研究院。超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。
2.2 质谱与色谱条件
ICP MS 条件：RF入射功率1450 W，载气为高纯氩气，载气流速0.65 L/min，辅助气流速0.45 L/min， 射频电压1.72 V，采样深度7.8 mm，泵速0.3 r/s，检测同位素 75As和35Cl。
HPLC 条件：Dionex IonPac AS 19 阴离子分析柱；流动相： 20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7）；流速：1.2 mL/min；柱温为室温；进样体积：25 μL。
2.3 染毒方法
取4周龄Wistar大鼠4只，体重（50 ± 10）g。分为低、中、高剂量组，给药剂量分别为0.3， 0.9和2.7 g/kg （以0.5% CMC 为混悬介质），对照组给予0.5 % CMC （羧甲基纤维素钠），雄黄染毒组灌胃给药，每天灌胃1 次，连续6星期。染毒期间每3 天称重1 次，调节灌胃剂量。实验动物室温度（24±1） ℃， 相对湿度（50±5）%，每天12 h光照，动物可自由摄食摄水。于末次给药2 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肝脏和肾脏。
2.4 样品前处理方法
称取0.3～0.4 g （精确到0.001 g）粉碎后的试样，加38 mL 水、2 mL 3%乙酸溶液，涡旋混匀后，60 ℃ 水浴超声2 h， 于4 ℃ 冰箱中静置5 min后，取出，于4 ℃以9000 r/min离心10 min，上清液过0.2 μm滤膜。同时制备各试剂空白溶液。
3 结果与讨论
3.1 色谱条件的优化
阴离子交换色谱和阳离子交换色谱均可用于砷形态分析。根据砷化合物的离子特性，阴离子交换色谱通常用来分析As、As、MMA 和 DMA，而阳离子交换色谱用于分离AsB、AsC、TMAO 和TETRA。
在阴离子交换色谱中，AsB 和As在中性pH 条件下于死体积处共洗脱。通过向流动相中加入酒石酸后，使As与酒石酸形成阴离子的络合物，在色谱柱内产生较强的保留特性，从而使As与AsB 分开[17]。也可通过增大pH值至9.0 以上[18]或将As氧化成As实现与AsB 的分离。
本实验采用Dionex IonPac AS 19阴离子色谱柱，以20 mmol/L （NH4）2CO3 作流动相，对流动相的pH 值和流速进行了优化。
不同pH值条件下，5 种砷形态的保留时间如图1 所示。pH 值的变化对AsB、DMA 和As的保留时间影响较小，但可使MMA 和As的保留时间明显缩短。这是由于调pH 值时，氨水的含量的增加改变了流动相的阴离子强度，增强了流动相的洗脱能力。从减少测样时间和避免对仪器的损害角度考虑，pH=9.7 为宜。
考察了1.0， 1.2和1.5 mL/min流速下的分离效果，结果表明，当流速为1.0 和1.2 mL/min 时，5种不同砷形态能够完全分离； 而流速为1.2 mL/min 时，测定样品用时较短。1.5 mL/min 流速下，DMA 和As不能达到基线分离。
综上所述， 选用20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7），流速为1.2 mL/min，柱温为室温，进样体积为25 μL的条件进行后续实验。
3.2 离子强度和ArCl+的干扰
样品中存在的其它离子会影响流动相的离子强度，从而也会影响砷形态在色谱柱里的分离；并且35Cl 在等离子体中会与40Ar 形成40Ar35Cl+ 多原子离子干扰75As 的测定。配制不同浓度NaCl 来考察40Ar35Cl 和离子强度对分离效果的影响。
分别配制了NaCl浓度为50， 150， 300， 600 和900 mg/L的5 种砷形态的混合标准溶液（10 μg/L），测试结果表明，在此分离条件下，NaCl 浓度对5 种砷化合物的出峰时间几乎无影响。但浓度大于600 mg/L 后，在5.58 min 出现了1个干扰峰，与35Cl+出峰时间一致，因此可以确定为75Ar35Cl+干扰峰，由于此峰不干扰其它砷形态的测定，所以在此分离条件下40Ar35Cl+ 对测定结果没有干扰。图2为75As 和35Cl 的色谱图。
