电喷雾质谱脱溶剂过程的改进和应用
杨美成 张文 赵芸 杨鹏翔
摘 要 电喷雾电离（ESI）技术由于脱溶剂过程中产生的电解作用及溶剂蒸发作用，使得酸性溶液喷雾液滴中质子残留，pH值降低，导致蛋白质在液滴中的空间构象受到破坏，所得质谱图无法正确反映蛋白质在溶剂中的真实构象。本研究以两种经典蛋白质（细胞色素C和肌红蛋白）为实验样本，通过在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器，产生高流速大流量气流，改善ESI脱溶剂过程。 结果表明，电喷雾电离的初始液滴在高流速大流量气流引发的激烈碰撞中，被切割为粒径极小的喷雾液滴，同时液滴所带电荷被均分，从而使液滴pH值保持稳定，避免因ESI脱溶剂作用而破坏蛋白质的空间构象。基于高流速大流量气流在ESI脱溶剂过程的新机理，在使用商业化的ESI源时，着重于鞘气等脱溶剂辅助气体的使用和调节。通过增大鞘气的气流量保持蛋白质的生物构象。
关键词 电喷雾电离； 脱溶剂作用； 蛋白质空间构象； 喷雾液滴
1 引 言
电喷雾电离（Electronspray ionization， ESI）质谱已被广泛应用于溶液中蛋白质的空间构象研究， 包括肌红蛋白（Myoglobin）[1]、细胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等为人们所熟知的蛋白。虽然蛋白质电荷分布在ESI质谱图上极具特色，但相应信息并不能直接反映蛋白质在溶液中的构象。众所周知，pH值和温度对蛋白质大分子的构象具有重大影响。由于ESI产生的电解作用[4]和脱溶剂作用[5]，在ESI正离子模式下喷出液滴的pH值比溶液实际pH值低得多[6]。在适用于大分子（包括蛋白质）的ESI带电残渣模型中[5]，液滴的pH值会不断降低， 直至达到雷利极限，从而影响液滴中蛋白质的构象。此外，质谱仪的真空度[7]、雾帘气（Curtain gas） [8，9]、毛细管温度[10]以及锥电压[11]等因素都对蛋白质的构象具有一定的影响。ESI正离子模式下， 电荷价态的高低和电荷分布（Charge state distribution， CSD）的宽窄常被用于表征蛋白质在溶液中是紧密折叠还是去折叠的构象[11]。蛋白质的天然构象常有一个狭窄的低电荷价态的CSD。 在特定条件下（如酸性溶液，高温和有机溶剂）， 蛋白质天然构象因被破坏而导致变性，ESI质谱图中会呈现更宽且更高电荷价态的CSD[2，12]。目前，针对在ESI过程中如何保持蛋白质构象的研究已有大量新方法报道，包括开发稳定试剂[13]和改进ESI源[14～16]等。
本研究对ESI脱溶剂过程进行了改进，在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器（AA），利用空气放大器产生的高流速大流量气流，引发喷雾液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分为若干小液滴的同时，均分液滴中残留质子，从而使蛋白质构象得以保持。探讨了脱溶剂方法改进后的相应机理以及如何利用商品ESI源的辅助气体尽量保持蛋白质等大分子在电喷离子化过程中的生物性状。
2 实验部分
2.1 仪器设备
LTQ离子阱质谱仪：配备商品ESI源（HESIII）的LTQ离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘气，0～50 arb（气体流量单位）；辅助气： 5～25 arb；辅助气的加热温度： 20～300 ℃。
ESIAALTQ离子阱质谱仪：在自制的ESI源和LTQ离子阱质谱仪之间加入空气放大器（AA）以改进电喷雾脱溶剂过程。高流速大流量气流由空气放大器产生。如图1所示，引入空气放大器的少量压缩空气在环形孔处被加速到超音速，产生了一个低压真空区。周围大量空气被吸进这个低压真空区，即可在空气放大器的环形孔处产生高流速大流量气流。利用空气放大器，气流量4～6 L/min的压缩空气可以产生40～70 L/min气流。为了让LTQ进样端插入空气放大器，原加热毛细管（内径0.5 mm，长10 cm）换成不锈钢毛细管（内径 0.76 mm，长度33 cm）。在相同的粘性流条件下，新的毛细管提供了与原毛细管相同的气通量[17]。自制ESI源中的石英毛细管喷嘴（内径100 μm，外径160 μm）直接与样品注射器相连。通过直接在样品注射器的针尖处施加高电压并传递到ESI的毛细管喷嘴，从而实现电喷雾电离。除在研究气体流速与蛋白质构象关系实验时，空气放大器的氮气进气压力有所改变，其余实验压力均设定在40 psi，相当于4.0 L/min的进气流量。出口处的气体流速估计为40 L/min，比商业ESI使用的雾帘气或鞘气的气流量大。优化ESI源、空气放大器和加热毛细管的相对位置，以获得最大的离子化效率。所有实验样品流速均设为3 μL/min。
2.2 样品试剂
