气相色谱法检测混合型饲料添加剂中的大蒜素和香芹酚
林茂发 黄永辉 胡朝阳 黄何何 高希
摘要：建立了对混合型饲料添加剂中大蒜素和香芹酚含量进行检测的气相色谱方法。样品采用乙醇提取，经毛细管相色谱柱（HP-5，30m×0.32mm×0.25um）分离，氢火焰离子化检测器测定，外标法定量，并采用气质确证。方法学研究结果表明，目标化合物二烯丙基二硫醚，二烯丙基三硫醚，香芹酚在0.01～10mg/mL浓度范围内具有良好线性关系，相关系数为r≥0.9990，检出限分别为10mg/kg、15mg/kg、10mg/kg；回收率为79.8～96.2%，相对标准偏差为2.61～4.73%。该方法前处理简单，准确可靠，可以用于混合型饲料添加剂样品中大蒜素和香芹酚的测定。
关键词：饲料添加剂；大蒜素；二烯丙基二硫醚；二烯丙基三硫醚；香芹酚；气相色谱法；气质确证
我国是肉类产品的消费大国。人们消费的肉类产品主要是通过工厂化集约养殖的方式提供，工厂化养殖大多数采用配合饲料进行饲养，优质的配合饲料是养殖成功的基础，饲料质量安全直接影响到肉类的质量安全，因此在提倡无公害养殖的同时饲料企业也在努力生产出安全、高效、环保的配合饲料，饲料添加剂作为配合饲料的重要组成是饲料企业投入大量科研开发的项目之一，好的饲料添加剂可以提高饲料的利用率，减少动物的发病几率，促进其生长，实现养殖业的可持续发展。
饲料添加剂产业多年的发展，尤其是中医中药技术在饲料添加剂中的应用，大量以中草药或者植物提取物为主要成分的绿色、高效的功能型饲料添加剂被开发出来并投入饲料加工及养殖中，并且饲料添加剂的类型也由单一的成分朝多种有效成分混合型的饲料添加剂发展，相对于种类繁多的饲料添加剂产品。质量监管部门提供的检测方法显得有些不足，这给饲料添加剂质量监管带来许多不便，因此有必要对各种新型饲料添加剂的检测方法进行开发和研究。
本研究的对象为大蒜素和香芹酚混合型饲料添加剂，大蒜素是大蒜的主要提取物。其主要成分为二烯丙基二硫醚（dialM disulfide，DADS）和二烯丙基三硫醚（diallvl trisulfide，DATS），大蒜素用于饲料中具有消炎杀菌、改善饲料适口性、提高饲料效率的作用，是农业部批准使用的饲料添加剂之一。目前大蒜素的主要检测方法有：重量法、容量法、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱一质谱法。香芹酚Carvacrol（2-甲基-5-异丙基苯酚）是我国农业部批准使用的饲料药物添加剂牛至油的主要成分，其中香芹酚已证明有很强的抗菌活性，能增强动物体对营养物质的消化吸收能力，提高生长性能和饲料利用率，目前香芹酚的检测方法主要有气相色谱法和液相色谱法，但对同时检测大蒜素和香芹酚的方法尚未见报导，本实验开发出采用气相色谱法（GC-FID）同时检测饲料添加剂中的大蒜素和香芹酚，并对目标化合物采用气相色谱串联质谱法确证，实验证明该方法准确快捷。可以用于该中饲料添加剂的检测。
1实验部分
1.1仪器与设备
气相色谱仪带自动进样系统联FID检测器及配套工作站（日本SHIMADZU公司），石英毛细管柱（HP-5，30m×0.32mm×0.25um）美国Agilent公司，6890N/5973N气相色谱一质谱联用仪，美国Agi，lent公司：HP-5MS石英毛细柱（30m×0.25mm×0.25μm）美国Agilent公司，BT224S分析天平，德国Sartorius公司；XH-B旋涡混均器，江苏康健医疗用品有限公司；探针式超声波处理器（功率：450 W，昆山超声仪器有限公司）
1.2材料与试剂
甲醇、乙醇、丙酮、正己烷均为分析纯，香芹酚标准品纯度大于99.0%（德国Dr.Ehrenstorfer公司），二烯丙基二硫醚标准品纯度大于98%（德国Dr.Ehrenstorfer公司），二烯丙基三硫醚标准品纯度大于98%（德国Dr.Ehrenstorfer公司）。称取一定量的标准品。用无水乙醇溶解转移到容量瓶中，并逐级稀释成实验所需的浓度。再配制成相应浓度的混标。
1.3力怯
1.3.1色谱条件：进样口温度：250℃：色谱柱升温程序：60℃保留2min，10℃/min升至200℃，保留5min。检测器（FID）温度280℃，载气，氮气（纯度不小于99.999%）：燃气，氢气（纯度不小于99.99%）；空气（压缩空气）；气体流量：柱流量，1.85mL/min；氢气40mL/min；空气400mL/min：尾吹气，30mL/min；进样量：1μL；分流比：20：1。
1.3.2样品前处理
