白术组分拆分及组间差异度评价方法的建立
李玲辉+冉小库+徐煜彬+李斌+窦德强??
摘 要 通过多种分离方法联合应用，将白术化学成分拆分成5个部分，各拆分组分组内指纹图谱相似度评价表明，拆分工艺稳定、重现性良好。采用差异度表征中药化学拆分组分间的不交叉程度。利用主成分分析、聚类分析及夹角余弦、平方欧式距离和生药峰面积交叉分析法对白术化学拆分组分进行不交叉的定性与定量分析，表明白术化学拆分组分组间差异度不低于85%。其中生药峰面积差异度分析法是在中药指纹图谱基础上建立的表征中药拆分组分差异度的新方法。通过与不同分析方法比较，发现其较适合中药药效或药性物质研究中的拆分组分间不交叉程度的评价。
关键词 白术； 化学组分拆分； 组间差异度分析
1 引言
中药活性或有效组（成）分的研究，一般通过对水煎液或醇提液进行化学拆分，以评价最强活性组分。但对于各拆分组分之间的成分交叉性鲜有评价，最终为有效组分的确定增加了不确定因素。若中药各组分交叉太大，活性成分在各组分中分散，评价活性成分时会引起“丢失”。近年来，匡海学等提出“中药性味可拆分性、可组合性的研究方法”[1]。但目前尚没有不交叉性的定量分析方法。本研究以白术为例，通过定性和定量分析，建立其拆分组分间的不交叉性评价的新方法，为后续有效组分及性味组分的评价奠定基础。
白术为菊科植物白术（Atractylodes macrocephalaKoidz.）[2]，其主要化学成分有挥发油、白术内酯、聚炔、多糖等化合物[3，4]。白术具有多种药理作用[5～8]。目前多采用高效液相色谱法（HPLC）对中药化学组分进行表征，并采用主成分分析方法进行不交叉性的定性分析[9]。现虽已有文献报道了中药组分的拆分方法，但并没有交叉度分析的具体方法[10，11]。本研究将常见的化学分析法及软件应用于组分间交叉度分析中，对中药拆分组分进行了不交叉性的定性和定量分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent1260高效液相色谱系统（美国Agilent科技公司），配有DAD检测器，在线脱气机，自动进样器；HH S型水浴锅和旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）；FD 1A 50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；DZF 6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；PCJ 10超纯水机（品成科技有限公司）。
D101大孔吸附树脂（沧州宝恩科技有限公司）；白术药材2012年11月采于浙江于潜，经辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为菊科植物白术（Atractylodes macrocephalaKoidz.） 的根茎；甲醇、乙腈（色谱纯，瑞典Oceanpak Alexative Chemical公司）；超纯水；其余试剂均为分析纯。
2.2 HPLC色谱条件
Kromasil C18柱（250 mm ×4. 6 mm，5 μm），二极管阵列检测器（DAD） ，以乙腈（A） 水（B）为流动相梯度洗脱：0～5 min， 3%A； 5～10 min， 3%～10% A； 10～25 min， 10%～40% A； 25～40 min， 40%～60% A； 40～50 min， 60%～100% A； 50～60 min， 100% A； 60～70 min，100%～3% A； 流速1.0 mL/min； 柱温25 ℃； 检测波长242 nm。