细胞色素C和肌红蛋白（Sigma公司），直接用于实验；固体蛋白质样品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 备用；实验过程中加入HCl或NH4OH调节溶液的pH值。
3 结果与讨论
3.1 溶液pH值、ESI脱溶剂过程及质谱图CSD分布关系
细胞色素C是一种被广泛研究的蛋白质[2，3，18]，文献报道，运用传统ESI源，当溶液pH值在2～3时，质谱图上呈现典型的双模双峰电荷分布。图2展示了ESI源改进前后细胞色素C在溶液pH值为1.5，2.4和4.6时的ESI质谱图。当空气放大器关闭时，与文献[2，3]报道结果一致： pH值=1.5时，细胞色素C的质谱图呈现较宽且高价态单模电荷分布，表明蛋白质是完全展开的构象；pH值=4.6时，质谱图呈现低价态较窄的单模电荷分布，表明细胞色素C为紧密折叠的构象；pH=2.4时，呈现双模双峰电荷分布，表明细胞色素C此时处于从紧密折叠到完全展开的过渡状态[2]。空气放大器打开时，不同pH值溶液的细胞色素C质谱图电荷价态向更低价态移动；同时，双模双峰电荷分布消失（pH=2.4），呈现出低电荷数的单模分布。实验表明，在低pH值条件下，使用高流速大流量气流可以保持细胞色素C紧密折叠的生物构象。
3.2 采用高流速大流量气流的ESI脱溶剂过程可保持蛋白质构象的机理研究
由图2Aa可见，高流速大流量气流降低了细胞色素C单模电荷分布5个单位（最高电荷从+16降至+11），而图2Cc的溶液中并未观察到明显的电荷降低。这种明显的电荷降低不可能仅是由于气体碰撞时电荷转移作用[19]引起的，因为电荷转移作用与样品的pH值无关，且程度相似。
为了更好地描述高流速大流量气流带来的电荷分布变化，使用公式（1）计算平均电荷数 ：
摘 要 电喷雾电离（ESI）技术由于脱溶剂过程中产生的电解作用及溶剂蒸发作用，使得酸性溶液喷雾液滴中质子残留，pH值降低，导致蛋白质在液滴中的空间构象受到破坏，所得质谱图无法正确反映蛋白质在溶剂中的真实构象。本研究以两种经典蛋白质（细胞色素C和肌红蛋白）为实验样本，通过在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器，产生高流速大流量气流，改善ESI脱溶剂过程。 结果表明，电喷雾电离的初始液滴在高流速大流量气流引发的激烈碰撞中，被切割为粒径极小的喷雾液滴，同时液滴所带电荷被均分，从而使液滴pH值保持稳定，避免因ESI脱溶剂作用而破坏蛋白质的空间构象。基于高流速大流量气流在ESI脱溶剂过程的新机理，在使用商业化的ESI源时，着重于鞘气等脱溶剂辅助气体的使用和调节。通过增大鞘气的气流量保持蛋白质的生物构象。
关键词 电喷雾电离； 脱溶剂作用； 蛋白质空间构象； 喷雾液滴
1 引 言
电喷雾电离（Electronspray ionization， ESI）质谱已被广泛应用于溶液中蛋白质的空间构象研究， 包括肌红蛋白（Myoglobin）[1]、细胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等为人们所熟知的蛋白。虽然蛋白质电荷分布在ESI质谱图上极具特色，但相应信息并不能直接反映蛋白质在溶液中的构象。众所周知，pH值和温度对蛋白质大分子的构象具有重大影响。由于ESI产生的电解作用[4]和脱溶剂作用[5]，在ESI正离子模式下喷出液滴的pH值比溶液实际pH值低得多[6]。在适用于大分子（包括蛋白质）的ESI带电残渣模型中[5]，液滴的pH值会不断降低， 直至达到雷利极限，从而影响液滴中蛋白质的构象。此外，质谱仪的真空度[7]、雾帘气（Curtain gas） [8，9]、毛细管温度[10]以及锥电压[11]等因素都对蛋白质的构象具有一定的影响。ESI正离子模式下， 电荷价态的高低和电荷分布（Charge state distribution， CSD）的宽窄常被用于表征蛋白质在溶液中是紧密折叠还是去折叠的构象[11]。蛋白质的天然构象常有一个狭窄的低电荷价态的CSD。 在特定条件下（如酸性溶液，高温和有机溶剂）， 蛋白质天然构象因被破坏而导致变性，ESI质谱图中会呈现更宽且更高电荷价态的CSD[2，12]。目前，针对在ESI过程中如何保持蛋白质构象的研究已有大量新方法报道，包括开发稳定试剂[13]和改进ESI源[14～16]等。
本研究对ESI脱溶剂过程进行了改进，在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器（AA），利用空气放大器产生的高流速大流量气流，引发喷雾液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分为若干小液滴的同时，均分液滴中残留质子，从而使蛋白质构象得以保持。探讨了脱溶剂方法改进后的相应机理以及如何利用商品ESI源的辅助气体尽量保持蛋白质等大分子在电喷离子化过程中的生物性状。
2 实验部分
2.1 仪器设备