3.3 砷形态之间转化考察
在对肝肾样品形态分析过程中，发现提取液放置时间过长会发生形态之间的转化，因此设计了砷形态之间的转化实验。考虑到水基质简单，As容易被氧化，而提取液中往往含有还原性有机质，因此，进一步用提取液配制成100 μg/L的混合标准溶液，再分别加入0， 2%， 5%， 10%和15%的H2O2，60 ℃加热1 h，上机测定。结果表明，加入2% 及更高浓度的H2O2后，As被完全氧化为As。后续实验中加入5% H2O2，氧化后的色谱图如图3 所示。在此氧化条件下，AsB， DMA 和MMA 的回收率分别为98%， 92%和95%。说明AsB， DMA 和MMA 在此氧化条件下比较稳定，不易发生转化。
3.4 前处理方法的选择
根据参考文献＼[19～21]报道，目前砷形态分析的主要前处理方法为水、水 乙酸（19∶1，V/V）、甲醇 水（1∶1，V/V） 3 种体系。水作为提取剂主要用于大米等基质相对简单的样品的处理，对脂肪含量较高的样品，提取效率较低。甲醇 水作提取剂可保持各化合物形态、避免形态之间的转化。有机砷提取效率较高；但甲醇含量过高会降低无机砷的提取效率。由于高浓度的甲醇会影响砷测定时的灵敏度，特别是采用HPLC ICP MS时碳在锥孔处易富集，影响测定结果。一般需采用旋转蒸干或氮吹方法去除甲醇，稀释后上机测定；前处理方法较繁琐，回收率偏低。而采用水 乙酸（19∶1，V/V） 提取时， 回收率均在80%～120% 之间，前处理过程简单。经优化实验，本方法选用水 乙酸（19∶1，V/V）作为砷形态的提取试剂。
3.5 方法的线性范围及检出限
分别配制了1.0， 5.0， 10， 25， 50， 100， 200和300 μg/L的5 种砷形态混合标准系列。在优化的实验条件下进行分析，1～300 μg/L 范围内，相关系数R2>0.999，结果如表1 所示。采用逐级稀释法，在0.3 μg/L时，AsB， DMA 和As的信噪比（S/N） 大于3；在0.5 μg/L 时，MMA、As的信噪比（S/N） 大于3。因此， 确定AsB，DMA 和As的检出限为0.3 μg/L，MMA 和As的检出限为0.5 μg/L。
3.6 方法的精密度及加标回收率
由于未发现同时存在5种砷形态化合物的样品，因此在雄黄染毒样品中分别加入3种质量浓度水平的5 种砷形态混合标准溶液，制备成6 个模拟样品，进行回收率和精密度实验，结果见表2。5 种砷形态化合物的加标回收率在83.8%～111.7% 之间，相对标准偏差RSD<5%。
4 结 论
建立的HPLC ICP MS 方法适用于雄黄代谢后大鼠脏器中砷形态分析；雄黄代谢后大鼠肝脏中砷形态主要以DMA 形式存在，存在少量的As和未知物2；肾脏中的砷形态主要以DMA ，MMA，As、未知物1、未知物2 和未知物3 形式存在。
References
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目前，测定砷形态的分析方法主要有高效液相色谱与电感耦合等离子质谱联用技术（HPLC ICP MS）[8～10]、高效液相色谱与氢化物发生 原子荧光联用技术（HPLC HG AFS）[11，12]、高效液相色谱与氢化物发生 原子吸收联用技术（HPLC HG AAS）[13]、毛细管电泳与电感耦合等离子质谱联用技术（CE ICP MS）[14，15]、高效液相色谱与电喷雾离子质谱联用技术（HPLC ESI MS）[16]，主要用于食品等领域的测定，未见在雄黄代谢中应用的报道。
