基于二茂铁甲酸多重标记的树枝状大分子放大效应的赤霉素分子印迹电化学传感器
付丛+李建平
摘 要 建立了多重标记模板分子提高分子印迹电化学传感器灵敏度的方法。通过修饰有大量二茂铁甲酸的树枝状大分子标记的赤霉素与样品中的赤霉素分子之间的竞争反应来进行定量测定。由于实现了二茂铁甲酸的多重标记，故测量电信号得到了明显放大，灵敏度显著提高，线性范围为2.0×10
Symbolm@@ 10 mol/L。本方法已成功用于啤酒样品中赤霉素测定。
关键词 多重标记； 树枝状大分子； 赤霉素； 分子印迹； 二茂铁甲酸； 聚三乙胺五乙酸乙二醇酯
1 引 言
赤霉素是一种植物生长调节剂，在农业生产中广泛应用[1，2]。已知的赤霉素种类至少有38种，其中赤霉素3（Gibberellin Acid 3，GA3）活性最强，研究也最多。许多国家对食品中赤霉素的含量有着严格规定。因此，建立灵敏简单的赤霉素检测方法非常必要。目前，已报道的赤霉素的定量检测方法有毛细管电泳 质谱法[3]、气相色谱 质谱联用法[4]、液相色谱 质谱法[5]＼， 毛细管电泳 荧光检测法[6]等，但相关的电化学检测方法还未见报道。
分子印迹电化学传感器灵敏度高、选择性好，是近期研究的热点之一[7～10]，已被应用于环境监测[11，12]、药品检验[13，14]、农兽药残留检测[15，16]等领域。为了提高其灵敏度，开发了许多新方法[17～19]。树枝状大分子是一类人工合成的新型化合物[20]，一般具有对称的高度枝化结构，表面分布大量官能团[21，22]。本实验将二茂铁甲酸（Ferrocenecarboxylic Acid， FcA）标记于合成的树枝状大分子聚三乙胺五乙酸乙二醇酯（PDTPA）表面，再将GA3与之相连形成GA3/PDTPA/（FcA）n，从而实现了模板分子的多重标记，即一个孔穴对应多个标记物。相较于单次标记的方法，信号强度大大增强，方法的灵敏度明显提高。
2 实验部分
2.1 仪器与药品
CHI660C电化学工作站（上海辰华仪器公司）；三电极系统：金电极（d= 2 mm）为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
赤霉素1， 2， 3， 4， 7（GA1， GA2， GA3， GA4， GA7）购自阿拉丁试剂公司； 邻苯二胺（OPD）、三乙胺五乙酸（DTPA）、EDC、sulfo NHS、FcA等购于国药试剂公司。所有试剂均为分析纯，使用前不需要进一步纯化。
2.2 分子印迹电化学传感器的制备
2.2.1 GA3/PDTPA/（FcA）n的合成 PDTPA的合成及NHS EDC的使用方法均参照文献＼[23]。将0.3 g合成好的PDTPA、 300 μL 1 mmol/L FcA和100 μL 1 mmol/L GA3分别加入3个烧杯中，再各加入500 μL 20 g/L EDC和500 μL 10 g/L Sulfo NHS，静置反应5 h。然后在盛放PDTPA烧杯中加入400 μL 0.01 mmol/L 脲溶液并于暗处搅拌反应1 h。最后将3个烧杯溶液混合后于暗处搅拌反应1 h。制得复合物GA3/PDTPA/（FcA）n的浓度约为1×10
Symbolm@@ 4 mol/L。
2.2.2 分子印迹传感器和非分子印迹传感器的合成 金电极在使用前需要在先用氧化铝粉末浆中抛光成镜面，经浓HNO3（1∶1，V/V）、乙醇及蒸馏水洗涤。电化学聚合在10 mL 含1.0 mmol/L GA3 和3 mmol/L OPD的醋酸 醋酸钠缓冲溶液中（pH=5.2）进行的。电聚合完成之后，用甲醇 乙酸溶液（8∶1，V/V）泡洗数分钟，制得分子印迹电化学传感器。
非分子印迹膜（nMIP）传感器的制备类似于分子印迹传感器的制备，仅在聚合过程中不加入模板分子。