准确称取样品1克（精确至0.0001g），置于50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解，超声10min后定容，摇匀。
1.3.3测定
在上述选定的色谱条件下，待仪器稳定后，进行标准溶液和试样溶液气相色谱分析。
2结果与分析
2.1色谱方法条件的选择
分别取空白基质样品，标准品和混合饲料添加剂样品按上述前处理方法制備的溶液，按所述色谱条件测定。结果空白基质样品在目标化合物保留时间处无杂质峰干扰，见图1，图2和图3，表明样品中其他成分不干扰目标化合物测定，并且能够在最短的时间实现目标化合物完全分离，方法特异性强，适用于混合型饲料添加剂大蒜素和香芹酚含量测定。
2.2方法的线性范围及检测限
将香芹酚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚标准系列溶液（0.01mg/ml～10.00mg/ml）在上述的气相色谱条件下进样分析，以标准溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，拟合标准曲线，得到相应的线性回归方程及相关系数，根据3倍噪比计算方法的检测限。结果见表1
2.3方法的回收率和精密度
向空白基质样品中分别添加I（5g/kg）、Ⅱ（10g/kg）、Ⅲ（50g/kg）三个浓度水平的混合标样，每个水平进行6次平行测定，回收率和精密度结果见表2。
2.4溶液稳定性试验
按上述的前处理方法制备样品溶液，按前述方法测定三种目标化合物含量，样品溶液密封保存在室温环境中，隔2h、4h、8h、24h、48h测定含量，结果见表3，结果表明样品溶液在48h内稳定。
2.5色谱柱选择
影响色谱柱组分分离效果的一个重要因素是固定相类型，目标化合物的化学结构和极性是本文主要考虑的因素，以大蒜素和香芹酚为主要原料的混合型饲料添加剂是以大蒜素中的二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚和吐温80、聚二醇400等助溶剂经过加工混合而成的。因此选择色谱柱除了要考虑二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚的分子结构外。还考虑减少基质的干扰等因素。本实验采用了3种不同极性的色谱柱，HP-5、HP-50及HP-88毛细管色谱柱，综合考虑灵敏度，峰形，分析时间，基线漂移等色谱分析因素。HP-5毛细管色谱柱效果最好，因此以HP-5毛细管色谱柱作为本试验用色谱柱。
2.6柱温和柱流量的优化选择
在确定优选色谱柱后，气相色谱法中能够影响目标化合物分离效果的因素主要为色谱柱的升温程序和色谱柱的气体流量。由于二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚之间的沸点差异较大，同时考虑溶剂聚焦等因素。本研究反复实验比较了不同的初始温度、升温速率、柱流量后，确定仪器参数为：进样口温度：250℃；色谱柱升温程序：60℃保留2min，10℃/min升至200℃。保留5min。气体流量：柱流量，1.85mL/min；氢气40mL/min：空气400mL/min；尾吹氣，30mL/min；
2.7提取溶剂的选择
本研究实验采用了甲醇、乙醇、丙酮作为样品的提取溶剂，实验表明这3种溶剂均能很好地提取目标化合物，由于乙醇较其他溶剂毒性小，价格便宜。易于购买，所以本研究实验选择无水乙醇作为提取溶剂。
3 GC/M确证
在空白基质中添加浓度为50mg/kg水平的混标，按1.3.2进行前处理
质谱条件：载气为高纯氦气。流速为2.0ml/min；采用分流进样。分流比为20：1：进样口温度为250℃，初始温度为60℃。以10℃/min升至200℃保持5min，离子源为EI源；电子能量为70eV；传输线温度270℃：离子源温度230℃：四级杆温度150℃；溶剂延迟3min。采用Scan扫描模式，m/z质量扫描的范围为50～500m/z。总离子流图和质谱图见图4和图5
4实际样品测定
对企业生产的大蒜素和香芹酚混合型饲料添加剂进行测定，准确称取样品对企业生产的大蒜素和香芹酚混合型饲料添加剂进行测定，准确称取样品1克（精确至0.0001g），样品加入无水乙醇溶解定容50mL，摇匀静置。采用GC-FID测定，色谱谱图见图7，测定结果与产品明示值相符。
5.结论
本研究建立的气相色谱法测定混合型饲料添加剂中二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚的方法，能够实现简单的样品前处理和强特异性的优点，并且具有较宽的线性范围，具有十分显著的线性关系，加标回收率高，重现性好；使用仪器设备普及率高，可在混合型饲料添加剂中大蒜素和香芹酚的质量检测及标准制定中加以推广应用。