LTQ离子阱质谱仪：配备商品ESI源（HESIII）的LTQ离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘气，0～50 arb（气体流量单位）；辅助气： 5～25 arb；辅助气的加热温度： 20～300 ℃。
ESIAALTQ离子阱质谱仪：在自制的ESI源和LTQ离子阱质谱仪之间加入空气放大器（AA）以改进电喷雾脱溶剂过程。高流速大流量气流由空气放大器产生。如图1所示，引入空气放大器的少量压缩空气在环形孔处被加速到超音速，产生了一个低压真空区。周围大量空气被吸进这个低压真空区，即可在空气放大器的环形孔处产生高流速大流量气流。利用空气放大器，气流量4～6 L/min的压缩空气可以产生40～70 L/min气流。为了让LTQ进样端插入空气放大器，原加热毛细管（内径0.5 mm，长10 cm）换成不锈钢毛细管（内径 0.76 mm，长度33 cm）。在相同的粘性流条件下，新的毛细管提供了与原毛细管相同的气通量[17]。自制ESI源中的石英毛细管喷嘴（内径100 μm，外径160 μm）直接与样品注射器相连。通过直接在样品注射器的针尖处施加高电压并传递到ESI的毛细管喷嘴，从而实现电喷雾电离。除在研究气体流速与蛋白质构象关系实验时，空气放大器的氮气进气压力有所改变，其余实验压力均设定在40 psi，相当于4.0 L/min的进气流量。出口处的气体流速估计为40 L/min，比商业ESI使用的雾帘气或鞘气的气流量大。优化ESI源、空气放大器和加热毛细管的相对位置，以获得最大的离子化效率。所有实验样品流速均设为3 μL/min。
2.2 样品试剂
细胞色素C和肌红蛋白（Sigma公司），直接用于实验；固体蛋白质样品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 备用；实验过程中加入HCl或NH4OH调节溶液的pH值。
3 结果与讨论
3.1 溶液pH值、ESI脱溶剂过程及质谱图CSD分布关系
细胞色素C是一种被广泛研究的蛋白质[2，3，18]，文献报道，运用传统ESI源，当溶液pH值在2～3时，质谱图上呈现典型的双模双峰电荷分布。图2展示了ESI源改进前后细胞色素C在溶液pH值为1.5，2.4和4.6时的ESI质谱图。当空气放大器关闭时，与文献[2，3]报道结果一致： pH值=1.5时，细胞色素C的质谱图呈现较宽且高价态单模电荷分布，表明蛋白质是完全展开的构象；pH值=4.6时，质谱图呈现低价态较窄的单模电荷分布，表明细胞色素C为紧密折叠的构象；pH=2.4时，呈现双模双峰电荷分布，表明细胞色素C此时处于从紧密折叠到完全展开的过渡状态[2]。空气放大器打开时，不同pH值溶液的细胞色素C质谱图电荷价态向更低价态移动；同时，双模双峰电荷分布消失（pH=2.4），呈现出低电荷数的单模分布。实验表明，在低pH值条件下，使用高流速大流量气流可以保持细胞色素C紧密折叠的生物构象。
3.2 采用高流速大流量气流的ESI脱溶剂过程可保持蛋白质构象的机理研究
由图2Aa可见，高流速大流量气流降低了细胞色素C单模电荷分布5个单位（最高电荷从+16降至+11），而图2Cc的溶液中并未观察到明显的电荷降低。这种明显的电荷降低不可能仅是由于气体碰撞时电荷转移作用[19]引起的，因为电荷转移作用与样品的pH值无关，且程度相似。
为了更好地描述高流速大流量气流带来的电荷分布变化，使用公式（1）计算平均电荷数 ：
摘 要 电喷雾电离（ESI）技术由于脱溶剂过程中产生的电解作用及溶剂蒸发作用，使得酸性溶液喷雾液滴中质子残留，pH值降低，导致蛋白质在液滴中的空间构象受到破坏，所得质谱图无法正确反映蛋白质在溶剂中的真实构象。本研究以两种经典蛋白质（细胞色素C和肌红蛋白）为实验样本，通过在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器，产生高流速大流量气流，改善ESI脱溶剂过程。 结果表明，电喷雾电离的初始液滴在高流速大流量气流引发的激烈碰撞中，被切割为粒径极小的喷雾液滴，同时液滴所带电荷被均分，从而使液滴pH值保持稳定，避免因ESI脱溶剂作用而破坏蛋白质的空间构象。基于高流速大流量气流在ESI脱溶剂过程的新机理，在使用商业化的ESI源时，着重于鞘气等脱溶剂辅助气体的使用和调节。通过增大鞘气的气流量保持蛋白质的生物构象。
关键词 电喷雾电离； 脱溶剂作用； 蛋白质空间构象； 喷雾液滴
1 引 言
