微波辅助提取绞股蓝中黄酮的工艺研究
杨豆 张卫波 樊华
摘要：为了合理利用绞股蓝资源，对采摘末期绞股蓝中的黄酮进行微波辅助提取，选择微波功率、微波温度、微波时间、料液比、乙醇体积分数为影响因子，在单因素实验的基础上，通过正交实验优化了提取工艺，结果显示，微波功率300W，微波时间10min，微波温度70℃，料液比1：25g/mL，乙醇体积分数30%。此条件下黄酮的平均得率为4.898mg/g。采摘末期的绞股蓝中富含植物黄酮。可将这部分资源合理利用在饲料工业中来发挥重要作用。
关键字：微波辅助；提取；绞股蓝；黄酮；优化
前言
绞股蓝为葫芦绞股蓝属多年生草质藤本植物，又叫七叶草，因为生命力旺盛，容易栽培而俗称遍地生根。绞股蓝主要分布在陕西、四川、云南、湖南、湖北等地。秦巴山区盛产绞股蓝，出口国外，因此被誉为“绞谷”。绞股蓝具有很高的药用价值。富含皂苷、氨基酸、微量元素、黄酮、萜类、有机酸、生物碱、多糖、蛋白质等。其中的活性成分黄酮与动物的内分泌、脂质代谢及抗氧化有着密切的关系，在促进动物生产性能及提高免疫力等方面起着重要作用。黄酮是植物的次级代谢产物，含量会随植物生长发生变化，为了合理利用采摘末期的绞股蓝资源，实验采用微波辅助提取技术分别对4～11月份的绞股蓝中的黄酮进行提取并比较得率，重点对采摘末期11月份的绞股蓝中的黄酮提取工艺进行优化研究，以期为其在饲料工业中的合理应用提供理论参考。
1实验
1.1实验材料及仪器
绞股蓝购于陕西平利农贸市场，清洗除杂后干燥粉碎，过60目筛于阴凉干燥处放置备用：芦丁标准品（中国药品生物制品检验所，纯度≥99%）；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。
GR-200电子天平：日本AND；TU-1810紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限公司；pHS-3TC（0.01级）精密酸度计：上海天达仪器有限公司：电热鼓风干燥箱101型：北京科伟永兴仪器有限公司：DHG-9075A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司：WF-2000微波快速反应系统：上海屹尧分析仪器有限公司：80-1型离心机：江苏金坛正基仪器有限公司：FW117中草药粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司。
1.2實验
1.2.1芦丁标准曲线的绘制
精确量取0.5g的芦丁标准样品，用体积分数为30%的乙醇溶解后转入500mL的容量瓶中，配制1mg/mL的黄酮溶液，精密移取1mL放入100mL的容量瓶中用体积分数为30%的乙醇定容，配制10μg/mL的黄酮标准液。分别精密移取0，1，2，3，4，5，6mL放入7个50mL的容量瓶中，各加入1.0mL浓度为50g/L的NaNO2溶液混匀，放置6min后加入1.0mL浓度为100g/L的Al（NO3）3溶液混匀，放置6min。再加入10.0mL浓度为40g/L的NaOH溶液，最后用30%乙醇定容至刻度，再放置15min后于510.00nm波长处测其吸光度，并以其为纵坐标。黄酮待测液浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为：y=0.1206x-0.0208，R2=0.9972，说明黄酮浓度在0～10μg/mL范围内线性关系良好。
1.2.2绞股蓝中黄酮的提取
将备用的绞股蓝粉末和乙醇水溶液按照一定的料液比配制好后移入微波反应系统，设定微波功率、微波时间、微波温度、料液比、乙醇体积分数进行微波提取。提取后所得的混合液经过抽滤、离心得到上清液，按照1.2.1的方法测定吸光度。计算绞股蓝中黄酮的得率。
1.2.3黄酮得率的计算
黄酮得率/（mg/g）=[（y+0.0208）v/0.1206]/m
式中：y—待测液吸光度；v—测定液的体积（mL）；m—每次提取时所用绞股蓝质量：
1.3正交实验设计
选择微波功率、微波时间、微波温度、料液比、乙醇体积分数五个因素为正交实验的考察因子，以绞股蓝中黄酮得率为指标，采用五因素四水平的正交实验设计优化绞股蓝中黄酮的提取，实验安排见表1。
2实验结果及讨论
2.1不同月份绞股蓝中黄酮的提取效果比较