2.2.3 掩蔽、竞争和孵化过程 掩蔽是将洗脱后的分子印迹修饰电极置于5 mL 1.0 × 10
Symbolm@@ 4 mol/L GA3溶液中12 min， 使GA3完全占据电极上的印迹孔穴。冲洗电极后，再将其置于合成好的配合物溶液中孵化15 min，使配合物分子取代部分孔穴中的GA3分子。冲洗孵化后的电极， 以去除电极表面的物理吸附。检测前，将孵化后的电极置于不同浓度的GA3待测液中浸泡9 min完成竞争。
2.2.4 电极的再生使用 将使用后的电极重新在甲醇 乙酸溶液（8∶1，V/V）中洗脱10 min，以除去孔穴中的聚合物和赤霉素，并消除聚合物表面可能存在的物理吸附。清洗后进行循环伏安法扫描，至CV曲线与第一次洗脱完毕的曲线重合，即表明该电极可重新使用。
2.2.5 实验方法 采用循环伏安法（CV）、差分脉冲伏安法（DPV）和交流阻抗（EIS）对传感器进行表征和检测。CV在含有K3＼[Fe（CN）6]溶液中进行。DPV检测在含0.5 mol/L KCl的PBS（pH=7.0）中进行，扫描范围为0.2～0.8 V，扫速为0.1 V/S。EIS检测是在0.19 V进行，频率范围100 mHz～100 kHz。
3 结果与讨论
3.1 分子印迹聚合物的电聚合
在金电极表面于0.1 mol/L 醋酸 醋酸钠缓冲溶液（pH=5.2）中用CV法电聚合GA3分子印迹膜。结果表明，在0.35 V处出现了一个明显的OPD氧化峰，并且随着扫描圈数增加，峰电流减小并趋近于零，即可证明生成了导电性能较差的OPD膜。
3.2 分子印迹聚合物的分子识别性能
分子印迹聚合物具有特异的选择识别性能。为了验证此性质，分别对裸（a）、聚合后（b）、洗脱后（c）、掩蔽后（d）、孵化后（e）和在10×10
Symbolm@@ 8 mol/L GA3溶液中竞争后的电极（f）进行了CV表征，结果如图1A所示。与曲线a相比，曲线b峰电流几乎消失，证明在电极表面形成了不导电的分子印迹膜。由b到c峰电流增大，说明有模板分子从聚合物中洗脱下来。由c到d，电流再次减小，表明部分印记孔穴被重新占据。而由d到e， 电流再次增大，可能是由于二茂铁甲酸是良性的导电介质。相较于孵化后（e）峰电流值，竞争后（f）峰电流进一步减小。这主要是由于在竞争过程中孔穴中的GA3/PDTPA/（FcA）n被GA3分子取代，使电极表面二茂铁甲酸的数量减少，电流相应减小。
3.3 测量底液及其pH和KCl的影响
为了得到稳定的反应溶液，选择不同的缓冲液（包括PBS、醋酸 醋酸钠、硼砂、碳酸钠 碳酸氢钠缓冲液等）检测经1.0×10
Symbolm@@ 8 mol/L赤霉素竞争后的电流。结果表明，在PBS溶液中反应最为稳定，得到的峰型也最好。进一步对PBS溶液的pH值进行优化，在pH=7.0时响应电流最大。为了平衡电荷和增加溶液导电性，在测量底液中加入0.1 mol/L KCl作为支持电解质。综上所述，取含0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH=7.0 PBS作为检测底液。 图2 分子印迹传感器在各个步骤的AC谱图，其中a， b， c， d， e和f分别为分子印迹电极在裸电极、聚合后、洗脱后、掩蔽后、孵化后和竞争后的AC图
3.4 孵化时间和竞争时间优化
孵化时间是GA3/PDTPA/（FcA）n竞争下掩蔽时进入分子印迹孔穴的GA3并达到平衡过程所需要的时间。孵化实验是在合成好的配合物溶液中进行的，每隔3 min在PBS中进行一次差分脉冲伏安测定，记录电流响应信号，实验结果如图3a所示。随着孵化时间延长，响应信号不断增大，直至12 min后电流强度达到稳定。
竞争时间是标用GA3和分子印迹膜上的GA3/PDTPA/（FcA）n发生竞争取代并达到平衡状态的时间。在1×10