摘要：建立了对混合型饲料添加剂中大蒜素和香芹酚含量进行检测的气相色谱方法。样品采用乙醇提取，经毛细管相色谱柱（HP-5，30m×0.32mm×0.25um）分离，氢火焰离子化检测器测定，外标法定量，并采用气质确证。方法学研究结果表明，目标化合物二烯丙基二硫醚，二烯丙基三硫醚，香芹酚在0.01～10mg/mL浓度范围内具有良好线性关系，相关系数为r≥0.9990，检出限分别为10mg/kg、15mg/kg、10mg/kg；回收率为79.8～96.2%，相对标准偏差为2.61～4.73%。该方法前处理简单，准确可靠，可以用于混合型饲料添加剂样品中大蒜素和香芹酚的测定。
关键词：饲料添加剂；大蒜素；二烯丙基二硫醚；二烯丙基三硫醚；香芹酚；气相色谱法；气质确证
我国是肉类产品的消费大国。人们消费的肉类产品主要是通过工厂化集约养殖的方式提供，工厂化养殖大多数采用配合饲料进行饲养，优质的配合饲料是养殖成功的基础，饲料质量安全直接影响到肉类的质量安全，因此在提倡无公害养殖的同时饲料企业也在努力生产出安全、高效、环保的配合饲料，饲料添加剂作为配合饲料的重要组成是饲料企业投入大量科研开发的项目之一，好的饲料添加剂可以提高饲料的利用率，减少动物的发病几率，促进其生长，实现养殖业的可持续发展。
饲料添加剂产业多年的发展，尤其是中医中药技术在饲料添加剂中的应用，大量以中草药或者植物提取物为主要成分的绿色、高效的功能型饲料添加剂被开发出来并投入饲料加工及养殖中，并且饲料添加剂的类型也由单一的成分朝多种有效成分混合型的饲料添加剂发展，相对于种类繁多的饲料添加剂产品。质量监管部门提供的检测方法显得有些不足，这给饲料添加剂质量监管带来许多不便，因此有必要对各种新型饲料添加剂的检测方法进行开发和研究。
本研究的对象为大蒜素和香芹酚混合型饲料添加剂，大蒜素是大蒜的主要提取物。其主要成分为二烯丙基二硫醚（dialM disulfide，DADS）和二烯丙基三硫醚（diallvl trisulfide，DATS），大蒜素用于饲料中具有消炎杀菌、改善饲料适口性、提高饲料效率的作用，是农业部批准使用的饲料添加剂之一。目前大蒜素的主要检测方法有：重量法、容量法、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱一质谱法。香芹酚Carvacrol（2-甲基-5-异丙基苯酚）是我国农业部批准使用的饲料药物添加剂牛至油的主要成分，其中香芹酚已证明有很强的抗菌活性，能增强动物体对营养物质的消化吸收能力，提高生长性能和饲料利用率，目前香芹酚的检测方法主要有气相色谱法和液相色谱法，但对同时检测大蒜素和香芹酚的方法尚未见报导，本实验开发出采用气相色谱法（GC-FID）同时检测饲料添加剂中的大蒜素和香芹酚，并对目标化合物采用气相色谱串联质谱法确证，实验证明该方法准确快捷。可以用于该中饲料添加剂的检测。
1实验部分
1.1仪器与设备
气相色谱仪带自动进样系统联FID检测器及配套工作站（日本SHIMADZU公司），石英毛细管柱（HP-5，30m×0.32mm×0.25um）美国Agilent公司，6890N/5973N气相色谱一质谱联用仪，美国Agi，lent公司：HP-5MS石英毛细柱（30m×0.25mm×0.25μm）美国Agilent公司，BT224S分析天平，德国Sartorius公司；XH-B旋涡混均器，江苏康健医疗用品有限公司；探针式超声波处理器（功率：450 W，昆山超声仪器有限公司）
1.2材料与试剂
甲醇、乙醇、丙酮、正己烷均为分析纯，香芹酚标准品纯度大于99.0%（德国Dr.Ehrenstorfer公司），二烯丙基二硫醚标准品纯度大于98%（德国Dr.Ehrenstorfer公司），二烯丙基三硫醚标准品纯度大于98%（德国Dr.Ehrenstorfer公司）。称取一定量的标准品。用无水乙醇溶解转移到容量瓶中，并逐级稀释成实验所需的浓度。再配制成相应浓度的混标。
1.3力怯
1.3.1色谱条件：进样口温度：250℃：色谱柱升温程序：60℃保留2min，10℃/min升至200℃，保留5min。检测器（FID）温度280℃，载气，氮气（纯度不小于99.999%）：燃气，氢气（纯度不小于99.99%）；空气（压缩空气）；气体流量：柱流量，1.85mL/min；氢气40mL/min；空气400mL/min：尾吹气，30mL/min；进样量：1μL；分流比：20：1。
1.3.2样品前处理
准确称取样品1克（精确至0.0001g），置于50mL容量瓶中，用无水乙醇溶解，超声10min后定容，摇匀。