电喷雾电离（Electronspray ionization， ESI）质谱已被广泛应用于溶液中蛋白质的空间构象研究， 包括肌红蛋白（Myoglobin）[1]、细胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等为人们所熟知的蛋白。虽然蛋白质电荷分布在ESI质谱图上极具特色，但相应信息并不能直接反映蛋白质在溶液中的构象。众所周知，pH值和温度对蛋白质大分子的构象具有重大影响。由于ESI产生的电解作用[4]和脱溶剂作用[5]，在ESI正离子模式下喷出液滴的pH值比溶液实际pH值低得多[6]。在适用于大分子（包括蛋白质）的ESI带电残渣模型中[5]，液滴的pH值会不断降低， 直至达到雷利极限，从而影响液滴中蛋白质的构象。此外，质谱仪的真空度[7]、雾帘气（Curtain gas） [8，9]、毛细管温度[10]以及锥电压[11]等因素都对蛋白质的构象具有一定的影响。ESI正离子模式下， 电荷价态的高低和电荷分布（Charge state distribution， CSD）的宽窄常被用于表征蛋白质在溶液中是紧密折叠还是去折叠的构象[11]。蛋白质的天然构象常有一个狭窄的低电荷价态的CSD。 在特定条件下（如酸性溶液，高温和有机溶剂）， 蛋白质天然构象因被破坏而导致变性，ESI质谱图中会呈现更宽且更高电荷价态的CSD[2，12]。目前，针对在ESI过程中如何保持蛋白质构象的研究已有大量新方法报道，包括开发稳定试剂[13]和改进ESI源[14～16]等。
本研究对ESI脱溶剂过程进行了改进，在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器（AA），利用空气放大器产生的高流速大流量气流，引发喷雾液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分为若干小液滴的同时，均分液滴中残留质子，从而使蛋白质构象得以保持。探讨了脱溶剂方法改进后的相应机理以及如何利用商品ESI源的辅助气体尽量保持蛋白质等大分子在电喷离子化过程中的生物性状。
2 实验部分
2.1 仪器设备
LTQ离子阱质谱仪：配备商品ESI源（HESIII）的LTQ离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘气，0～50 arb（气体流量单位）；辅助气： 5～25 arb；辅助气的加热温度： 20～300 ℃。
ESIAALTQ离子阱质谱仪：在自制的ESI源和LTQ离子阱质谱仪之间加入空气放大器（AA）以改进电喷雾脱溶剂过程。高流速大流量气流由空气放大器产生。如图1所示，引入空气放大器的少量压缩空气在环形孔处被加速到超音速，产生了一个低压真空区。周围大量空气被吸进这个低压真空区，即可在空气放大器的环形孔处产生高流速大流量气流。利用空气放大器，气流量4～6 L/min的压缩空气可以产生40～70 L/min气流。为了让LTQ进样端插入空气放大器，原加热毛细管（内径0.5 mm，长10 cm）换成不锈钢毛细管（内径 0.76 mm，长度33 cm）。在相同的粘性流条件下，新的毛细管提供了与原毛细管相同的气通量[17]。自制ESI源中的石英毛细管喷嘴（内径100 μm，外径160 μm）直接与样品注射器相连。通过直接在样品注射器的针尖处施加高电压并传递到ESI的毛细管喷嘴，从而实现电喷雾电离。除在研究气体流速与蛋白质构象关系实验时，空气放大器的氮气进气压力有所改变，其余实验压力均设定在40 psi，相当于4.0 L/min的进气流量。出口处的气体流速估计为40 L/min，比商业ESI使用的雾帘气或鞘气的气流量大。优化ESI源、空气放大器和加热毛细管的相对位置，以获得最大的离子化效率。所有实验样品流速均设为3 μL/min。
2.2 样品试剂
细胞色素C和肌红蛋白（Sigma公司），直接用于实验；固体蛋白质样品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 备用；实验过程中加入HCl或NH4OH调节溶液的pH值。
3 结果与讨论
3.1 溶液pH值、ESI脱溶剂过程及质谱图CSD分布关系
细胞色素C是一种被广泛研究的蛋白质[2，3，18]，文献报道，运用传统ESI源，当溶液pH值在2～3时，质谱图上呈现典型的双模双峰电荷分布。图2展示了ESI源改进前后细胞色素C在溶液pH值为1.5，2.4和4.6时的ESI质谱图。当空气放大器关闭时，与文献[2，3]报道结果一致： pH值=1.5时，细胞色素C的质谱图呈现较宽且高价态单模电荷分布，表明蛋白质是完全展开的构象；pH值=4.6时，质谱图呈现低价态较窄的单模电荷分布，表明细胞色素C为紧密折叠的构象；pH=2.4时，呈现双模双峰电荷分布，表明细胞色素C此时处于从紧密折叠到完全展开的过渡状态[2]。空气放大器打开时，不同pH值溶液的细胞色素C质谱图电荷价态向更低价态移动；同时，双模双峰电荷分布消失（pH=2.4），呈现出低电荷数的单模分布。实验表明，在低pH值条件下，使用高流速大流量气流可以保持细胞色素C紧密折叠的生物构象。
3.2 采用高流速大流量气流的ESI脱溶剂过程可保持蛋白质构象的机理研究
由图2Aa可见，高流速大流量气流降低了细胞色素C单模电荷分布5个单位（最高电荷从+16降至+11），而图2Cc的溶液中并未观察到明显的电荷降低。这种明显的电荷降低不可能仅是由于气体碰撞时电荷转移作用[19]引起的，因为电荷转移作用与样品的pH值无关，且程度相似。
