茄子遗传转化植株再生体系的优化
张明华等
摘 要：以4个茄子品种的下胚轴和子叶为外植体，通过不同外源激素种类和浓度组合筛选，对茄子遗传转化过程中外植体脱分化诱导、植株再生及生根培养基进行优化，探索建立较为通用完善的茄子遗传转化植株再生体系。结果表明，茄子下胚轴的再生能力要显著高于子叶，不同茄子品种间的分化能力差异明显；最佳愈伤诱导培养基为MS+ZT 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L，最佳植株再生分化培养基为MS+ZT 0.5 mg/L，最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 0.1 mg/L。
关键词：茄子；下胚轴；子叶；植株再生；遗传转化
茄子（Solanum melongena L.）是世界各地广泛栽培的重要蔬菜之一，营养价值丰富，为加快育种进程，国内外已先后从茄子的器官分化[1，2]、花药培养[3]、胚状体诱导[4～6]、原生质体培养[7]、小孢子培养[8，9] 子叶与下胚轴离体再生[10～12]等多方面进行了研究。近30 a来，国内的茄子组织培养研究工作取得了很大进展，但是和同科同属的番茄[13]、马铃薯[14]相比，仍有一定距离。茄子再生体系研究面临的一个主要难题就是不定芽分化频率较低，缺少通用稳定的适于茄子遗传转化的植株再生体系。因此探索高效的受体再生途径，建立完善的遗传转化体系是目前的主要任务。本试验在课题组已有茄子离体培养研究的基础上[15]，探讨了不同外植体、激素配比、基因型等因素对茄子离体培养植株再生的影响。通过对植株再生体系的优化，以期得到普遍适用的茄子离体培养再生体系，提高茄子遗传转化率，促进基因工程在茄子改良育种中的应用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试茄子品种为中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的高代自交系长茄03154、03204，圆茄07683、07675。以种子露白后苗龄10 d的茄子下胚轴、子叶作为外植体。
1.2 无菌苗培养及外植体接种
将茄子种子用75%酒精浸泡30 s，后用无菌水冲洗1次，再用10% NaClO溶液浸泡20 min后用无菌水冲洗3次。接种至附加0.7%琼脂和2%蔗糖的1/2 MS培养基上，置于（25±1）°C、光照时间为16 h/d、光强2 000～3 000 Lx光照培养箱内培养。种子露白后苗龄10 d的无菌苗2片子叶可完全展开时从瓶中取出无菌苗，无菌条件下，将下胚轴切成0.8～1.0 cm小段、子叶切成（3～5）mm×5 mm小块。将子叶正面向上放置，下胚轴横向放置，接种到诱导分化培养基上，相同光照培养箱条件下培养。每个品种、每种处理接种3个培养皿，每皿接种8～10个外植体，重复3次。2周继代1次，4周后统计结果，利用DPS软件进行数据分析。
1.3 培养基的优化
①诱导培养基优化 以MS为基本培养基，设置ZT、6-BA、IAA 3种激素不同种类及不同浓度组合，共12个组合处理，详见表1。
②植株再生培养基优化 以MS为基本培养基，外源激素ZT设0.2、0.5、0.8 mg/L 3个浓度处理。
③再生植株生根培养基优化 以1/2 MS为基本培养基，外源激素NAA设0.10、0.30、0.5 mg/L 3个浓度处理。
所有处理培养基均附加有机成分Morel维生素1 000倍液2 mL/L、蔗糖3%、琼脂8.0%，pH值5.8，121℃温度下高压灭菌15 min。
1.4 不定芽生长和生根统计
待愈伤组织生长出不定芽后，转移至植株再生培养基上，每种培养基接种5个三角瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次，培养2周后统计不定芽生长情况。当不定芽长出2～4片真叶、长2～3 cm时，将其自基部切下并转接于生根培养基上培养。每种培养基接种10个三角瓶，每瓶接种2个再生苗，重复3次，培养4周后统计生根情况。
2 结果与分析
2.1 外植体愈伤诱导培养基的优化
