绵羊HTR4基因的生物信息学分析
刘佳 王祯 代友超 张小雪
摘要：利用生物信息学数据库及软件，对绵羊羟色胺受体4基因（hydroxytryptamine receptor 4，HTR4）进行生物信息学分析，以初步了解其结构并进行功能预测。结果表明，绵羊HTR4基因所含最大长度的开放阅读框为1 317 bp，编码438个氨基酸残基。HTR4基因编码的蛋白分子质量为49 437.09 KDa，理论等电点（pI）为8.32。亚细胞定位结果表明其编码产物主要定位于质膜（60.9%），且不属于分泌蛋白。HTR4蛋白不存在信号肽序列，存在7段跨膜结构且无低复杂性段区域，该蛋白的二级结构以α螺旋为主，且三级结构主要由α折叠缠绕形成。
关键词：绵羊;HTR4基因;生物信息学分析
中图分类号：S826? ? ? ?文献标志码：A? ? ? ?文章编号：1001-1463（2020）10-0035-06
doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.10.008
Abstract：The bioinformatics analysis of sheep HTR4 gene was carried out by using bioinformatics database and software， and its structure was preliminarily understood and predicted. The results showed that sheep HTR4 gene contained an open reading frame of 1 317 bp， encoding 438 amino acid residues. The molecular mass of HTR4 protein was 49 437.09 KDa， and the theoretical isoelectric point pI was 8.32. The subcells were mainly located in plasma membrane and did not belong to secretory protein（60.9%）. There are no signal peptide sequences. There are seven segments of transmembrane structure and no segments of low complexity region. The secondary structure is mainly α-helix， and the tertiary structure is mainly formed by α-helix， winding and folding.
Key words：Sheep;HTR4 gene;Bioinformatics analysis
5-羟色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）既是一种神经递质，又是一种血管活性物质，在中枢神经系统和外周组织中起着多种生理作用[1 ]。HTR4是其受体一亚型，HTR4 基因在人体内定位于5q31-33， 编码羟色胺受体4 型蛋白[2 ]。该基因在人和鼠的中枢神经系统和外周组织中都有广泛的表达，但在不同的组织中表达量差异显著，主要分布在脑组织和肠道组织中，在人类中枢神经系统所有组织中都有表达，其中脑组织的表达率显著高于外周组织[3 ]。外周组织中，小肠的表达率最高，参与胃肠道的运动与分泌、调节蠕动反射及影响肠道感觉功能[4 ]。HTR4参与胃肠道的运动与分泌、调节蠕动反射及影响肠道感觉功能[5 ]。外周HTR4的作用首先是在豚鼠体内发现的。在用电刺激豚鼠肠纵行平滑肌丛时，HT作用于一个在药理学上与HTR4类似的受体，从而增强胆碱能介导的收缩。其在人和鼠的中枢神经系统和外周组织中都有广泛的表达，但不同组织内的表达量却有显著差异，其主要分布在脑组织和胃肠道组织中。
生物信息学是利用数学方法处理和分析生物数据，基于人们现有对分子生物学的认识和构建生物模型，进而分析其生物学特性的方法[6 ]。对HTR4基因的研究大多为人类HTR4基因及其编码产物的功能，而绵羊HTR4基因方面的研究不足。本研究以生物基因组数据库调取的绵羊HTR4的序列为基础，利用生物信息学方法对绵羊HTR4基因及其编码产物的理化性质、序列特征、蛋白质结构以及生物学功能进行预测和分析，以期为深入研究HTR4基因及其编码蛋白的基本结构和生物学功能提供理论基础。
1? ?材料与方法
1.1? ?序列来源
数据来源于NCBI网站GenBank数据库，包括绵羊（XM_027970630.1）、狗（XM_ 022417831.1）、鸡（XM_015293658.2）、马（NM_ 001163982.1）、猫（XM_023260627.1）、牛（NM_001040485.1）、兔（XM_008255221.2）、豚鼠（NM_001172963.1）、猪（NM_001001267.1）、人（NM_000870.7）和山羊（XM_018050181. 1）等11个物种的mRNA序列。括号内为GenBank登录号。
1.2? ?方法
绵羊HTR4基因开放阅读框（Open reading frame，ORF）采用NCBI的ORF Finder程序分析，參照Kozak法则[7 ];HTR4基因编码产物的理化性质采用Bioedit及ExPASy分析软件预测;亚细胞定位采用PSORTⅡ预测[8 ]。蛋白潜在信号肽剪切位点预测采用Signalp 3.0软件。跨膜螺旋区域的预测采用TMHMM程序。蛋白保守结构域分析采用Smart软件。采用Prot Scale进行蛋白亲疏水性分析。二级结构采用Jpred分析预测。采用Swiss-model软件分析蛋白三级结构多序列比对及同源性分析采用DNAMAN软件分析[9 ]。