为了更好地描述高流速大流量气流带来的电荷分布变化，使用公式（1）计算平均电荷数 ：
摘 要 电喷雾电离（ESI）技术由于脱溶剂过程中产生的电解作用及溶剂蒸发作用，使得酸性溶液喷雾液滴中质子残留，pH值降低，导致蛋白质在液滴中的空间构象受到破坏，所得质谱图无法正确反映蛋白质在溶剂中的真实构象。本研究以两种经典蛋白质（细胞色素C和肌红蛋白）为实验样本，通过在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器，产生高流速大流量气流，改善ESI脱溶剂过程。 结果表明，电喷雾电离的初始液滴在高流速大流量气流引发的激烈碰撞中，被切割为粒径极小的喷雾液滴，同时液滴所带电荷被均分，从而使液滴pH值保持稳定，避免因ESI脱溶剂作用而破坏蛋白质的空间构象。基于高流速大流量气流在ESI脱溶剂过程的新机理，在使用商业化的ESI源时，着重于鞘气等脱溶剂辅助气体的使用和调节。通过增大鞘气的气流量保持蛋白质的生物构象。
关键词 电喷雾电离； 脱溶剂作用； 蛋白质空间构象； 喷雾液滴
1 引 言
电喷雾电离（Electronspray ionization， ESI）质谱已被广泛应用于溶液中蛋白质的空间构象研究， 包括肌红蛋白（Myoglobin）[1]、细胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等为人们所熟知的蛋白。虽然蛋白质电荷分布在ESI质谱图上极具特色，但相应信息并不能直接反映蛋白质在溶液中的构象。众所周知，pH值和温度对蛋白质大分子的构象具有重大影响。由于ESI产生的电解作用[4]和脱溶剂作用[5]，在ESI正离子模式下喷出液滴的pH值比溶液实际pH值低得多[6]。在适用于大分子（包括蛋白质）的ESI带电残渣模型中[5]，液滴的pH值会不断降低， 直至达到雷利极限，从而影响液滴中蛋白质的构象。此外，质谱仪的真空度[7]、雾帘气（Curtain gas） [8，9]、毛细管温度[10]以及锥电压[11]等因素都对蛋白质的构象具有一定的影响。ESI正离子模式下， 电荷价态的高低和电荷分布（Charge state distribution， CSD）的宽窄常被用于表征蛋白质在溶液中是紧密折叠还是去折叠的构象[11]。蛋白质的天然构象常有一个狭窄的低电荷价态的CSD。 在特定条件下（如酸性溶液，高温和有机溶剂）， 蛋白质天然构象因被破坏而导致变性，ESI质谱图中会呈现更宽且更高电荷价态的CSD[2，12]。目前，针对在ESI过程中如何保持蛋白质构象的研究已有大量新方法报道，包括开发稳定试剂[13]和改进ESI源[14～16]等。
本研究对ESI脱溶剂过程进行了改进，在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器（AA），利用空气放大器产生的高流速大流量气流，引发喷雾液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分为若干小液滴的同时，均分液滴中残留质子，从而使蛋白质构象得以保持。探讨了脱溶剂方法改进后的相应机理以及如何利用商品ESI源的辅助气体尽量保持蛋白质等大分子在电喷离子化过程中的生物性状。
2 实验部分
2.1 仪器设备
LTQ离子阱质谱仪：配备商品ESI源（HESIII）的LTQ离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘气，0～50 arb（气体流量单位）；辅助气： 5～25 arb；辅助气的加热温度： 20～300 ℃。
ESIAALTQ离子阱质谱仪：在自制的ESI源和LTQ离子阱质谱仪之间加入空气放大器（AA）以改进电喷雾脱溶剂过程。高流速大流量气流由空气放大器产生。如图1所示，引入空气放大器的少量压缩空气在环形孔处被加速到超音速，产生了一个低压真空区。周围大量空气被吸进这个低压真空区，即可在空气放大器的环形孔处产生高流速大流量气流。利用空气放大器，气流量4～6 L/min的压缩空气可以产生40～70 L/min气流。为了让LTQ进样端插入空气放大器，原加热毛细管（内径0.5 mm，长10 cm）换成不锈钢毛细管（内径 0.76 mm，长度33 cm）。在相同的粘性流条件下，新的毛细管提供了与原毛细管相同的气通量[17]。自制ESI源中的石英毛细管喷嘴（内径100 μm，外径160 μm）直接与样品注射器相连。通过直接在样品注射器的针尖处施加高电压并传递到ESI的毛细管喷嘴，从而实现电喷雾电离。除在研究气体流速与蛋白质构象关系实验时，空气放大器的氮气进气压力有所改变，其余实验压力均设定在40 psi，相当于4.0 L/min的进气流量。出口处的气体流速估计为40 L/min，比商业ESI使用的雾帘气或鞘气的气流量大。优化ESI源、空气放大器和加热毛细管的相对位置，以获得最大的离子化效率。所有实验样品流速均设为3 μL/min。
2.2 样品试剂