由表2可知，不同配比的12种培养基对4个品种的子叶和下胚轴均能诱导出不定芽，但其诱导率存在显著差异。在不使用6-BA的培养基M1～
M6中，ZT 2.0 mg/L+IAA
0.2 mg/L组合的M4培养基诱导产生不定芽的效果最好。为了研究比较6-BA与ZT对外植体不定芽诱导分化的效果，生长素IAA取最佳浓度0.2 mg/L，分裂素ZT、6-BA取不同浓度进行比较。当只加入6-BA时，M9培养基下胚轴的平均诱导率高于M7和M8培养基；当ZT和
6-BA组合加入诱导培养基时，M10培养基的诱导效果最好，且诱导率明显高于M4和M9。
由DPS软件进行数据统计分析可知，不同激素浓度组合的培养基显著地影响了茄子不定芽的诱导率，4个品种之间表现出相似的变化规律（图1）。2.0 mg/L ZT 和3.0 mg/L 6-BA均能较好地诱导产生不定芽，0.2 mg/L的IAA可以最佳地促进分裂素ZT和6-BA对不定芽的诱导分化。6-BA、ZT对外植体的诱导分化效果与茄子外植体类型和基因型都相关。对于不同外植体，ZT对子叶的诱导效果高于6-BA，最佳浓度为2.0 mg/L；6-BA对下胚轴的诱导效果较好，最佳浓度为3.0 mg/L。对于不同基因型，不定芽诱导的最适分裂素不同，6-BA对圆茄07675和长茄03204的诱导效果高于ZT，ZT对07683和03154诱导效果较好。IAA浓度为 0.2 mg/L，ZT 1.0～2.0 mg/L+6-BA 1.0～2.0 mg/L组合使用时对4个品种的不定芽诱导效果均较好，据此推测，该水平下的ZT+6-BA+IAA组合可以比较广泛地适用于不同茄子品种的不定芽诱导分化。
2.2 外植体取材部位对植株再生的影响
横向放置在诱导培养基上的下胚轴，培养1周后形态学顶端向上翘起，2周后开始有丛生芽在翘起的顶端形成，不经过愈伤组织阶段，直接形成微型的小簇丛生芽结构，同时接触到培养基的下胚轴形态学下端形成愈伤组织（图2A）。在下胚轴形态学顶端没有形成丛生芽或丛生芽生长缓慢的情况下，下端愈伤组织也可分化产生不定芽。平铺在诱导培养基上的子叶，1周后体积明显膨大，伤口处开始产生愈伤组织，2周左右生长出不定芽生长点（图2B）。
摘 要：以4个茄子品种的下胚轴和子叶为外植体，通过不同外源激素种类和浓度组合筛选，对茄子遗传转化过程中外植体脱分化诱导、植株再生及生根培养基进行优化，探索建立较为通用完善的茄子遗传转化植株再生体系。结果表明，茄子下胚轴的再生能力要显著高于子叶，不同茄子品种间的分化能力差异明显；最佳愈伤诱导培养基为MS+ZT 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L，最佳植株再生分化培养基为MS+ZT 0.5 mg/L，最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 0.1 mg/L。
关键词：茄子；下胚轴；子叶；植株再生；遗传转化
茄子（Solanum melongena L.）是世界各地广泛栽培的重要蔬菜之一，营养价值丰富，为加快育种进程，国内外已先后从茄子的器官分化[1，2]、花药培养[3]、胚状体诱导[4～6]、原生质体培养[7]、小孢子培养[8，9] 子叶与下胚轴离体再生[10～12]等多方面进行了研究。近30 a来，国内的茄子组织培养研究工作取得了很大进展，但是和同科同属的番茄[13]、马铃薯[14]相比，仍有一定距离。茄子再生体系研究面临的一个主要难题就是不定芽分化频率较低，缺少通用稳定的适于茄子遗传转化的植株再生体系。因此探索高效的受体再生途径，建立完善的遗传转化体系是目前的主要任务。本试验在课题组已有茄子离体培养研究的基础上[15]，探讨了不同外植体、激素配比、基因型等因素对茄子离体培养植株再生的影响。通过对植株再生体系的优化，以期得到普遍适用的茄子离体培养再生体系，提高茄子遗传转化率，促进基因工程在茄子改良育种中的应用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试茄子品种为中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的高代自交系长茄03154、03204，圆茄07683、07675。以种子露白后苗龄10 d的茄子下胚轴、子叶作为外植体。
