水产品等食品中磺胺类抗生素残留分析与预处理方法的研究进展
韩欢+徐婧+孔亮+李伟*+董美玲+刘琪+王春龙
DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.06.018
摘 要：对水产品等食品中磺胺类抗生素常用的分析方法和预处理方法进行了综述，归纳和比较了毛细管电泳法、微生物方法、液相色谱-质谱法、免疫法、气相色谱法、分光光度法、高效液相色谱法等特点。其中高效液相色谱法由于操作简便、快速、灵敏、准确的特点，是当前检测磺胺类抗生素的主要方法。同时，对包括固相萃取、分子印迹等预处理方法进行了综述。
关键词：磺胺类抗生素；抗生素残留分析；高效液相色谱法；分子印迹。
早在人类出现之前，细菌已经在不同的生态位发挥着重要的作用。在细菌中有相当小的比例是致病菌，它们能够给人类和动物的健康带来灾难性的影响。在治疗细菌感染的历史过程中，人类就发现了细菌和植物种类中有益的抗菌性，并开始利用具有抗菌活性的化合物来抑制细菌感染，而这些化合物大多是来自自然界。1929年，弗莱明在实验中偶然发现了青霉素，并且在牛津大学病理学教授弗洛里的进一步系统研究之后，抗生素的发展得到了大力推动[1]。青霉素在首次临床试验中，疗效效果十分惊人，从此抗生素进行大规模生产及商品化使用，并且在畜牧、水产品养殖等行业大面积使用。但随着抗生素商品化及平民化使用，过度及搭配不当地使用抗生素反而会危及人及动物的生命安全，同时也会造成环境污染。如：产生毒副作用[2]、致病菌产生耐药性[3]、继发性感染[4]、动物源性耐药菌对人类的危害[5]、影响环境微生物[6]、食品安全[7]。
1 磺胺类药物残留的检测分析方法
磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是比较常见的合成抗菌剂，普遍用于渔业养殖生产，主要有：磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SM1）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SM2）、磺胺甲基异恶唑（Sulfamethoxazole，SMZ）等。它们主要用于治疗鱼类的赤皮病、肠炎、链球菌病、弧菌病、细菌性竖鳞病、赤鳍病、烂鳃病、鞭毛虫病、弧菌病、肠炎等等[8-9]。SAs的广泛应用，使鱼病的感染和传染方面得到了有效的控制。但是人们在享受着抗生素带给人们方便的同时，许多新的问题也伴随而来。像毒性反应、二重感染以及细菌产生耐药性等，尤其是在滥用的情况下能够产生排尿和造血紊乱等副作用[10]。因此大多数国家包括我国农业部、日本、欧盟、欧美和国际食品法典委员会（CAC）等都陆续规定了食品以及饲料中SAs的最大残留限量标准[11-12]。其中日本规定SM1为0.02 mg/kg，磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）为0.04 mg/kg，SM2为0.01 mg/kg，其它按一律标准为0.01 mg/kg[13]。联合国食品法典委员会（CAC）、欧盟和欧美等国家规定水产品中磺胺类药物残留量不得超过0.1 mg/kg[14]。 我国农业行业标准《NY 5070—无公害食品水产品中渔 药残留限量》中规定，SAs在水产品组织中的最高残留总量限量为100 μg/kg。另外我国检测SAs标准还有SN0221-92，SN0208-93，GB/T20759-2006等。
目前，SAs残留的检测方法很多，主要有微生物方法、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、免疫法、气相色谱法（GC）、分光光度法等。其中高效液相色谱法简便、快速、灵敏、准确的特点是当前检测SAs的主要方法。表1为近年来常用的抗生素分析方法。
1.1 微生物方法
微生物方法是应用较为广泛的一种检测方法，尤其是在牛乳中抗生素残留的检测。微生物检测方法分为纸片法、亮黑还原法、TTC法、CHARM抑制法等[15]。该方法具有可直观、仪器设备成本和检测成本较低，但该方法的灵敏度和特异性与其它方法对比相对较低。其中酶标抗体检测法是目前一种趋向灵敏、准确、快速的新型微生物检测方法[16]。
1.2 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）
高效液相色谱法（HPLC）是色谱法中一个重要的分支，也是目前应用最广泛的检测抗生素的方法。HPLC因载液流速快，固定相和流动相可以自主选择，所以具有分析速度快、分离效率高的特点，可以检测近70%的化合物。抗生素残留在色谱分析时最常用的检测方式有紫外-可见检测器（UV-Vis）电化学检测器（ECD）、荧光检测器（FLD）和二极管阵列全波长检测器（DAD）等。如刘勇[17]、ayas-Blanco[18]、Kunihiro Kishida[19]、方炳虎[20]等分别应用反相高效液相色谱法检测分析牛奶中SAs的残留，并采用乙腈提取SAs残留，获得了良好的分析效果。刘振伟等[21]以乙腈进行提取，HLB小柱净化，采用紫外-可见检测器在270 nm处进行检测，检测低限能够达到5 μg/kg，线性在25～300 μg/kg范围内良好。该类方法具有准确度高、精密度好、检测限低的特点。