2.3 白术化学组分拆分方法
取白术药材100 g，粉碎，水蒸汽蒸馏得挥发油组分。蒸馏后的水煎液浓缩至100 mL，加95%乙醇调醇浓度至75%，0～5 ℃放置过夜，倾出上清液，收集沉淀，沉淀依次用95%乙醇、丙酮洗涤3次，冷冻干燥后，得多糖组分。醇沉后得到的上清液挥至无醇味，加水至100 mL，石油醚60～90 ℃萃取，萃取至石油醚层颜色较淡，得石油醚Ⅰ。石油醚萃取后药液挥至无石油醚味，加水至300 mL，加于已处理的D101大孔吸附树脂柱（400 mL湿树脂）。洗脱液依次为水、80%乙醇，洗脱量依次为10倍和4倍柱体积，收集相应的洗脱液。水洗脱部分减压浓缩后冷冻干燥，得树脂水洗组分。醇洗部分浓缩至25 mL，再经石油醚60～90 ℃萃取，萃取至石油醚无颜色，得石油醚Ⅱ。合并石油醚Ⅰ和石油醚Ⅱ，得石油醚组分。石油醚萃取后的树脂醇洗部分，挥至无醇味后冷冻干燥，得树脂醇洗组分。
重复10次工艺，将白术化学成分拆分至大分子多糖组分及4个小分子组分。采用HPLC法建立4个小分子组分的指纹图谱，并分别建立其公共指纹图谱。
采用硅胶柱、ODS开放柱和制备液相等色谱方法，从白术拆分各组分中得到的化合物，通过NMR技术结合文献报道确定了其化学结构，并对指纹图谱进行表征。
2.4 白术拆分组分差异度评价方法的建立
由于多糖经纯化后与小分子部分交叉度很小，因此本研究仅对小分子的挥发油组分、石油醚组分、树脂醇洗组分和树脂水洗组分进行不交叉性分析。
2.4.1 定性分析
主要采用SPSS13.0软件对2.3节建立的HPLC指纹图谱的数据进行主成分分析[12]和聚类分析[13]。为消除原始数据数量级的差异对主成分分析和聚类分析结果的影响， 使每个数据对分类有相近的贡献，需对原始数据进行生药折合和规范化处理，以得到相应的规范值。具体方法是将每个组分的指纹图谱数据导出并存储为CSV 格式，每组分舍去小于图谱平均峰面积5%的色谱峰，按生药量折合及规范化处理后，再组合成为一个矩阵，每行对应的是不同的样品，每列对应的是色谱图中出现峰的峰面积，采用两种方法分别进行分析。
2.4.2 定量分析 首先定义各化学拆分组分交叉或相似的程度为组分间的相似度或交叉度（Similarity degree， SD）。在此基础上，定义组分之间的不交叉程度或不对称性为差异度（Discrepancy degree， DD或Nonsimilarity degree， NS）。相似度用S表示，差异度用NS表示，并且S+NS=1。采用3种方法：夹角余弦法、平方欧氏距离方法和生药峰面积交叉分析方法。生药峰面积交叉分析方法，以样本和每个样本的各个峰面积列出相关数据的矩阵Y，如公式（1）所示，首次提出利用公共指纹图谱的匹配峰面积对两两化学拆分组分进行交叉度（S）和差异度（NS=1-S）的分析。
式中，YA， YB， YC和YD分别代表挥发油组分、石油醚组分、树脂醇洗组分和树脂水洗组分所有批次（n=10）的HPLC公共指纹图谱中相应保留时间下经标准化处理（即所有批次样品各自匹配的峰面积与各组分指纹图谱所有峰的平均峰面积之比）后的面积。以YA和YB， 两组分的数据为例，见式（2）和（3）。S1，2和S2，1分别为相应保留时间下两组分中较小峰面积占较大峰面积的比例总和，即较小峰面积与较大峰面积的匹配程度，来表征相应保留时间下两组分间的交叉度。因此，两组分总的交叉度S=S1，2+S2，1，差异度1-S=1-（S1，2+S2，1），其它组分相关数据以规范值按上述公式计算。3 结果与讨论
3.1 白术化学组分拆分