1.2 无菌苗培养及外植体接种
将茄子种子用75%酒精浸泡30 s，后用无菌水冲洗1次，再用10% NaClO溶液浸泡20 min后用无菌水冲洗3次。接种至附加0.7%琼脂和2%蔗糖的1/2 MS培养基上，置于（25±1）°C、光照时间为16 h/d、光强2 000～3 000 Lx光照培养箱内培养。种子露白后苗龄10 d的无菌苗2片子叶可完全展开时从瓶中取出无菌苗，无菌条件下，将下胚轴切成0.8～1.0 cm小段、子叶切成（3～5）mm×5 mm小块。将子叶正面向上放置，下胚轴横向放置，接种到诱导分化培养基上，相同光照培养箱条件下培养。每个品种、每种处理接种3个培养皿，每皿接种8～10个外植体，重复3次。2周继代1次，4周后统计结果，利用DPS软件进行数据分析。
1.3 培养基的优化
①诱导培养基优化 以MS为基本培养基，设置ZT、6-BA、IAA 3种激素不同种类及不同浓度组合，共12个组合处理，详见表1。
②植株再生培养基优化 以MS为基本培养基，外源激素ZT设0.2、0.5、0.8 mg/L 3个浓度处理。
③再生植株生根培养基优化 以1/2 MS为基本培养基，外源激素NAA设0.10、0.30、0.5 mg/L 3个浓度处理。
所有处理培养基均附加有机成分Morel维生素1 000倍液2 mL/L、蔗糖3%、琼脂8.0%，pH值5.8，121℃温度下高压灭菌15 min。
1.4 不定芽生长和生根统计
待愈伤组织生长出不定芽后，转移至植株再生培养基上，每种培养基接种5个三角瓶，每瓶接种6个外植体，重复3次，培养2周后统计不定芽生长情况。当不定芽长出2～4片真叶、长2～3 cm时，将其自基部切下并转接于生根培养基上培养。每种培养基接种10个三角瓶，每瓶接种2个再生苗，重复3次，培养4周后统计生根情况。
2 结果与分析
2.1 外植体愈伤诱导培养基的优化
由表2可知，不同配比的12种培养基对4个品种的子叶和下胚轴均能诱导出不定芽，但其诱导率存在显著差异。在不使用6-BA的培养基M1～
M6中，ZT 2.0 mg/L+IAA
0.2 mg/L组合的M4培养基诱导产生不定芽的效果最好。为了研究比较6-BA与ZT对外植体不定芽诱导分化的效果，生长素IAA取最佳浓度0.2 mg/L，分裂素ZT、6-BA取不同浓度进行比较。当只加入6-BA时，M9培养基下胚轴的平均诱导率高于M7和M8培养基；当ZT和
6-BA组合加入诱导培养基时，M10培养基的诱导效果最好，且诱导率明显高于M4和M9。
由DPS软件进行数据统计分析可知，不同激素浓度组合的培养基显著地影响了茄子不定芽的诱导率，4个品种之间表现出相似的变化规律（图1）。2.0 mg/L ZT 和3.0 mg/L 6-BA均能较好地诱导产生不定芽，0.2 mg/L的IAA可以最佳地促进分裂素ZT和6-BA对不定芽的诱导分化。6-BA、ZT对外植体的诱导分化效果与茄子外植体类型和基因型都相关。对于不同外植体，ZT对子叶的诱导效果高于6-BA，最佳浓度为2.0 mg/L；6-BA对下胚轴的诱导效果较好，最佳浓度为3.0 mg/L。对于不同基因型，不定芽诱导的最适分裂素不同，6-BA对圆茄07675和长茄03204的诱导效果高于ZT，ZT对07683和03154诱导效果较好。IAA浓度为 0.2 mg/L，ZT 1.0～2.0 mg/L+6-BA 1.0～2.0 mg/L组合使用时对4个品种的不定芽诱导效果均较好，据此推测，该水平下的ZT+6-BA+IAA组合可以比较广泛地适用于不同茄子品种的不定芽诱导分化。
2.2 外植体取材部位对植株再生的影响
横向放置在诱导培养基上的下胚轴，培养1周后形态学顶端向上翘起，2周后开始有丛生芽在翘起的顶端形成，不经过愈伤组织阶段，直接形成微型的小簇丛生芽结构，同时接触到培养基的下胚轴形态学下端形成愈伤组织（图2A）。在下胚轴形态学顶端没有形成丛生芽或丛生芽生长缓慢的情况下，下端愈伤组织也可分化产生不定芽。平铺在诱导培养基上的子叶，1周后体积明显膨大，伤口处开始产生愈伤组织，2周左右生长出不定芽生长点（图2B）。