采摘末期的绞股蓝当作茶叶去加工经济价值较低，为了合理利用采摘末期的绞股蓝资源，实验探究了不同月份的绞股蓝中黄酮得率的变化，分别设定设定微波功率300W，料液比1：20g/mL，微波温度60℃，微波时间8min，乙醇体积分数30%进行微波提取，结果如图1所示。
由图1可知，随着月份的变化，绞股蓝中黄酮的微波提取得率也有很大差异，其中六月份的绞股蓝中黄酮的得率最高。4～6月份大部分的绞股蓝开始大量采摘，其中的黄酮含量也随采摘月份增大。6月份的绞股蓝中的黄酮含量最高。之后。绞股蓝中黄酮含量逐渐减小。11月份属于绞股蓝的采摘末期，此时的绞股蓝的经济价值远不及4～8月份，但是其中的活性成分黄酮含量是6月份的80%左右，含量相对丰富。植物黄酮具有多种生物活性，在食品、化妆品、医药、畜牧等领域具有重要的应用价值，因此合理开发利用这部分资源具有现实意义重大。
2.2单因素实验结果与分析
2.2.1微波功率的选择
实验过程中设定料液比1：20g/mL，微波温度60℃。微波时间8min。乙醇体积分数30%。考察微波功率分别为100W，200W，300W，400W，500W时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图2所示。
微波功率是微波能的直接体现，微波功率越大。微波能越大。微波能会使提取原料在短时间内升温继而破坏其细胞壁，促进黄酮的溶出及在提取剂中的扩散。微波功率越大破壁效果越好，但是过大的微波功率虽然在提取初期有利于黄酮的溶出，但是随着提取时间的延长。局部过热现象会破坏黄酮的结构，导致得率降低。由图2可知，在100～300W微波功率范围内，黄酮得率先增大后减小，300W时对应的得率最大，因此选择300W为较佳微波功率。
2.2.2微波时间的选择
实验过程中设定料液比1：20g/mL，微波功率300W。微波温度60℃，乙醇体积分数30%。考察微波时间分别为4min，6min，8min，10min。12min时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图3示。
黄酮的浸出是一个传质过程，在4～10min范围内，绞股蓝中黄酮得率随微波时间的延长不断增大，10min时对应的得率最大，微波时间再延长得率减小。合适的微波时间能使绞股蓝达到活化状态。增强绞股蓝颗粒分子内部的有效碰撞，促进黄酮的溶出。微波时间短，绞股蓝中的黄酮的提取不完全。微波时间过长，一方面导致提取剂挥发。另一方面，提取到的黄酮在长时间的微波作用下，结构可能遭到破坏，得不偿失，由图3可知，微波10min较好。
2.2.3微波温度的选择
实验过程中设定料液比1：20g/mL，微波功率300W，微波时间8min，乙醇体积分数30%，考察微波温度分别为50℃，60℃，70℃，80℃，90℃时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图4示。
微波温度是微波提取过程中的重要影响因素之一，是微波能转化为热能的体现，直接影响绞股蓝中黄酮分子的热运动。由图4可知，微波温度在50～70℃范围内，随着微波温度的升高，黄酮得率增大，70℃时提取效果最好，过高的微波温度则易造成局部热量聚集，高温容易破坏黄酮结构，因此得率下降，综上，选择70℃为较佳微波温度。
2.2.4乙醇体积分数的选择
实验过程中设定料液比1：20g/mL，微波功率300W，微波时间8min，微波温度60℃，考察乙醇体积分数分别为20%，30%，40%，50%，60%时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图5示。
黄酮类化合物为多羟基酚类，极性比乙醇强而比水弱，在选用不同体积分数的乙醇对绞股蓝中的黄酮进行提取时，随着乙醇体积分数的增加。绞股蓝中黄酮的得率不断增大，当乙醇的体积分数为40%时，得率最大。乙醇体积分数大于40%后，黄酮的得率降低，这可能是因为高浓度的乙醇水溶液在提取黄酮过程中，绞股蓝中的其他醇溶性物质也溶出。与黄酮相互竞争，导致得率降低。因此选择体积分数为40%的乙醇作为提取剂较合适。
2.2.5料液比的选择
实验过程中乙醇体积分数30%，微波功率300W。微波时间8min。微波温度60℃，考察料液比分别为1：10g/mL，1：15g/mL，1：20g/mL，1：25g/mL，1：30g/mL时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图6示。