Symbolm@@ 7 mol/L GA3溶液中，每隔3 min在PBS中进行一次DPV测定。如图3b所示，电流的响应信号随着竞争时间延长而降低，直至9 min趋于稳定。其它浓度更小的赤霉素溶液在该孵化液中进行竞争反应，9 min内均能够达到平衡。
3.5 标准曲线
标准曲线如图4所示。还原电流随着GA3的浓度（c）增加而减小。 在2.0×10
Symbolm@@ 7 mol/L范围内，峰电流值（I）与c呈现良好的线性关系，线性方程为
Symbolm@@ 10 mol/L （LOD=3δb/K）。
本方法简单快速，与其它已报道的方法相比，具有更高的灵敏度，且成本很低（表1）。
3.6 传感器的重现性
将同批次制备得到的5支分子印迹膜传感器在10 mL含有10×10
Symbolm@@ 8 mol/L的GA3进行了5次测定，得到的RSD为3.8%。说明此传感器具有良好的重现性。
3.7 传感器的选择性
赤霉素的同系物（GA1， GA2， GA4和GA7）对GA3的测定可能产生干扰。评价了传感器的选择性识别能力， 结果表明，对于10×10
Symbolm@@ 8 mol/L GA3，30倍的GA1， 35倍度的GA2， 35倍的GA4和 50倍的GA7无影响， RSD<5%。
3.8 啤酒样品中GA3的检测
应用此传感器对啤酒中GA3进行测定，结果见表2，分子印迹传感器的回收率为96.7%～101.3%，RSD<5%。
4 结 论
本研究提出了一种高灵敏的基于修饰树枝状大分子多重标记产生放大效应的分子印迹电化学传感器检测模式，并用于赤霉素测定。 方法简单易行、成本低廉、选择性好，在实际样品测定时， 结果令人满意。同时为提高分子印迹传感器的灵敏度提供了一个新思路。
References
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摘 要 建立了多重标记模板分子提高分子印迹电化学传感器灵敏度的方法。通过修饰有大量二茂铁甲酸的树枝状大分子标记的赤霉素与样品中的赤霉素分子之间的竞争反应来进行定量测定。由于实现了二茂铁甲酸的多重标记，故测量电信号得到了明显放大，灵敏度显著提高，线性范围为2.0×10
Symbolm@@ 10 mol/L。本方法已成功用于啤酒样品中赤霉素测定。
关键词 多重标记； 树枝状大分子； 赤霉素； 分子印迹； 二茂铁甲酸； 聚三乙胺五乙酸乙二醇酯
1 引 言
赤霉素是一种植物生长调节剂，在农业生产中广泛应用[1，2]。已知的赤霉素种类至少有38种，其中赤霉素3（Gibberellin Acid 3，GA3）活性最强，研究也最多。许多国家对食品中赤霉素的含量有着严格规定。因此，建立灵敏简单的赤霉素检测方法非常必要。目前，已报道的赤霉素的定量检测方法有毛细管电泳 质谱法[3]、气相色谱 质谱联用法[4]、液相色谱 质谱法[5]＼， 毛细管电泳 荧光检测法[6]等，但相关的电化学检测方法还未见报道。
分子印迹电化学传感器灵敏度高、选择性好，是近期研究的热点之一[7～10]，已被应用于环境监测[11，12]、药品检验[13，14]、农兽药残留检测[15，16]等领域。为了提高其灵敏度，开发了许多新方法[17～19]。树枝状大分子是一类人工合成的新型化合物[20]，一般具有对称的高度枝化结构，表面分布大量官能团[21，22]。本实验将二茂铁甲酸（Ferrocenecarboxylic Acid， FcA）标记于合成的树枝状大分子聚三乙胺五乙酸乙二醇酯（PDTPA）表面，再将GA3与之相连形成GA3/PDTPA/（FcA）n，从而实现了模板分子的多重标记，即一个孔穴对应多个标记物。相较于单次标记的方法，信号强度大大增强，方法的灵敏度明显提高。