3.1.1 白术组分的拆分原则和出膏率 化学成分是中药药效（性）的物质基础，各类化学成分药理作用具有一定的相似性。因此在化学组分拆分过程中尽量将化学成分按类划分。白术传统应用以水煎为主，为此本研究以水作为提取溶剂，采用水蒸汽蒸馏等方法进行全成分拆分。组分拆分原则是把挥发油和内酯部分拆分，然后再将大分子多糖与小分子分开，按照此原则建立白术性味组分拆分工艺，白术水煎液共拆分为5部分，即挥发油组分、石油醚组分、树脂醇洗组分、树脂水洗组分及多糖组分。出膏率见表1。
3.1.2 指纹图谱分析 按上述方法所建立的指纹图谱在242 nm处检测的色谱峰相似度均在0.90以上，相互吻合程度较高，说明工艺的稳定性较好。
3.1.3 白术化学拆分组分的表征 上述方法分离得到的白术化学成分，经2.2节HPLC方法测定后，采用2.3节建立的公共指纹图谱对白术拆分的4个组分的指纹图谱，根据保留时间和DAD检测器显示的紫外光谱进行表征，共标记了7个色谱峰（图1）。根据树脂洗脱规律，通过TLC检识发现，树脂水洗组分中含有大量小分子葡萄糖。挥发油组分中以苍术酮为主，石油醚组分以白术内酯为主，树脂醇洗组分是一些聚炔类化合物，树脂水洗组分含有5 羟甲基糠醛和小分子糖等化合物。
3.2 白术拆分组分差异度评价结果
3.2.1 定性分析 各组分HPLC色谱峰按生药折合规范化后的峰面积，通过SPSS13.0软件进行主成分和聚类分析。从主成分分析中提取3个主成分，特征值累计贡献率达到了66.34%，说明其降维效果较好，仅用前3个主成分即可包含原始因子代表的众多主要信息。由图2可见，此方法提取的3个主成分将这些色谱峰明显地分为4大类，每类聚在不同的空间位置，A、B为挥发油和石油醚组分位于PC1正轴附近，C为树脂醇洗组分位于PC2正轴附近，D为树脂水洗组分位于PC3轴零点附近。系统聚类分析法，采用欧氏距离法计算样品间相似度，选用最短距离法进行聚类。结果如图3所示：组分1～10聚为Ⅰ类，即为挥发油组分；组分11～20聚为Ⅱ类，即为石油醚组分；组分21～30聚为Ⅲ类，即为树脂醇洗组分；组分31～40聚为Ⅳ类， 即为树脂水洗组分。
3.2.2 定量分析 （1）夹角余弦法 通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，以夹角余弦为测度，对上述4个小分子部分化学拆分组分的公共指纹图谱进行相似度分析，由各组分的相似度或交叉度（S），可以近似得出各组分的差异度（1-S），结果见表2。
（2）平方欧式距离法 将3.2项中的图3，通过几何画板获得各化学拆分组分在树状图横轴上平方欧氏距离的具体数值，利用平方欧式距离对树状图进行数字化分析，定义第一次能够分开两组分聚合在一起的欧氏距离为dmin；所有组分能聚类在一起的最小欧氏距离为dmax=25。由图3可知，白术拆分4组分的最大
交叉度为5/25=0.2，最小差异度为80%，即白术拆分组分间差异度最小的为石油醚组和树脂醇洗组，其差异度为80%。（3） 生药峰面积差异度分析法 将拆分组分的10批HPLC图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，生成各自的公共指纹图谱后，分别导出各拆分组分的保留时间对应的峰面积，根据进样量和药材量，按照实际生药中含量对每个组分中各个色谱峰的峰面积进行折合，并进行规范化处理。然后按照2.4.2项中公式进行交叉度分析，结果见表3。
综上所述，本研究建立了白术化学组分的全拆分工艺，同时对其进行了HPLC化学表征，建立了拆分组分间系统的交叉度评价体系。中药药效（性）组分评价中，组间交叉度的定量分析是需要解决的关键问题。本研究采用定性和定量分析法对白术各组分间的差异性进行研究。定性分析中的主成分分析和聚类分析结果直观，操作简便。两种方法都是按照“相近者相聚”的原则将原始数据分类，既体现了类间的差异性，同时又减少了分析指标。如图2和3所示，采用主成分分析法和聚类分析法均可将白术小分子部分拆分为大类。