料液比是提取过程中传质的主要影响因素，料液比小，传质速率小，因此黄酮得率低，料液比增大，绞股蓝中的黄酮得率不断增大，但是提取原料绞股蓝中的黄酮的总量是不变的，当料液比增大到一定程度后，黃酮的得率变化幅度会越来越小。正如图6中所示，绞股蓝中黄酮得率在1：10～1：30g/mL范围内随着料液比的增大而增大，当料液比大于1：25g/mL时得率变化幅度很小，兼顾得率和提取成本，选择1：25g/mL为较佳料液比。
3正交实验结果及分析
为了优化微波辅助提取绞股蓝中黄酮的工艺条件，以单因素实验中的五个因素作为影响因子，黄酮得率为指标，通过L16（45）正交实验确定最佳提取工艺参数，按照表1实验设计进行实验。实验结果见表2。方差分析见表3。
微波提取绞股蓝黄酮中，各因素对黄酮得率的影响顺序通过表2中的极差R反应出来，因素对应的R值越大。说明影响越大。通过比较可知，各因素对绞股蓝中黄酮得率的影响顺序为：微波功率>料液比>微波温度>乙醇体积分数>微波时间。正交实验所得的最优工艺为：A3B3C3D4E2，即微波功率300W，微波时间10min，微波温度70℃，料液比1：25g/mL。乙醇体积分数30%。为了验证正交实验确定的工艺参数，根据条件进行三次平行实验，以黄酮得率为指标，评价其优越性，三次平行提取的黄酮得率为4.876mg/g、4.913mg/g、4.905mg/g，平均得率为4.898mg/g，高于正交和单因素实验中的任何组合，因此确定其为最佳工艺条件。
从表3的方差分析结果可以看出，微波功率对提取效果影响最显著，F值最大，其次为料液比、微波温度、乙醇体积分数、微波时间，这和正交极差分析的结果吻合。因此在绞股蓝黄酮的提取过程中要严格控制微波功率，可以适当的减小对提取效果影响最小的微波时间，达到低耗高效的提取效果。
结论
（1）微波提取绞股蓝具有提取时间短、效率高、节省提取剂、绿色环保等特点。微波提取绞股蓝黄酮过程中，各因素对绞股蓝中黄酮得率的影响顺序为：微波功率>料液比>微波温度>乙醇体积分数>微波时间。
（2）正交优化所得的最佳提取工艺条件为：微波功率300W，微波时间10min，微波温度70℃，料液比1：25g/mL，乙醇体积分数30%。此条件黄酮得率达4.898mg/g。采摘末期的绞股蓝中黄酮含量丰富。作为绿色的植物黄酮资源。在饲料中进行合理开发利用，会创造更多的经济价值。
摘要：为了合理利用绞股蓝资源，对采摘末期绞股蓝中的黄酮进行微波辅助提取，选择微波功率、微波温度、微波时间、料液比、乙醇体积分数为影响因子，在单因素实验的基础上，通过正交实验优化了提取工艺，结果显示，微波功率300W，微波时间10min，微波温度70℃，料液比1：25g/mL，乙醇体积分数30%。此条件下黄酮的平均得率为4.898mg/g。采摘末期的绞股蓝中富含植物黄酮。可将这部分资源合理利用在饲料工业中来发挥重要作用。
关键字：微波辅助；提取；绞股蓝；黄酮；优化
前言
绞股蓝为葫芦绞股蓝属多年生草质藤本植物，又叫七叶草，因为生命力旺盛，容易栽培而俗称遍地生根。绞股蓝主要分布在陕西、四川、云南、湖南、湖北等地。秦巴山区盛产绞股蓝，出口国外，因此被誉为“绞谷”。绞股蓝具有很高的药用价值。富含皂苷、氨基酸、微量元素、黄酮、萜类、有机酸、生物碱、多糖、蛋白质等。其中的活性成分黄酮与动物的内分泌、脂质代谢及抗氧化有着密切的关系，在促进动物生产性能及提高免疫力等方面起着重要作用。黄酮是植物的次级代谢产物，含量会随植物生长发生变化，为了合理利用采摘末期的绞股蓝资源，实验采用微波辅助提取技术分别对4～11月份的绞股蓝中的黄酮进行提取并比较得率，重点对采摘末期11月份的绞股蓝中的黄酮提取工艺进行优化研究，以期为其在饲料工业中的合理应用提供理论参考。
1实验
1.1实验材料及仪器
绞股蓝购于陕西平利农贸市场，清洗除杂后干燥粉碎，过60目筛于阴凉干燥处放置备用：芦丁标准品（中国药品生物制品检验所，纯度≥99%）；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。
GR-200电子天平：日本AND；TU-1810紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限公司；pHS-3TC（0.01级）精密酸度计：上海天达仪器有限公司：电热鼓风干燥箱101型：北京科伟永兴仪器有限公司：DHG-9075A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司：WF-2000微波快速反应系统：上海屹尧分析仪器有限公司：80-1型离心机：江苏金坛正基仪器有限公司：FW117中草药粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司。