细胞色素C和肌红蛋白（Sigma公司），直接用于实验；固体蛋白质样品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 备用；实验过程中加入HCl或NH4OH调节溶液的pH值。
3 结果与讨论
3.1 溶液pH值、ESI脱溶剂过程及质谱图CSD分布关系
细胞色素C是一种被广泛研究的蛋白质[2，3，18]，文献报道，运用传统ESI源，当溶液pH值在2～3时，质谱图上呈现典型的双模双峰电荷分布。图2展示了ESI源改进前后细胞色素C在溶液pH值为1.5，2.4和4.6时的ESI质谱图。当空气放大器关闭时，与文献[2，3]报道结果一致： pH值=1.5时，细胞色素C的质谱图呈现较宽且高价态单模电荷分布，表明蛋白质是完全展开的构象；pH值=4.6时，质谱图呈现低价态较窄的单模电荷分布，表明细胞色素C为紧密折叠的构象；pH=2.4时，呈现双模双峰电荷分布，表明细胞色素C此时处于从紧密折叠到完全展开的过渡状态[2]。空气放大器打开时，不同pH值溶液的细胞色素C质谱图电荷价态向更低价态移动；同时，双模双峰电荷分布消失（pH=2.4），呈现出低电荷数的单模分布。实验表明，在低pH值条件下，使用高流速大流量气流可以保持细胞色素C紧密折叠的生物构象。
3.2 采用高流速大流量气流的ESI脱溶剂过程可保持蛋白质构象的机理研究
由图2Aa可见，高流速大流量气流降低了细胞色素C单模电荷分布5个单位（最高电荷从+16降至+11），而图2Cc的溶液中并未观察到明显的电荷降低。这种明显的电荷降低不可能仅是由于气体碰撞时电荷转移作用[19]引起的，因为电荷转移作用与样品的pH值无关，且程度相似。
为了更好地描述高流速大流量气流带来的电荷分布变化，使用公式（1）计算平均电荷数 ：
摘 要 电喷雾电离（ESI）技术由于脱溶剂过程中产生的电解作用及溶剂蒸发作用，使得酸性溶液喷雾液滴中质子残留，pH值降低，导致蛋白质在液滴中的空间构象受到破坏，所得质谱图无法正确反映蛋白质在溶剂中的真实构象。本研究以两种经典蛋白质（细胞色素C和肌红蛋白）为实验样本，通过在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器，产生高流速大流量气流，改善ESI脱溶剂过程。 结果表明，电喷雾电离的初始液滴在高流速大流量气流引发的激烈碰撞中，被切割为粒径极小的喷雾液滴，同时液滴所带电荷被均分，从而使液滴pH值保持稳定，避免因ESI脱溶剂作用而破坏蛋白质的空间构象。基于高流速大流量气流在ESI脱溶剂过程的新机理，在使用商业化的ESI源时，着重于鞘气等脱溶剂辅助气体的使用和调节。通过增大鞘气的气流量保持蛋白质的生物构象。
关键词 电喷雾电离； 脱溶剂作用； 蛋白质空间构象； 喷雾液滴
1 引 言
电喷雾电离（Electronspray ionization， ESI）质谱已被广泛应用于溶液中蛋白质的空间构象研究， 包括肌红蛋白（Myoglobin）[1]、细胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等为人们所熟知的蛋白。虽然蛋白质电荷分布在ESI质谱图上极具特色，但相应信息并不能直接反映蛋白质在溶液中的构象。众所周知，pH值和温度对蛋白质大分子的构象具有重大影响。由于ESI产生的电解作用[4]和脱溶剂作用[5]，在ESI正离子模式下喷出液滴的pH值比溶液实际pH值低得多[6]。在适用于大分子（包括蛋白质）的ESI带电残渣模型中[5]，液滴的pH值会不断降低， 直至达到雷利极限，从而影响液滴中蛋白质的构象。此外，质谱仪的真空度[7]、雾帘气（Curtain gas） [8，9]、毛细管温度[10]以及锥电压[11]等因素都对蛋白质的构象具有一定的影响。ESI正离子模式下， 电荷价态的高低和电荷分布（Charge state distribution， CSD）的宽窄常被用于表征蛋白质在溶液中是紧密折叠还是去折叠的构象[11]。蛋白质的天然构象常有一个狭窄的低电荷价态的CSD。 在特定条件下（如酸性溶液，高温和有机溶剂）， 蛋白质天然构象因被破坏而导致变性，ESI质谱图中会呈现更宽且更高电荷价态的CSD[2，12]。目前，针对在ESI过程中如何保持蛋白质构象的研究已有大量新方法报道，包括开发稳定试剂[13]和改进ESI源[14～16]等。
本研究对ESI脱溶剂过程进行了改进，在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器（AA），利用空气放大器产生的高流速大流量气流，引发喷雾液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分为若干小液滴的同时，均分液滴中残留质子，从而使蛋白质构象得以保持。探讨了脱溶剂方法改进后的相应机理以及如何利用商品ESI源的辅助气体尽量保持蛋白质等大分子在电喷离子化过程中的生物性状。
2 实验部分
2.1 仪器设备