2 实验部分
2.1 仪器与药品
CHI660C电化学工作站（上海辰华仪器公司）；三电极系统：金电极（d= 2 mm）为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
赤霉素1， 2， 3， 4， 7（GA1， GA2， GA3， GA4， GA7）购自阿拉丁试剂公司； 邻苯二胺（OPD）、三乙胺五乙酸（DTPA）、EDC、sulfo NHS、FcA等购于国药试剂公司。所有试剂均为分析纯，使用前不需要进一步纯化。
2.2 分子印迹电化学传感器的制备
2.2.1 GA3/PDTPA/（FcA）n的合成 PDTPA的合成及NHS EDC的使用方法均参照文献＼[23]。将0.3 g合成好的PDTPA、 300 μL 1 mmol/L FcA和100 μL 1 mmol/L GA3分别加入3个烧杯中，再各加入500 μL 20 g/L EDC和500 μL 10 g/L Sulfo NHS，静置反应5 h。然后在盛放PDTPA烧杯中加入400 μL 0.01 mmol/L 脲溶液并于暗处搅拌反应1 h。最后将3个烧杯溶液混合后于暗处搅拌反应1 h。制得复合物GA3/PDTPA/（FcA）n的浓度约为1×10
Symbolm@@ 4 mol/L。
2.2.2 分子印迹传感器和非分子印迹传感器的合成 金电极在使用前需要在先用氧化铝粉末浆中抛光成镜面，经浓HNO3（1∶1，V/V）、乙醇及蒸馏水洗涤。电化学聚合在10 mL 含1.0 mmol/L GA3 和3 mmol/L OPD的醋酸 醋酸钠缓冲溶液中（pH=5.2）进行的。电聚合完成之后，用甲醇 乙酸溶液（8∶1，V/V）泡洗数分钟，制得分子印迹电化学传感器。
非分子印迹膜（nMIP）传感器的制备类似于分子印迹传感器的制备，仅在聚合过程中不加入模板分子。
2.2.3 掩蔽、竞争和孵化过程 掩蔽是将洗脱后的分子印迹修饰电极置于5 mL 1.0 × 10
Symbolm@@ 4 mol/L GA3溶液中12 min， 使GA3完全占据电极上的印迹孔穴。冲洗电极后，再将其置于合成好的配合物溶液中孵化15 min，使配合物分子取代部分孔穴中的GA3分子。冲洗孵化后的电极， 以去除电极表面的物理吸附。检测前，将孵化后的电极置于不同浓度的GA3待测液中浸泡9 min完成竞争。
2.2.4 电极的再生使用 将使用后的电极重新在甲醇 乙酸溶液（8∶1，V/V）中洗脱10 min，以除去孔穴中的聚合物和赤霉素，并消除聚合物表面可能存在的物理吸附。清洗后进行循环伏安法扫描，至CV曲线与第一次洗脱完毕的曲线重合，即表明该电极可重新使用。
2.2.5 实验方法 采用循环伏安法（CV）、差分脉冲伏安法（DPV）和交流阻抗（EIS）对传感器进行表征和检测。CV在含有K3＼[Fe（CN）6]溶液中进行。DPV检测在含0.5 mol/L KCl的PBS（pH=7.0）中进行，扫描范围为0.2～0.8 V，扫速为0.1 V/S。EIS检测是在0.19 V进行，频率范围100 mHz～100 kHz。
3 结果与讨论
3.1 分子印迹聚合物的电聚合
在金电极表面于0.1 mol/L 醋酸 醋酸钠缓冲溶液（pH=5.2）中用CV法电聚合GA3分子印迹膜。结果表明，在0.35 V处出现了一个明显的OPD氧化峰，并且随着扫描圈数增加，峰电流减小并趋近于零，即可证明生成了导电性能较差的OPD膜。
3.2 分子印迹聚合物的分子识别性能
分子印迹聚合物具有特异的选择识别性能。为了验证此性质，分别对裸（a）、聚合后（b）、洗脱后（c）、掩蔽后（d）、孵化后（e）和在10×10