1.3 毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，CE）
毛细管电泳法也是一种液相分离的技术，再用紫外-可见检测器扫描成电泳谱图，相对于高效液相色谱来说，CE的柱效更高，对于离子型化合物具有很好的分离效果，并提高了样品检测的分辨率。目前由于毛细管电泳和高灵敏度检测器的联用，灵敏度有了极大的提高[22-25]。如Ackermans等建立了毛细管带电泳法检测磺胺噻唑（Sulfathiazole，ST）、磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，SMO）等15种SAs的残留分析方法[26]。但CE最大的不足是进样量过低，造成分析误差升高，并且进样的待测物受到限制，很难应用于痕量分析。
1.4 液相色谱-质谱法(HPLC-MS)
液相色谱-质谱法是液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统的一种结合方法。液质联用技术是色谱和质谱优势的互补，提高了对复杂样品的分离分析能力。HPLC-MS有如下几个特点：（1）分析范围广泛，可以检测绝大多数的化合物；（2）分离能力强，通过MS，能够按照特征离子质量可以将色谱中没有彻底分开的混合物进一步进行分离，并可以定性、定量分析；（3）检测限低；（4）分析时间快；（5）自动化程度高。如Casetta等建立了HPLC-MS/MS法测定了蜂蜜中SAs的方法[27]。
1.5 免疫学方法
免疫分析方法包括放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、固相免疫传感器、免疫亲和色谱（Immunoaffinity Chromatography，ICA）等。免疫学方法具有操作简便、分析成本低、灵敏度极高等优点。其中酶联免疫分析法更是由于特异性强、操作简便的特点使其成为最为常用的方法之一[28-30]。但由于免疫测定法大多数是以生物物质作为分子检测识别原件，这些物质不易长期保存，并且操作稳定性差，容易出现假阳性，因此不适合作为确证试验。
1.6 气相色谱法（Gas Chromatography，GC）
气相色谱在早期SAs分析中应用较多。GC可以使用的检测器通常有火焰电离检测器（FID）、电子捕获检测器（ECD）、热导检测器（TCD）等。其中FID、TCD检测的范围广泛，其它的检测器因检测化合物的范围较窄而鲜有应用。GC具有分析速度快、效率高、操作简单、选择性较好、低检测限等优点。由于GC/ECD可以作为GC/MS的补充可以测定动物性食品等样品[31]，所以分析SAs时气相色谱法主要为GC/ECD。但同时GC只能适用于低沸点、易挥发但不分解的物质进行定性和定量分析，因此在很多实际分析检测中，GC受到了一定的限制，需要对样品预处理、色谱条件、流动相的选择进行改善等优化。
1.7 分光光度法
分光光度法有紫外可见分光光度计、原子荧光分光光度计和原子吸收分光光度计，同样它们在食品领域中已经得到了广泛的应用[32-33]。虽然常规的光谱学仪器应用广泛、操作简便等优点，但受到线性范围、准确度及精密性等性能参数的制约，从而影响到解决食品中实际样品检测问题。Gala B等建立了停止与流动技术与T型荧光分光法结合的方法同时测定出牛奶中氨苄青霉素和四环素[34]。
表1 常用的抗生素分析方法
分析方法 优缺点
微生物方法 检测成本低；灵敏度、特异性较低，容易出现假阳性
高效液相
色谱法（HPLC） 分离速度快、效率高、应用广泛
毛细管电泳法（CE） 适用于离子型化合物，提高了样品的检测灵敏度
液相-质谱
联用法（LC-MS） 选择性高、灵敏度高，提高了对复杂样品的分离能力，分析时间快
免疫分析方法 灵敏度高、特异性强、操作简便；假阳性较高，不适合作确证试验
气相色谱法（GC） 分析速度快、选择性较好、检测限低
分光光度法 操作简便，应用范围广发；准确度和精密度不高
2 针对抗生素分析的样品预处理方法
由于食品中富含脂肪、蛋白质、糖、维生素及氨基酸等基质，而且食品中存在大量的干扰物质，待测物含量非常低，规定的浓度量级基本为mg/kg、μg/kg、ng/kg，甚至更低。因此在检测食品样品中需要大量而且细致的分离纯化和富集过程。样品预处理是其中必不可少的步骤，也是最关键的步骤。由于样品预处理可以减少杂质对目标物的干扰程度，以及可以对试样中的痕量组分进行预富集，所以是整个检测分析过程中误差的主要来源和分析时间快慢的决定步骤[35]。预富集能力越强、富集成分越单一，检测灵敏度就越高。而且无论是HPLC还是GC等的检测方法通常是需要对样品中的抗生素残留进行预处理，如分离、纯化等步骤。因此，发展新型快速的样品预处理方法对于建立食品中抗生素的检测方法也是非常重要的。目前磺胺类抗生素检测分析样品预处理方法主要有液-液萃取法、固相萃取法、微波辅助萃取法、超临界流体萃取、分子印记法等。表2为近年来常用的抗生素分析的样品预处理方法。