因目前尚无组分间不交叉性的定量分析方法，本研究探索了3种定量分析方法，利用不同的测度对白术拆分组分进行了不交叉性分析。采用夹角余弦法，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》直接进行分析，但此方法的不足之处是它与进样量有直接关系，不能反映各拆分组分在中药中的实际含量。平方欧氏距离法只能得到各组分间的最小差异度，不能反映整体拆分组分间差异。生药峰面积交叉分析法是将两两组分进行交叉度分析，结果表明在前文主成分分析和聚类分析得到4个组分没有交叉性的基础上，石油醚组分和树脂醇洗组分交叉度最大，差异度最小。生药峰面积差异度分析法是组分间交叉度的定量分析方法，此方法可通过简单的Excel计算，即可获得拆分组分交叉度的分析结果，不需要更多的软件支持，分析方便。应用生药峰面积差异度分析法更能反映相同药材量下的各组分交叉度的变化，应作为定量分析的主要方法。
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关键词 白术； 化学组分拆分； 组间差异度分析
1 引言
中药活性或有效组（成）分的研究，一般通过对水煎液或醇提液进行化学拆分，以评价最强活性组分。但对于各拆分组分之间的成分交叉性鲜有评价，最终为有效组分的确定增加了不确定因素。若中药各组分交叉太大，活性成分在各组分中分散，评价活性成分时会引起“丢失”。近年来，匡海学等提出“中药性味可拆分性、可组合性的研究方法”[1]。但目前尚没有不交叉性的定量分析方法。本研究以白术为例，通过定性和定量分析，建立其拆分组分间的不交叉性评价的新方法，为后续有效组分及性味组分的评价奠定基础。
白术为菊科植物白术（Atractylodes macrocephalaKoidz.）[2]，其主要化学成分有挥发油、白术内酯、聚炔、多糖等化合物[3，4]。白术具有多种药理作用[5～8]。目前多采用高效液相色谱法（HPLC）对中药化学组分进行表征，并采用主成分分析方法进行不交叉性的定性分析[9]。现虽已有文献报道了中药组分的拆分方法，但并没有交叉度分析的具体方法[10，11]。本研究将常见的化学分析法及软件应用于组分间交叉度分析中，对中药拆分组分进行了不交叉性的定性和定量分析。
2 实验部分
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2.3 白术化学组分拆分方法
取白术药材100 g，粉碎，水蒸汽蒸馏得挥发油组分。蒸馏后的水煎液浓缩至100 mL，加95%乙醇调醇浓度至75%，0～5 ℃放置过夜，倾出上清液，收集沉淀，沉淀依次用95%乙醇、丙酮洗涤3次，冷冻干燥后，得多糖组分。醇沉后得到的上清液挥至无醇味，加水至100 mL，石油醚60～90 ℃萃取，萃取至石油醚层颜色较淡，得石油醚Ⅰ。石油醚萃取后药液挥至无石油醚味，加水至300 mL，加于已处理的D101大孔吸附树脂柱（400 mL湿树脂）。洗脱液依次为水、80%乙醇，洗脱量依次为10倍和4倍柱体积，收集相应的洗脱液。水洗脱部分减压浓缩后冷冻干燥，得树脂水洗组分。醇洗部分浓缩至25 mL，再经石油醚60～90 ℃萃取，萃取至石油醚无颜色，得石油醚Ⅱ。合并石油醚Ⅰ和石油醚Ⅱ，得石油醚组分。石油醚萃取后的树脂醇洗部分，挥至无醇味后冷冻干燥，得树脂醇洗组分。
重复10次工艺，将白术化学成分拆分至大分子多糖组分及4个小分子组分。采用HPLC法建立4个小分子组分的指纹图谱，并分别建立其公共指纹图谱。
采用硅胶柱、ODS开放柱和制备液相等色谱方法，从白术拆分各组分中得到的化合物，通过NMR技术结合文献报道确定了其化学结构，并对指纹图谱进行表征。