本实验建立了HPLC ICP MS测定雄黄在大鼠肝肾中代谢砷形态的方法，为研究雄黄在大鼠体内的代谢提供支持，同时考察了样品前处理过程中砷形态之间的转化，并运用此法对雄黄在大鼠肝、肾中代谢后的砷形态进行了初步研究，为进一步研究雄黄的药代动力学提供合适的方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1200 型高效液相色谱仪及7500a 型电感耦合等离子体质谱仪（ICP MS，美国Agilent 公司）；Dionex IonPac AS19 阴离子交换柱（250 mm × 4 mm， 10 μm）；Milliplus 2150 超纯水处理系统（美国Millipore 公司）；数控超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）。
（NH4）2CO3， NH3·H2O， H2O2（30%）、冰醋酸、NaCl均为优级纯；砷标准物质：亚砷酸根离子＼[As]、 砷酸根离子＼[As]、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷甜菜碱（AsB），均购于中国计量科学研究院。超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。
2.2 质谱与色谱条件
ICP MS 条件：RF入射功率1450 W，载气为高纯氩气，载气流速0.65 L/min，辅助气流速0.45 L/min， 射频电压1.72 V，采样深度7.8 mm，泵速0.3 r/s，检测同位素 75As和35Cl。
HPLC 条件：Dionex IonPac AS 19 阴离子分析柱；流动相： 20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7）；流速：1.2 mL/min；柱温为室温；进样体积：25 μL。
2.3 染毒方法
取4周龄Wistar大鼠4只，体重（50 ± 10）g。分为低、中、高剂量组，给药剂量分别为0.3， 0.9和2.7 g/kg （以0.5% CMC 为混悬介质），对照组给予0.5 % CMC （羧甲基纤维素钠），雄黄染毒组灌胃给药，每天灌胃1 次，连续6星期。染毒期间每3 天称重1 次，调节灌胃剂量。实验动物室温度（24±1） ℃， 相对湿度（50±5）%，每天12 h光照，动物可自由摄食摄水。于末次给药2 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肝脏和肾脏。
2.4 样品前处理方法
称取0.3～0.4 g （精确到0.001 g）粉碎后的试样，加38 mL 水、2 mL 3%乙酸溶液，涡旋混匀后，60 ℃ 水浴超声2 h， 于4 ℃ 冰箱中静置5 min后，取出，于4 ℃以9000 r/min离心10 min，上清液过0.2 μm滤膜。同时制备各试剂空白溶液。
3 结果与讨论
3.1 色谱条件的优化
阴离子交换色谱和阳离子交换色谱均可用于砷形态分析。根据砷化合物的离子特性，阴离子交换色谱通常用来分析As、As、MMA 和 DMA，而阳离子交换色谱用于分离AsB、AsC、TMAO 和TETRA。
在阴离子交换色谱中，AsB 和As在中性pH 条件下于死体积处共洗脱。通过向流动相中加入酒石酸后，使As与酒石酸形成阴离子的络合物，在色谱柱内产生较强的保留特性，从而使As与AsB 分开[17]。也可通过增大pH值至9.0 以上[18]或将As氧化成As实现与AsB 的分离。
本实验采用Dionex IonPac AS 19阴离子色谱柱，以20 mmol/L （NH4）2CO3 作流动相，对流动相的pH 值和流速进行了优化。
不同pH值条件下，5 种砷形态的保留时间如图1 所示。pH 值的变化对AsB、DMA 和As的保留时间影响较小，但可使MMA 和As的保留时间明显缩短。这是由于调pH 值时，氨水的含量的增加改变了流动相的阴离子强度，增强了流动相的洗脱能力。从减少测样时间和避免对仪器的损害角度考虑，pH=9.7 为宜。
考察了1.0， 1.2和1.5 mL/min流速下的分离效果，结果表明，当流速为1.0 和1.2 mL/min 时，5种不同砷形态能够完全分离； 而流速为1.2 mL/min 时，测定样品用时较短。1.5 mL/min 流速下，DMA 和As不能达到基线分离。