2.1 液-液萃取
液-液萃取是SAs残留分析中的一种常用的经典提取方法，是早期样品净化方法中最常用的方法，一般应用于样品中被测物质与基质的分离。其原理是根据组分在溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目标化合物的目的。张伟红等先将水产品酸化处理，再用乙腈做萃取溶剂，经正己烷脱脂后，蒸发浓缩，最后用HPLC-MS/MS内标法测定了水产品中18种SAs残留量[36]。液-液萃取方法虽然操作简便，但是存在处理过程引起的误差较大、可控性较差等不足，除杂效果有限。
2.2 固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）
固相萃取主要应用于样品的分离、浓缩和纯化。固相萃取方法具有如下优点：(1) 富集倍数高，由于使用的是固相萃取柱富集样品，所以富集倍数可以高达数十倍，甚至是数百倍；(2) 分离杂质效率高，固相萃取可以有针对性地选择SPE吸附剂，从而有效地分离干扰组分；(3) 有机溶剂消耗量低，仅需少量的洗脱剂就能把待测分析组分洗脱下来；(4)易于收集、操作快捷方便等优点，因此目前广泛应用于食品化学成分、农兽药残留、环境污染物等方面的检测。
SPE可以根据抗生素化学性质采用不同类型的SPE柱进行固相萃取。其中，用于分析动物源性食品中SAs的SPE柱主要分以下几种：(1) C18 SPE柱；包艳萍等采用C18 SPE柱净化蔬菜中SAs，净化效果良好，回收率为50.80%～9890%[37]。(2) 碱性氧化铝SPE柱；王钦晖等、李俊锁等分别在测定蜂蜜、鸡肝组织中SAs残留量时，采用碱性氧化铝SPE-Pak柱净化样品，样品用乙腈淋洗后售价并分析，结果表明干扰被测样品中的杂质能够被去除，该方法操作简单[31,38]。 (3) Oasis HLB SPE柱；李存等将样品加入到Oasis HLB SPE柱中进行分离预处理，结果表明，该预处理方法去除杂质效果较好，定量曲线线性良好[39]。(4) Oasis MCX SPE柱；熊芳等采用Oasis MCX SPE柱对动物肝脏中的4种SAs进行萃取[40]。该方法操作简便，净化效果好，能够满足分析的需要。(5) 硅胶SPE柱；董丹等采用硅胶SPE柱对鸡肉中的17种SAs进行净化，方法回收率为52.30%～124.90%，提高了样品中被测物质的检测灵敏度[41]。(6) DVB型全自动固相萃取小柱；何桂花等运用全自动固相萃取小柱富集净化动物脏器组织中的SAs。使用二氯甲烷提取，正己烷除脂。萃取柱经甲醇和5%的乙酸溶液处理活化，然后上样，采用5%的乙酸-甲醇(1:1, v/v)进行洗脱收集后进行分析，结果表明处理效果较好[42]。由于SPE具有效率高、重复性好、处理速度快等特点，目前已经成为抗生素残留分析预处理方法的一个发展方向。
2.3 微波辅助萃取（Microwave Aided Extraction，MAE）
MAE具有回收率高、萃取时间较短等优点，其具体表现为：不仅可以加快样品中基质、大分子物质的分离，还可以通过添加极性溶剂吸收微波能来提高溶剂的提取效能；MAE能够在高温和高压下加快分子运动速度，继而提高了微波萃取的速率。曾庆磊建立了微波辅助水蒸气萃取的方法提取动物饲料中磺胺类抗生素，能够快速、高效率地提取饲料中磺胺类抗生素，并减少了样品中其他杂质的提取，达到了较高的回收率[43]。
2.4 超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）
当某一物质高于本身的临界温度和压力后，该物质物理状态处于既不会是液体也不是气体的状态，我们称之为超临界流体（Supercritical Fluid，SF）。SF由于其独特的性质而能够溶解很多物质，SFE正式利用这一超临界流体作为溶剂，因此压力和温度都会对流体的溶解能力产生很大的影响。并且SF的表面张力较小，使其能够快速渗透到样品中，因此其萃取速度要比普通溶剂的萃取速度快很多。由于这些性质使超SFE要比溶液萃取的效果好得多[44]。SFE具有广泛的实用性、萃取效率高，尤其是不产生污染、节省能源等优点，特别适合于热敏性天然产物和生理活性物质的萃取分离[45]。
2.5 免疫亲和色谱法（Immunoaffinity chromatography，IAC）
免疫亲和色谱法是一种操作简便、分离效果理想且精密度高的样品前处理中方法。IAC有可以对复杂基质中痕量组分进行选择性吸附和富集的特点，检测线非常低，而且免疫吸附柱经适当处理后可以重复使用，目前是残留分析中比较有效的净化方法之一，已经被应用于多种药物残留的测定。李俊锁等、Sheth H B等分别建立了免疫亲和色谱法测定兽药和蜂蜜中SAs的残留[46-47]。
2.6 分子印迹法（Molecular Imprinting）
表2 抗生素分析中常用的样品预处理方法
预处理方法 优缺点
液-液萃取 操作简便，应用范围广，是早期净化方法中最常见的。
固相萃取 富集倍数高、分离杂质效率高、易于收集、操作简便。