2? ?结果与分析
2.1? ?绵羊HTR4基因开放阅读框分析
从开放阅读框分析结果（图1）可以看出，绵羊HTR4基因序列中最大长度的ORF有? 1 317 bp，起始密码子位于1 bp处，终止密码子位于1 845 bp处，推测其编码438个氨基酸残基。
2.2? ?绵羊HTR4编码产物的理化性质分析
蛋白质的基本性质包括其相对分子质量、氨基酸组成、等电点基因编码产物半衰期和不稳定指数等[10 ]。对绵羊HTR4基因编码产物理化性质的分析结果表明，绵羊的HTR4基因编码438个氨基酸残基，其分子式为C2253H3497N577O605S34，分子质量为49 437.09 KDa，理论等电点pI为8.32。其氨基酸组成如图2所示，其中含量最多的是Leu（亮氨酸），所占比例为10.27%;含量最少的是His（组氨酸），所占比例为1.83%。负电荷残基总数（Asp+Glu）为32，正电荷残基总数（Arg+Lys）为37。基因编码产物半衰期和不稳定指数分别为30 h和51.70，不稳定指数为41.57 > 40.00，由此可确定绵羊HTR4基因编码产物属不稳定蛋白。
2.3? ?绵羊HTR4蛋白亚细胞定位
从绵羊HTR4基因编码蛋白的亚细胞定位结果（表1）可以看出，绵羊HTR4蛋白分布于质膜的可能性为60.9%，分布于囊泡分泌系统的可能性为17.4%，分布于內质网的可能性为8.7%，分布于细胞核和线粒体的可能性均为4.3%。由此推断，绵羊HTR4基因主要在质膜中发挥生物学作用，其次在囊泡分泌系统中发挥作用。
2.4? ?绵羊HTR4编码产物的同源性比对及系统发育分析
HTR4基因在多个物种中都有表达。采用DNAMAN对兔、牛、绵羊、山羊、猫、马、人、豚鼠、猪、狗和鸡HTR4蛋白多序列比对的结果如图3所示，可以看出，HTR4基因在这11个物种中均有表达，且绵羊与牛和山羊的HTR4氨基酸序列同源性较高，这也说明了它们在进化过程具有较近的亲缘关系。HTR4编码产物同源树证明，在分析中选取的11个物种中，绵羊、山羊和牛的同源性最高（图4）。
2.5? ?绵羊HTR4蛋白潜在信号肽剪切位点预测
信号肽序列是存在于分泌蛋白基因编码序列中、在起始密码子之后的1段富含疏水氨基酸多肽的序列。蛋白质的合成是在核糖体上进行，信号肽是蛋白质的1个片段，引导核糖体并定位于内质网上的一个通道上，使核糖体附着在内质网上，并将不断伸长的蛋白质链穿透通过通道，随后信号肽被切割下来，合成的蛋白质被释放进内质网腔，最后被转运到胞外[11 ]。通过检测绵羊HTR4蛋白潜在信号肽的存在情况可以得知该基因编的产物是否是分泌蛋白和跨膜蛋白以及跨膜蛋白的基本信息。从图5可以看出，绵羊HTR4基因编码产物的C值、Y值和S值分别为0.619、0.058和0.463。因此推断HTR4基因的编码产物不存在信号肽，但发现跨膜区，故该蛋白既是非分泌性蛋白又是跨膜蛋白。
2.6? ?绵羊HTR4蛋白跨膜螺旋结构预测
从TMHMM 2.0软件的分析结果（图6）可以看出，HTR4基因编码的蛋白质是跨膜蛋白，该基因编码的蛋白有7段跨膜区间，分别是145～167、180～202、217～239、259～281、314～336、383～401和416～438。
2.7? ?绵羊HTR4蛋白保守结构域分析
由绵羊HTR4蛋白潜在信号肽剪切位点预测已知绵羊HTR4基因编码的蛋白是跨膜蛋白，通过Smart软件分析，绵羊HTR4有7段跨膜结构，分别是72～94、107～129、144～166、186～208、241～263、310～328、343～365（图7、图8）。
2.8? ?绵羊HTR4蛋白亲疏水性分析
研究发现，该基因编码蛋白疏水性最大值为2.878（第82位），最小值为-3.078（第384位），由此得出该基因编码的蛋白属于亲水蛋白（图9）。
2.9? ?绵羊HTR4蛋白二级结构的预测
二级结构（secondary structure）是指蛋白质第一个水平的折叠，即部分蛋白质链折叠形成一些通用结构，这些通用结构在所有蛋白质中都能找到[12 ]。通过Jpred软件分析可知（图10）绵羊HTR4蛋白二级结构α螺旋（α-helix，Hh）、β折叠（β-sheet，Ee）和无规卷曲（random coil，Cc）分别有243、9和188段，分别占比55.22%、2.05%和42.73%，可见绵羊HTR4蛋白二级结以α卷曲为主。
2.10? ?绵羊HTR4蛋白三级结构预测与分析
三级结构（tertiary structure）是指蛋白质在二级结构基础上的进一步折叠，通过将二级结构元素组装在一起形成每个蛋白质特有的三维构象[12 ]。由图11可知，HTR4基因编码蛋白的三级结构主要由α卷曲折叠缠绕形成。
3? ?小结
绵羊HTR4基因的最长ORF长度为? ? ? 1 317 bp，编码438个氨基酸残基;亮氨酸所占比例最多，为10.27%，分子质量为49 437.09 KDa，理论等电点（pI）为8.32。HTR4基因编码的产物为不稳定性蛋白，其亚细胞定位的结果显示在质膜的可能性最大，为60.9%。HTR4基因编码产物在多种物种中氨基酸序列高度相似，绵羊与牛、山羊在系统发育树中距离最近。HTR4基因的编码产物中不存在信号肽，为非分泌性蛋白但发现了跨膜区，故该蛋白是跨膜蛋白。该基因编码的蛋白有7段跨膜结构。HTR4基因编码的蛋白为亲水蛋白，富含亲水氨基酸。绵羊HTR4基因编码产物的二级结构主要以α螺旋为主，三级结构主要由α螺旋折叠缠绕形成。
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（本文责编：郑立龙）