1.2實验
1.2.1芦丁标准曲线的绘制
精确量取0.5g的芦丁标准样品，用体积分数为30%的乙醇溶解后转入500mL的容量瓶中，配制1mg/mL的黄酮溶液，精密移取1mL放入100mL的容量瓶中用体积分数为30%的乙醇定容，配制10μg/mL的黄酮标准液。分别精密移取0，1，2，3，4，5，6mL放入7个50mL的容量瓶中，各加入1.0mL浓度为50g/L的NaNO2溶液混匀，放置6min后加入1.0mL浓度为100g/L的Al（NO3）3溶液混匀，放置6min。再加入10.0mL浓度为40g/L的NaOH溶液，最后用30%乙醇定容至刻度，再放置15min后于510.00nm波长处测其吸光度，并以其为纵坐标。黄酮待测液浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为：y=0.1206x-0.0208，R2=0.9972，说明黄酮浓度在0～10μg/mL范围内线性关系良好。
1.2.2绞股蓝中黄酮的提取
将备用的绞股蓝粉末和乙醇水溶液按照一定的料液比配制好后移入微波反应系统，设定微波功率、微波时间、微波温度、料液比、乙醇体积分数进行微波提取。提取后所得的混合液经过抽滤、离心得到上清液，按照1.2.1的方法测定吸光度。计算绞股蓝中黄酮的得率。
1.2.3黄酮得率的计算
黄酮得率/（mg/g）=[（y+0.0208）v/0.1206]/m
式中：y—待测液吸光度；v—测定液的体积（mL）；m—每次提取时所用绞股蓝质量：
1.3正交实验设计
选择微波功率、微波时间、微波温度、料液比、乙醇体积分数五个因素为正交实验的考察因子，以绞股蓝中黄酮得率为指标，采用五因素四水平的正交实验设计优化绞股蓝中黄酮的提取，实验安排见表1。
2实验结果及讨论
2.1不同月份绞股蓝中黄酮的提取效果比较
采摘末期的绞股蓝当作茶叶去加工经济价值较低，为了合理利用采摘末期的绞股蓝资源，实验探究了不同月份的绞股蓝中黄酮得率的变化，分别设定设定微波功率300W，料液比1：20g/mL，微波温度60℃，微波时间8min，乙醇体积分数30%进行微波提取，结果如图1所示。
由图1可知，随着月份的变化，绞股蓝中黄酮的微波提取得率也有很大差异，其中六月份的绞股蓝中黄酮的得率最高。4～6月份大部分的绞股蓝开始大量采摘，其中的黄酮含量也随采摘月份增大。6月份的绞股蓝中的黄酮含量最高。之后。绞股蓝中黄酮含量逐渐减小。11月份属于绞股蓝的采摘末期，此时的绞股蓝的经济价值远不及4～8月份，但是其中的活性成分黄酮含量是6月份的80%左右，含量相对丰富。植物黄酮具有多种生物活性，在食品、化妆品、医药、畜牧等领域具有重要的应用价值，因此合理开发利用这部分资源具有现实意义重大。
2.2单因素实验结果与分析
2.2.1微波功率的选择
实验过程中设定料液比1：20g/mL，微波温度60℃。微波时间8min。乙醇体积分数30%。考察微波功率分别为100W，200W，300W，400W，500W时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图2所示。
微波功率是微波能的直接体现，微波功率越大。微波能越大。微波能会使提取原料在短时间内升温继而破坏其细胞壁，促进黄酮的溶出及在提取剂中的扩散。微波功率越大破壁效果越好，但是过大的微波功率虽然在提取初期有利于黄酮的溶出，但是随着提取时间的延长。局部过热现象会破坏黄酮的结构，导致得率降低。由图2可知，在100～300W微波功率范围内，黄酮得率先增大后减小，300W时对应的得率最大，因此选择300W为较佳微波功率。
2.2.2微波时间的选择
实验过程中设定料液比1：20g/mL，微波功率300W。微波温度60℃，乙醇体积分数30%。考察微波时间分别为4min，6min，8min，10min。12min时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图3示。