综上所述， 选用20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7），流速为1.2 mL/min，柱温为室温，进样体积为25 μL的条件进行后续实验。
3.2 离子强度和ArCl+的干扰
样品中存在的其它离子会影响流动相的离子强度，从而也会影响砷形态在色谱柱里的分离；并且35Cl 在等离子体中会与40Ar 形成40Ar35Cl+ 多原子离子干扰75As 的测定。配制不同浓度NaCl 来考察40Ar35Cl 和离子强度对分离效果的影响。
分别配制了NaCl浓度为50， 150， 300， 600 和900 mg/L的5 种砷形态的混合标准溶液（10 μg/L），测试结果表明，在此分离条件下，NaCl 浓度对5 种砷化合物的出峰时间几乎无影响。但浓度大于600 mg/L 后，在5.58 min 出现了1个干扰峰，与35Cl+出峰时间一致，因此可以确定为75Ar35Cl+干扰峰，由于此峰不干扰其它砷形态的测定，所以在此分离条件下40Ar35Cl+ 对测定结果没有干扰。图2为75As 和35Cl 的色谱图。
3.3 砷形态之间转化考察
在对肝肾样品形态分析过程中，发现提取液放置时间过长会发生形态之间的转化，因此设计了砷形态之间的转化实验。考虑到水基质简单，As容易被氧化，而提取液中往往含有还原性有机质，因此，进一步用提取液配制成100 μg/L的混合标准溶液，再分别加入0， 2%， 5%， 10%和15%的H2O2，60 ℃加热1 h，上机测定。结果表明，加入2% 及更高浓度的H2O2后，As被完全氧化为As。后续实验中加入5% H2O2，氧化后的色谱图如图3 所示。在此氧化条件下，AsB， DMA 和MMA 的回收率分别为98%， 92%和95%。说明AsB， DMA 和MMA 在此氧化条件下比较稳定，不易发生转化。
3.4 前处理方法的选择
根据参考文献＼[19～21]报道，目前砷形态分析的主要前处理方法为水、水 乙酸（19∶1，V/V）、甲醇 水（1∶1，V/V） 3 种体系。水作为提取剂主要用于大米等基质相对简单的样品的处理，对脂肪含量较高的样品，提取效率较低。甲醇 水作提取剂可保持各化合物形态、避免形态之间的转化。有机砷提取效率较高；但甲醇含量过高会降低无机砷的提取效率。由于高浓度的甲醇会影响砷测定时的灵敏度，特别是采用HPLC ICP MS时碳在锥孔处易富集，影响测定结果。一般需采用旋转蒸干或氮吹方法去除甲醇，稀释后上机测定；前处理方法较繁琐，回收率偏低。而采用水 乙酸（19∶1，V/V） 提取时， 回收率均在80%～120% 之间，前处理过程简单。经优化实验，本方法选用水 乙酸（19∶1，V/V）作为砷形态的提取试剂。
3.5 方法的线性范围及检出限
分别配制了1.0， 5.0， 10， 25， 50， 100， 200和300 μg/L的5 种砷形态混合标准系列。在优化的实验条件下进行分析，1～300 μg/L 范围内，相关系数R2>0.999，结果如表1 所示。采用逐级稀释法，在0.3 μg/L时，AsB， DMA 和As的信噪比（S/N） 大于3；在0.5 μg/L 时，MMA、As的信噪比（S/N） 大于3。因此， 确定AsB，DMA 和As的检出限为0.3 μg/L，MMA 和As的检出限为0.5 μg/L。
3.6 方法的精密度及加标回收率
由于未发现同时存在5种砷形态化合物的样品，因此在雄黄染毒样品中分别加入3种质量浓度水平的5 种砷形态混合标准溶液，制备成6 个模拟样品，进行回收率和精密度实验，结果见表2。5 种砷形态化合物的加标回收率在83.8%～111.7% 之间，相对标准偏差RSD<5%。
4 结 论
建立的HPLC ICP MS 方法适用于雄黄代谢后大鼠脏器中砷形态分析；雄黄代谢后大鼠肝脏中砷形态主要以DMA 形式存在，存在少量的As和未知物2；肾脏中的砷形态主要以DMA ，MMA，As、未知物1、未知物2 和未知物3 形式存在。
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