微波辅助萃取 可以与样品直接作用，反应速度快，提高了溶剂活性。
超临界流体萃取 由于超临界流体表面张力小，因此萃取速度比普通溶剂快。
免疫亲和色谱 可以对复杂基质中痕量组分进行选择性吸附和富集，免疫吸附柱可重复使用。
分子印迹整体柱 具有构效预定性、特异识别性、稳定性好、重复性好。
分子印迹技术最早是由Pauling提出以抗原为模板合成抗体的理论为启发[48]，直到1972年由德国Wulff等研究小组才人工合成出对糖类化合物具有较高选择的共价型分子印迹聚合物[49]。到1993年Mosbach等在Nature上发表了非共价型分子印迹聚合物合成及其仿生免疫分析应用的文章后[50]，分子印迹技术得到了迅猛发展。分子印迹技术通常来讲是指通过加入模板分子能够形成对某一特定的分子具有特异性选择的聚合物，并且当模板分子去除后，聚合物中形成与模板分子空间结构相匹配的空穴，从而这个空穴对模板分子具有高度的选择识别性。分子印迹技术具有构效预定性（predetermination）、特异识别性（specific recognition）、广泛实用性（practicability）、稳定性好、使用寿命长等特点[51]。在以磺胺类作为模板分子的整体柱报道中，刘祥军等以SMO作为模板分子，四乙烯基吡啶（4-vinyl pyridine，4-Vpy）为功能单体，采用了原位聚合法在色谱柱中直接制备了SMO分子印迹整体柱，并显示出良好的识别能力。
中国加入世界贸易组织之后，各国政府使用贸易保护政策来维护本国的经济利益，而食品安全问题已经成为影响贸易的关键因素，各国对食品中SAs的残留量制定了严格的控制标准。近年来，由于水产养殖病害多发，不规范用药情况依然存在。另外，由于水产养殖的集约化，饲料药物添加剂和亚治疗量的各类抗生素在生产中广泛应用，以及不合理用药等因素，使水产品药物残留问题日益突出。我国由于出口产品SAs残留超标，造成了外贸受阻，给我国的经济和形象带来了严重影响。因此无论是从产品的本身需求方面，还是为相关法规和标准的执行提供科学技术依据，提高并完善检测包括水产品在内的食品中SAs残留的技术都是至关重要的。
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Sample handling methods and analysis strategies for the determination
of sulfa antibiotic residues in the aquatic products and other foods
HAN Huan, XU Jing, KONG Liang, LI Wei*, DONG Mei
________________________________________
ling, LIU Qi, WANG Chun
________________________________________
long
(Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)
Abstract：This review summarizes recent progress in the development of the common methods used for determination and sample handling strategies for the analysis of sulfa antibiotic residues in the aquatic products and other foods, including capillary electrophoresis (CE), microbial method, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), immunoassay, gas chromatography (GC), ultraviolet visible spectrophotometry (UV-Vis), high performance liquid chromatography (HPLC), etc.Compare with the other methods，HPLC demonstrate some advantages in analysis of antibiotics，such as rapid, sensitive and accurate.And the evaluated sample handling strategies include SPE, molecular imprinting technique, etc.
Key words：sulfa antibiotics, antibiotic residues, high performance liquid chromatography (HPLC), molecular imprinting technique (MIT).
（收稿日期：2014-03-22；修回日期：2014-03-27）