2.4 白术拆分组分差异度评价方法的建立
由于多糖经纯化后与小分子部分交叉度很小，因此本研究仅对小分子的挥发油组分、石油醚组分、树脂醇洗组分和树脂水洗组分进行不交叉性分析。
2.4.1 定性分析
主要采用SPSS13.0软件对2.3节建立的HPLC指纹图谱的数据进行主成分分析[12]和聚类分析[13]。为消除原始数据数量级的差异对主成分分析和聚类分析结果的影响， 使每个数据对分类有相近的贡献，需对原始数据进行生药折合和规范化处理，以得到相应的规范值。具体方法是将每个组分的指纹图谱数据导出并存储为CSV 格式，每组分舍去小于图谱平均峰面积5%的色谱峰，按生药量折合及规范化处理后，再组合成为一个矩阵，每行对应的是不同的样品，每列对应的是色谱图中出现峰的峰面积，采用两种方法分别进行分析。
2.4.2 定量分析 首先定义各化学拆分组分交叉或相似的程度为组分间的相似度或交叉度（Similarity degree， SD）。在此基础上，定义组分之间的不交叉程度或不对称性为差异度（Discrepancy degree， DD或Nonsimilarity degree， NS）。相似度用S表示，差异度用NS表示，并且S+NS=1。采用3种方法：夹角余弦法、平方欧氏距离方法和生药峰面积交叉分析方法。生药峰面积交叉分析方法，以样本和每个样本的各个峰面积列出相关数据的矩阵Y，如公式（1）所示，首次提出利用公共指纹图谱的匹配峰面积对两两化学拆分组分进行交叉度（S）和差异度（NS=1-S）的分析。
式中，YA， YB， YC和YD分别代表挥发油组分、石油醚组分、树脂醇洗组分和树脂水洗组分所有批次（n=10）的HPLC公共指纹图谱中相应保留时间下经标准化处理（即所有批次样品各自匹配的峰面积与各组分指纹图谱所有峰的平均峰面积之比）后的面积。以YA和YB， 两组分的数据为例，见式（2）和（3）。S1，2和S2，1分别为相应保留时间下两组分中较小峰面积占较大峰面积的比例总和，即较小峰面积与较大峰面积的匹配程度，来表征相应保留时间下两组分间的交叉度。因此，两组分总的交叉度S=S1，2+S2，1，差异度1-S=1-（S1，2+S2，1），其它组分相关数据以规范值按上述公式计算。3 结果与讨论
3.1 白术化学组分拆分
3.1.1 白术组分的拆分原则和出膏率 化学成分是中药药效（性）的物质基础，各类化学成分药理作用具有一定的相似性。因此在化学组分拆分过程中尽量将化学成分按类划分。白术传统应用以水煎为主，为此本研究以水作为提取溶剂，采用水蒸汽蒸馏等方法进行全成分拆分。组分拆分原则是把挥发油和内酯部分拆分，然后再将大分子多糖与小分子分开，按照此原则建立白术性味组分拆分工艺，白术水煎液共拆分为5部分，即挥发油组分、石油醚组分、树脂醇洗组分、树脂水洗组分及多糖组分。出膏率见表1。
3.1.2 指纹图谱分析 按上述方法所建立的指纹图谱在242 nm处检测的色谱峰相似度均在0.90以上，相互吻合程度较高，说明工艺的稳定性较好。
3.1.3 白术化学拆分组分的表征 上述方法分离得到的白术化学成分，经2.2节HPLC方法测定后，采用2.3节建立的公共指纹图谱对白术拆分的4个组分的指纹图谱，根据保留时间和DAD检测器显示的紫外光谱进行表征，共标记了7个色谱峰（图1）。根据树脂洗脱规律，通过TLC检识发现，树脂水洗组分中含有大量小分子葡萄糖。挥发油组分中以苍术酮为主，石油醚组分以白术内酯为主，树脂醇洗组分是一些聚炔类化合物，树脂水洗组分含有5 羟甲基糠醛和小分子糖等化合物。
3.2 白术拆分组分差异度评价结果