黄酮的浸出是一个传质过程，在4～10min范围内，绞股蓝中黄酮得率随微波时间的延长不断增大，10min时对应的得率最大，微波时间再延长得率减小。合适的微波时间能使绞股蓝达到活化状态。增强绞股蓝颗粒分子内部的有效碰撞，促进黄酮的溶出。微波时间短，绞股蓝中的黄酮的提取不完全。微波时间过长，一方面导致提取剂挥发。另一方面，提取到的黄酮在长时间的微波作用下，结构可能遭到破坏，得不偿失，由图3可知，微波10min较好。
2.2.3微波温度的选择
实验过程中设定料液比1：20g/mL，微波功率300W，微波时间8min，乙醇体积分数30%，考察微波温度分别为50℃，60℃，70℃，80℃，90℃时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图4示。
微波温度是微波提取过程中的重要影响因素之一，是微波能转化为热能的体现，直接影响绞股蓝中黄酮分子的热运动。由图4可知，微波温度在50～70℃范围内，随着微波温度的升高，黄酮得率增大，70℃时提取效果最好，过高的微波温度则易造成局部热量聚集，高温容易破坏黄酮结构，因此得率下降，综上，选择70℃为较佳微波温度。
2.2.4乙醇体积分数的选择
实验过程中设定料液比1：20g/mL，微波功率300W，微波时间8min，微波温度60℃，考察乙醇体积分数分别为20%，30%，40%，50%，60%时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图5示。
黄酮类化合物为多羟基酚类，极性比乙醇强而比水弱，在选用不同体积分数的乙醇对绞股蓝中的黄酮进行提取时，随着乙醇体积分数的增加。绞股蓝中黄酮的得率不断增大，当乙醇的体积分数为40%时，得率最大。乙醇体积分数大于40%后，黄酮的得率降低，这可能是因为高浓度的乙醇水溶液在提取黄酮过程中，绞股蓝中的其他醇溶性物质也溶出。与黄酮相互竞争，导致得率降低。因此选择体积分数为40%的乙醇作为提取剂较合适。
2.2.5料液比的选择
实验过程中乙醇体积分数30%，微波功率300W。微波时间8min。微波温度60℃，考察料液比分别为1：10g/mL，1：15g/mL，1：20g/mL，1：25g/mL，1：30g/mL时对绞股蓝中黄酮得率的影响，结果如图6示。
料液比是提取过程中传质的主要影响因素，料液比小，传质速率小，因此黄酮得率低，料液比增大，绞股蓝中的黄酮得率不断增大，但是提取原料绞股蓝中的黄酮的总量是不变的，当料液比增大到一定程度后，黃酮的得率变化幅度会越来越小。正如图6中所示，绞股蓝中黄酮得率在1：10～1：30g/mL范围内随着料液比的增大而增大，当料液比大于1：25g/mL时得率变化幅度很小，兼顾得率和提取成本，选择1：25g/mL为较佳料液比。
3正交实验结果及分析
为了优化微波辅助提取绞股蓝中黄酮的工艺条件，以单因素实验中的五个因素作为影响因子，黄酮得率为指标，通过L16（45）正交实验确定最佳提取工艺参数，按照表1实验设计进行实验。实验结果见表2。方差分析见表3。
微波提取绞股蓝黄酮中，各因素对黄酮得率的影响顺序通过表2中的极差R反应出来，因素对应的R值越大。说明影响越大。通过比较可知，各因素对绞股蓝中黄酮得率的影响顺序为：微波功率>料液比>微波温度>乙醇体积分数>微波时间。正交实验所得的最优工艺为：A3B3C3D4E2，即微波功率300W，微波时间10min，微波温度70℃，料液比1：25g/mL。乙醇体积分数30%。为了验证正交实验确定的工艺参数，根据条件进行三次平行实验，以黄酮得率为指标，评价其优越性，三次平行提取的黄酮得率为4.876mg/g、4.913mg/g、4.905mg/g，平均得率为4.898mg/g，高于正交和单因素实验中的任何组合，因此确定其为最佳工艺条件。
从表3的方差分析结果可以看出，微波功率对提取效果影响最显著，F值最大，其次为料液比、微波温度、乙醇体积分数、微波时间，这和正交极差分析的结果吻合。因此在绞股蓝黄酮的提取过程中要严格控制微波功率，可以适当的减小对提取效果影响最小的微波时间，达到低耗高效的提取效果。
结论
（1）微波提取绞股蓝具有提取时间短、效率高、节省提取剂、绿色环保等特点。微波提取绞股蓝黄酮过程中，各因素对绞股蓝中黄酮得率的影响顺序为：微波功率>料液比>微波温度>乙醇体积分数>微波时间。
（2）正交优化所得的最佳提取工艺条件为：微波功率300W，微波时间10min，微波温度70℃，料液比1：25g/mL，乙醇体积分数30%。此条件黄酮得率达4.898mg/g。采摘末期的绞股蓝中黄酮含量丰富。作为绿色的植物黄酮资源。在饲料中进行合理开发利用，会创造更多的经济价值。