1.3.3测定
在上述选定的色谱条件下，待仪器稳定后，进行标准溶液和试样溶液气相色谱分析。
2结果与分析
2.1色谱方法条件的选择
分别取空白基质样品，标准品和混合饲料添加剂样品按上述前处理方法制備的溶液，按所述色谱条件测定。结果空白基质样品在目标化合物保留时间处无杂质峰干扰，见图1，图2和图3，表明样品中其他成分不干扰目标化合物测定，并且能够在最短的时间实现目标化合物完全分离，方法特异性强，适用于混合型饲料添加剂大蒜素和香芹酚含量测定。
2.2方法的线性范围及检测限
将香芹酚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚标准系列溶液（0.01mg/ml～10.00mg/ml）在上述的气相色谱条件下进样分析，以标准溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，拟合标准曲线，得到相应的线性回归方程及相关系数，根据3倍噪比计算方法的检测限。结果见表1
2.3方法的回收率和精密度
向空白基质样品中分别添加I（5g/kg）、Ⅱ（10g/kg）、Ⅲ（50g/kg）三个浓度水平的混合标样，每个水平进行6次平行测定，回收率和精密度结果见表2。
2.4溶液稳定性试验
按上述的前处理方法制备样品溶液，按前述方法测定三种目标化合物含量，样品溶液密封保存在室温环境中，隔2h、4h、8h、24h、48h测定含量，结果见表3，结果表明样品溶液在48h内稳定。
2.5色谱柱选择
影响色谱柱组分分离效果的一个重要因素是固定相类型，目标化合物的化学结构和极性是本文主要考虑的因素，以大蒜素和香芹酚为主要原料的混合型饲料添加剂是以大蒜素中的二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚和吐温80、聚二醇400等助溶剂经过加工混合而成的。因此选择色谱柱除了要考虑二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚的分子结构外。还考虑减少基质的干扰等因素。本实验采用了3种不同极性的色谱柱，HP-5、HP-50及HP-88毛细管色谱柱，综合考虑灵敏度，峰形，分析时间，基线漂移等色谱分析因素。HP-5毛细管色谱柱效果最好，因此以HP-5毛细管色谱柱作为本试验用色谱柱。
2.6柱温和柱流量的优化选择
在确定优选色谱柱后，气相色谱法中能够影响目标化合物分离效果的因素主要为色谱柱的升温程序和色谱柱的气体流量。由于二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚之间的沸点差异较大，同时考虑溶剂聚焦等因素。本研究反复实验比较了不同的初始温度、升温速率、柱流量后，确定仪器参数为：进样口温度：250℃；色谱柱升温程序：60℃保留2min，10℃/min升至200℃。保留5min。气体流量：柱流量，1.85mL/min；氢气40mL/min：空气400mL/min；尾吹氣，30mL/min；
2.7提取溶剂的选择
本研究实验采用了甲醇、乙醇、丙酮作为样品的提取溶剂，实验表明这3种溶剂均能很好地提取目标化合物，由于乙醇较其他溶剂毒性小，价格便宜。易于购买，所以本研究实验选择无水乙醇作为提取溶剂。
3 GC/M确证
在空白基质中添加浓度为50mg/kg水平的混标，按1.3.2进行前处理
质谱条件：载气为高纯氦气。流速为2.0ml/min；采用分流进样。分流比为20：1：进样口温度为250℃，初始温度为60℃。以10℃/min升至200℃保持5min，离子源为EI源；电子能量为70eV；传输线温度270℃：离子源温度230℃：四级杆温度150℃；溶剂延迟3min。采用Scan扫描模式，m/z质量扫描的范围为50～500m/z。总离子流图和质谱图见图4和图5
4实际样品测定
对企业生产的大蒜素和香芹酚混合型饲料添加剂进行测定，准确称取样品对企业生产的大蒜素和香芹酚混合型饲料添加剂进行测定，准确称取样品1克（精确至0.0001g），样品加入无水乙醇溶解定容50mL，摇匀静置。采用GC-FID测定，色谱谱图见图7，测定结果与产品明示值相符。
5.结论
本研究建立的气相色谱法测定混合型饲料添加剂中二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚的方法，能够实现简单的样品前处理和强特异性的优点，并且具有较宽的线性范围，具有十分显著的线性关系，加标回收率高，重现性好；使用仪器设备普及率高，可在混合型饲料添加剂中大蒜素和香芹酚的质量检测及标准制定中加以推广应用。