LTQ离子阱质谱仪：配备商品ESI源（HESIII）的LTQ离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘气，0～50 arb（气体流量单位）；辅助气： 5～25 arb；辅助气的加热温度： 20～300 ℃。
ESIAALTQ离子阱质谱仪：在自制的ESI源和LTQ离子阱质谱仪之间加入空气放大器（AA）以改进电喷雾脱溶剂过程。高流速大流量气流由空气放大器产生。如图1所示，引入空气放大器的少量压缩空气在环形孔处被加速到超音速，产生了一个低压真空区。周围大量空气被吸进这个低压真空区，即可在空气放大器的环形孔处产生高流速大流量气流。利用空气放大器，气流量4～6 L/min的压缩空气可以产生40～70 L/min气流。为了让LTQ进样端插入空气放大器，原加热毛细管（内径0.5 mm，长10 cm）换成不锈钢毛细管（内径 0.76 mm，长度33 cm）。在相同的粘性流条件下，新的毛细管提供了与原毛细管相同的气通量[17]。自制ESI源中的石英毛细管喷嘴（内径100 μm，外径160 μm）直接与样品注射器相连。通过直接在样品注射器的针尖处施加高电压并传递到ESI的毛细管喷嘴，从而实现电喷雾电离。除在研究气体流速与蛋白质构象关系实验时，空气放大器的氮气进气压力有所改变，其余实验压力均设定在40 psi，相当于4.0 L/min的进气流量。出口处的气体流速估计为40 L/min，比商业ESI使用的雾帘气或鞘气的气流量大。优化ESI源、空气放大器和加热毛细管的相对位置，以获得最大的离子化效率。所有实验样品流速均设为3 μL/min。
2.2 样品试剂
细胞色素C和肌红蛋白（Sigma公司），直接用于实验；固体蛋白质样品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 备用；实验过程中加入HCl或NH4OH调节溶液的pH值。
3 结果与讨论
3.1 溶液pH值、ESI脱溶剂过程及质谱图CSD分布关系
细胞色素C是一种被广泛研究的蛋白质[2，3，18]，文献报道，运用传统ESI源，当溶液pH值在2～3时，质谱图上呈现典型的双模双峰电荷分布。图2展示了ESI源改进前后细胞色素C在溶液pH值为1.5，2.4和4.6时的ESI质谱图。当空气放大器关闭时，与文献[2，3]报道结果一致： pH值=1.5时，细胞色素C的质谱图呈现较宽且高价态单模电荷分布，表明蛋白质是完全展开的构象；pH值=4.6时，质谱图呈现低价态较窄的单模电荷分布，表明细胞色素C为紧密折叠的构象；pH=2.4时，呈现双模双峰电荷分布，表明细胞色素C此时处于从紧密折叠到完全展开的过渡状态[2]。空气放大器打开时，不同pH值溶液的细胞色素C质谱图电荷价态向更低价态移动；同时，双模双峰电荷分布消失（pH=2.4），呈现出低电荷数的单模分布。实验表明，在低pH值条件下，使用高流速大流量气流可以保持细胞色素C紧密折叠的生物构象。
3.2 采用高流速大流量气流的ESI脱溶剂过程可保持蛋白质构象的机理研究
由图2Aa可见，高流速大流量气流降低了细胞色素C单模电荷分布5个单位（最高电荷从+16降至+11），而图2Cc的溶液中并未观察到明显的电荷降低。这种明显的电荷降低不可能仅是由于气体碰撞时电荷转移作用[19]引起的，因为电荷转移作用与样品的pH值无关，且程度相似。
为了更好地描述高流速大流量气流带来的电荷分布变化，使用公式（1）计算平均电荷数 ：
摘 要 电喷雾电离（ESI）技术由于脱溶剂过程中产生的电解作用及溶剂蒸发作用，使得酸性溶液喷雾液滴中质子残留，pH值降低，导致蛋白质在液滴中的空间构象受到破坏，所得质谱图无法正确反映蛋白质在溶剂中的真实构象。本研究以两种经典蛋白质（细胞色素C和肌红蛋白）为实验样本，通过在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器，产生高流速大流量气流，改善ESI脱溶剂过程。 结果表明，电喷雾电离的初始液滴在高流速大流量气流引发的激烈碰撞中，被切割为粒径极小的喷雾液滴，同时液滴所带电荷被均分，从而使液滴pH值保持稳定，避免因ESI脱溶剂作用而破坏蛋白质的空间构象。基于高流速大流量气流在ESI脱溶剂过程的新机理，在使用商业化的ESI源时，着重于鞘气等脱溶剂辅助气体的使用和调节。通过增大鞘气的气流量保持蛋白质的生物构象。
关键词 电喷雾电离； 脱溶剂作用； 蛋白质空间构象； 喷雾液滴
1 引 言