Symbolm@@ 8 mol/L GA3溶液中竞争后的电极（f）进行了CV表征，结果如图1A所示。与曲线a相比，曲线b峰电流几乎消失，证明在电极表面形成了不导电的分子印迹膜。由b到c峰电流增大，说明有模板分子从聚合物中洗脱下来。由c到d，电流再次减小，表明部分印记孔穴被重新占据。而由d到e， 电流再次增大，可能是由于二茂铁甲酸是良性的导电介质。相较于孵化后（e）峰电流值，竞争后（f）峰电流进一步减小。这主要是由于在竞争过程中孔穴中的GA3/PDTPA/（FcA）n被GA3分子取代，使电极表面二茂铁甲酸的数量减少，电流相应减小。
3.3 测量底液及其pH和KCl的影响
为了得到稳定的反应溶液，选择不同的缓冲液（包括PBS、醋酸 醋酸钠、硼砂、碳酸钠 碳酸氢钠缓冲液等）检测经1.0×10
Symbolm@@ 8 mol/L赤霉素竞争后的电流。结果表明，在PBS溶液中反应最为稳定，得到的峰型也最好。进一步对PBS溶液的pH值进行优化，在pH=7.0时响应电流最大。为了平衡电荷和增加溶液导电性，在测量底液中加入0.1 mol/L KCl作为支持电解质。综上所述，取含0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH=7.0 PBS作为检测底液。 图2 分子印迹传感器在各个步骤的AC谱图，其中a， b， c， d， e和f分别为分子印迹电极在裸电极、聚合后、洗脱后、掩蔽后、孵化后和竞争后的AC图
3.4 孵化时间和竞争时间优化
孵化时间是GA3/PDTPA/（FcA）n竞争下掩蔽时进入分子印迹孔穴的GA3并达到平衡过程所需要的时间。孵化实验是在合成好的配合物溶液中进行的，每隔3 min在PBS中进行一次差分脉冲伏安测定，记录电流响应信号，实验结果如图3a所示。随着孵化时间延长，响应信号不断增大，直至12 min后电流强度达到稳定。
竞争时间是标用GA3和分子印迹膜上的GA3/PDTPA/（FcA）n发生竞争取代并达到平衡状态的时间。在1×10
Symbolm@@ 7 mol/L GA3溶液中，每隔3 min在PBS中进行一次DPV测定。如图3b所示，电流的响应信号随着竞争时间延长而降低，直至9 min趋于稳定。其它浓度更小的赤霉素溶液在该孵化液中进行竞争反应，9 min内均能够达到平衡。
3.5 标准曲线
标准曲线如图4所示。还原电流随着GA3的浓度（c）增加而减小。 在2.0×10
Symbolm@@ 7 mol/L范围内，峰电流值（I）与c呈现良好的线性关系，线性方程为
Symbolm@@ 10 mol/L （LOD=3δb/K）。
本方法简单快速，与其它已报道的方法相比，具有更高的灵敏度，且成本很低（表1）。
3.6 传感器的重现性
将同批次制备得到的5支分子印迹膜传感器在10 mL含有10×10
Symbolm@@ 8 mol/L的GA3进行了5次测定，得到的RSD为3.8%。说明此传感器具有良好的重现性。
3.7 传感器的选择性
赤霉素的同系物（GA1， GA2， GA4和GA7）对GA3的测定可能产生干扰。评价了传感器的选择性识别能力， 结果表明，对于10×10
Symbolm@@ 8 mol/L GA3，30倍的GA1， 35倍度的GA2， 35倍的GA4和 50倍的GA7无影响， RSD<5%。
3.8 啤酒样品中GA3的检测
应用此传感器对啤酒中GA3进行测定，结果见表2，分子印迹传感器的回收率为96.7%～101.3%，RSD<5%。
4 结 论
本研究提出了一种高灵敏的基于修饰树枝状大分子多重标记产生放大效应的分子印迹电化学传感器检测模式，并用于赤霉素测定。 方法简单易行、成本低廉、选择性好，在实际样品测定时， 结果令人满意。同时为提高分子印迹传感器的灵敏度提供了一个新思路。
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