3.2.1 定性分析 各组分HPLC色谱峰按生药折合规范化后的峰面积，通过SPSS13.0软件进行主成分和聚类分析。从主成分分析中提取3个主成分，特征值累计贡献率达到了66.34%，说明其降维效果较好，仅用前3个主成分即可包含原始因子代表的众多主要信息。由图2可见，此方法提取的3个主成分将这些色谱峰明显地分为4大类，每类聚在不同的空间位置，A、B为挥发油和石油醚组分位于PC1正轴附近，C为树脂醇洗组分位于PC2正轴附近，D为树脂水洗组分位于PC3轴零点附近。系统聚类分析法，采用欧氏距离法计算样品间相似度，选用最短距离法进行聚类。结果如图3所示：组分1～10聚为Ⅰ类，即为挥发油组分；组分11～20聚为Ⅱ类，即为石油醚组分；组分21～30聚为Ⅲ类，即为树脂醇洗组分；组分31～40聚为Ⅳ类， 即为树脂水洗组分。
3.2.2 定量分析 （1）夹角余弦法 通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，以夹角余弦为测度，对上述4个小分子部分化学拆分组分的公共指纹图谱进行相似度分析，由各组分的相似度或交叉度（S），可以近似得出各组分的差异度（1-S），结果见表2。
（2）平方欧式距离法 将3.2项中的图3，通过几何画板获得各化学拆分组分在树状图横轴上平方欧氏距离的具体数值，利用平方欧式距离对树状图进行数字化分析，定义第一次能够分开两组分聚合在一起的欧氏距离为dmin；所有组分能聚类在一起的最小欧氏距离为dmax=25。由图3可知，白术拆分4组分的最大
交叉度为5/25=0.2，最小差异度为80%，即白术拆分组分间差异度最小的为石油醚组和树脂醇洗组，其差异度为80%。（3） 生药峰面积差异度分析法 将拆分组分的10批HPLC图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，生成各自的公共指纹图谱后，分别导出各拆分组分的保留时间对应的峰面积，根据进样量和药材量，按照实际生药中含量对每个组分中各个色谱峰的峰面积进行折合，并进行规范化处理。然后按照2.4.2项中公式进行交叉度分析，结果见表3。
综上所述，本研究建立了白术化学组分的全拆分工艺，同时对其进行了HPLC化学表征，建立了拆分组分间系统的交叉度评价体系。中药药效（性）组分评价中，组间交叉度的定量分析是需要解决的关键问题。本研究采用定性和定量分析法对白术各组分间的差异性进行研究。定性分析中的主成分分析和聚类分析结果直观，操作简便。两种方法都是按照“相近者相聚”的原则将原始数据分类，既体现了类间的差异性，同时又减少了分析指标。如图2和3所示，采用主成分分析法和聚类分析法均可将白术小分子部分拆分为大类。
因目前尚无组分间不交叉性的定量分析方法，本研究探索了3种定量分析方法，利用不同的测度对白术拆分组分进行了不交叉性分析。采用夹角余弦法，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》直接进行分析，但此方法的不足之处是它与进样量有直接关系，不能反映各拆分组分在中药中的实际含量。平方欧氏距离法只能得到各组分间的最小差异度，不能反映整体拆分组分间差异。生药峰面积交叉分析法是将两两组分进行交叉度分析，结果表明在前文主成分分析和聚类分析得到4个组分没有交叉性的基础上，石油醚组分和树脂醇洗组分交叉度最大，差异度最小。生药峰面积差异度分析法是组分间交叉度的定量分析方法，此方法可通过简单的Excel计算，即可获得拆分组分交叉度的分析结果，不需要更多的软件支持，分析方便。应用生药峰面积差异度分析法更能反映相同药材量下的各组分交叉度的变化，应作为定量分析的主要方法。
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