电喷雾电离（Electronspray ionization， ESI）质谱已被广泛应用于溶液中蛋白质的空间构象研究， 包括肌红蛋白（Myoglobin）[1]、细胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等为人们所熟知的蛋白。虽然蛋白质电荷分布在ESI质谱图上极具特色，但相应信息并不能直接反映蛋白质在溶液中的构象。众所周知，pH值和温度对蛋白质大分子的构象具有重大影响。由于ESI产生的电解作用[4]和脱溶剂作用[5]，在ESI正离子模式下喷出液滴的pH值比溶液实际pH值低得多[6]。在适用于大分子（包括蛋白质）的ESI带电残渣模型中[5]，液滴的pH值会不断降低， 直至达到雷利极限，从而影响液滴中蛋白质的构象。此外，质谱仪的真空度[7]、雾帘气（Curtain gas） [8，9]、毛细管温度[10]以及锥电压[11]等因素都对蛋白质的构象具有一定的影响。ESI正离子模式下， 电荷价态的高低和电荷分布（Charge state distribution， CSD）的宽窄常被用于表征蛋白质在溶液中是紧密折叠还是去折叠的构象[11]。蛋白质的天然构象常有一个狭窄的低电荷价态的CSD。 在特定条件下（如酸性溶液，高温和有机溶剂）， 蛋白质天然构象因被破坏而导致变性，ESI质谱图中会呈现更宽且更高电荷价态的CSD[2，12]。目前，针对在ESI过程中如何保持蛋白质构象的研究已有大量新方法报道，包括开发稳定试剂[13]和改进ESI源[14～16]等。
本研究对ESI脱溶剂过程进行了改进，在ESI源和质谱仪进样端中间加入自行设计的空气放大器（AA），利用空气放大器产生的高流速大流量气流，引发喷雾液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分为若干小液滴的同时，均分液滴中残留质子，从而使蛋白质构象得以保持。探讨了脱溶剂方法改进后的相应机理以及如何利用商品ESI源的辅助气体尽量保持蛋白质等大分子在电喷离子化过程中的生物性状。
2 实验部分
2.1 仪器设备
LTQ离子阱质谱仪：配备商品ESI源（HESIII）的LTQ离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘气，0～50 arb（气体流量单位）；辅助气： 5～25 arb；辅助气的加热温度： 20～300 ℃。
ESIAALTQ离子阱质谱仪：在自制的ESI源和LTQ离子阱质谱仪之间加入空气放大器（AA）以改进电喷雾脱溶剂过程。高流速大流量气流由空气放大器产生。如图1所示，引入空气放大器的少量压缩空气在环形孔处被加速到超音速，产生了一个低压真空区。周围大量空气被吸进这个低压真空区，即可在空气放大器的环形孔处产生高流速大流量气流。利用空气放大器，气流量4～6 L/min的压缩空气可以产生40～70 L/min气流。为了让LTQ进样端插入空气放大器，原加热毛细管（内径0.5 mm，长10 cm）换成不锈钢毛细管（内径 0.76 mm，长度33 cm）。在相同的粘性流条件下，新的毛细管提供了与原毛细管相同的气通量[17]。自制ESI源中的石英毛细管喷嘴（内径100 μm，外径160 μm）直接与样品注射器相连。通过直接在样品注射器的针尖处施加高电压并传递到ESI的毛细管喷嘴，从而实现电喷雾电离。除在研究气体流速与蛋白质构象关系实验时，空气放大器的氮气进气压力有所改变，其余实验压力均设定在40 psi，相当于4.0 L/min的进气流量。出口处的气体流速估计为40 L/min，比商业ESI使用的雾帘气或鞘气的气流量大。优化ESI源、空气放大器和加热毛细管的相对位置，以获得最大的离子化效率。所有实验样品流速均设为3 μL/min。
2.2 样品试剂
细胞色素C和肌红蛋白（Sigma公司），直接用于实验；固体蛋白质样品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 备用；实验过程中加入HCl或NH4OH调节溶液的pH值。
3 结果与讨论
3.1 溶液pH值、ESI脱溶剂过程及质谱图CSD分布关系
细胞色素C是一种被广泛研究的蛋白质[2，3，18]，文献报道，运用传统ESI源，当溶液pH值在2～3时，质谱图上呈现典型的双模双峰电荷分布。图2展示了ESI源改进前后细胞色素C在溶液pH值为1.5，2.4和4.6时的ESI质谱图。当空气放大器关闭时，与文献[2，3]报道结果一致： pH值=1.5时，细胞色素C的质谱图呈现较宽且高价态单模电荷分布，表明蛋白质是完全展开的构象；pH值=4.6时，质谱图呈现低价态较窄的单模电荷分布，表明细胞色素C为紧密折叠的构象；pH=2.4时，呈现双模双峰电荷分布，表明细胞色素C此时处于从紧密折叠到完全展开的过渡状态[2]。空气放大器打开时，不同pH值溶液的细胞色素C质谱图电荷价态向更低价态移动；同时，双模双峰电荷分布消失（pH=2.4），呈现出低电荷数的单模分布。实验表明，在低pH值条件下，使用高流速大流量气流可以保持细胞色素C紧密折叠的生物构象。
3.2 采用高流速大流量气流的ESI脱溶剂过程可保持蛋白质构象的机理研究
由图2Aa可见，高流速大流量气流降低了细胞色素C单模电荷分布5个单位（最高电荷从+16降至+11），而图2Cc的溶液中并未观察到明显的电荷降低。这种明显的电荷降低不可能仅是由于气体碰撞时电荷转移作用[19]引起的，因为电荷转移作用与样品的pH值无关，且程度相似。
为了更好地描述高流速大流量气流带来的电荷分布变化，使用公式（1）计算平均电荷数 ：
