冰冻对硝化细菌制剂活性的影响
任杰+周洋+孔小蓉+宋志文
DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.05.003
摘 要：在实验室模拟条件下，研究冰冻对淡水型硝化细菌和海水型硝化细菌制剂中氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌活性的影响。结果表明，冰冻对淡水型硝化细菌和海水型硝化细菌制剂活性均有较为明显的抑制作用，且10 d处理组的抑制作用高于5 d处理组，对淡水型硝化细菌制剂活性的抑制作用大于海水型硝化细菌制剂。液体硝化细菌制剂在冬季运输和保存过程中要采取保温措施，以避免由于冰冻导致的菌剂活性降低。
关键词：硝化细菌制剂；冰冻；活性；降解速率
硝化细菌是一类广泛存在于自然界在氮循环中起到重要作用的微生物，包括氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌两类。前者将氨氧化成亚硝酸盐，后者进一步将亚硝酸盐氧化成硝酸盐。由于通过硝化作用过程可将毒性较强的氨和亚硝酸盐转化为相对低毒的硝酸盐，因此硝化细菌菌剂在污水处理、水产养殖和水族观赏等领域的应用十分广泛[1-2]。
近年来，硝化细菌已逐渐成为水产养殖和水族领域的热门话题，它在水产养殖和水族中的重要性开始引起广泛的注意。可以说，迄今为止，在大规模、集约化的水产养殖模式中，如果没有硝化细菌参与其中的净水作用，想获得成功养殖是难以实现的。目前市场上出售的硝化细菌制剂很多，其中相当一部分是液体制剂，在北方冬季运输和储存中存在冰冻现象，由于硝化细菌对温度、pH等诸多环境因子敏感[3-5]，因此冰冻是否会影响其活性，一直是硝化细菌生产者和消费者较为关心的问题。
本课题组前期在硝化细菌菌剂制备及应用方面做了大量工作，在水族和水产养殖领域均取得较好的效果[6-9]。本研究以自行培养的淡水型和海水型硝化细菌制剂为研究对象，在通过实验模拟确定冰冻对硝化细菌制剂中氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌活性的影响，从而为硝化细菌制剂的推广与应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
722型分光光度计、HZS-H水浴振荡器、pHS-3C型精密酸度计等。
1.2 实验材料
1.2.1 菌剂 淡水型和海水型硝化细菌，由本实验室自行培养，为氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌的混合培养物。
1.2.2 实验试剂 无氨蒸馏水、碘化钾、碘化汞、酒石酸钾钠、氯化铵。
1.2.3 人工海水 由海水素（青岛通用海大海水素有限公司）人工配制而成。
1.3 研究方法
将淡水型硝化细菌和海水型硝化细菌制剂分别分成3组，I组在-20 ℃冰箱冷冻保存5 d，II组-20 ℃冰箱冷冻保存10 d，III组为常温条件下保存的对照组。
1.3.1 冰冻对氨氧化细菌活性的影响 用氯化铵配制氨氮含量为50 mg/L的溶液（海水型硝化细菌用人工海水配制），加至250 mL锥形瓶中，每个锥形瓶加入100 mL，分别加入常温保存硝化细菌制剂、冰冻5 d的硝化细菌制剂、冰冻10 d的硝化细菌制剂各5 mL。将锥形瓶置于水浴振荡器中，25 ℃水浴温度下，130 r/min摇瓶培养。每隔12 h测定样品中氨氮含量。每组两个重复。
1.3.2 冰冻对亚硝酸盐氧化细菌活性的影响 用亚硝酸钠配制含量为20 mg/L的溶液（海水型硝化细菌用人工海水配制），加至250 mL锥形瓶中，每个锥形瓶加入100 mL，分别加入常温保存硝化细菌制剂、冰冻5 d的硝化细菌制剂、冰冻10 d的硝化细菌制剂各5 mL。将锥形瓶置于水浴振荡器中，25 ℃水浴温度下，130 r/min摇瓶培养。每隔1 d测定样品中亚硝酸盐含量。每组两个重复。
1.4 分析方法
水中氨氮采用纳氏试剂分光光度法测定；亚硝酸盐氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定[10-11]。
2 结果与讨论
2.1 冰冻对氨氧化细菌活性的影响
冰冻对淡水型硝化细菌中氨氧化细菌活性的影响见图1。从图1中可以看出，冰冻对氨氧化细菌活性有一定程度影响，对照组中氨氮下降速率明显快于实验组，50 mg/L氨氮经84 h即降至检测不出。而冰冻5 d的实验组和冰冻10 d的实验组经144 h处理后氨氮含量还分别为23.3 mg/L和34.6 mg/L。
经计算，对照组氨氮降解速率为1 628 mg NH3-N/gMlvss?d，冰冻5 d组的氨氮降解速率为507 mg NH3-N/gMlvss?d，冰冻10 d组氨氮降解速率为292 mg NH3-N/gMlvss?d，冰冻对淡水型硝化细菌制剂中氨氧化细菌的活性有较为明显的抑制作用。
图1 冰冻对淡水型硝化细菌制剂
中氨氧化细菌活性的影响
冰冻对海水型硝化细菌中氨氧化细菌活性的影响见图2，从图2中可以看出，冰冻对氨氧化细菌活性有一定程度影响，对照组中氨氮下降速率明显快于实验组，50 mg/L氨氮经84 h即降至检测不出。而冰冻5 d的实验组和冰冻10 d的实验组经144 h处理后氨氮含量还分别为22.4 mg/L和25.4 mg/L。
经计算，对照组的氨氮降解速率为2 455 mg NH3-N/gMlvss?d，冰冻5 d组氨氮降解速率为790 mg NH3-N/gMlvss?d，冰冻10 d组氨氮降解速率为704 mg NH3-N/gMlvss?d，冰冻对海水型硝化细菌制剂中氨氧化细菌的活性有较为明显的抑制作用。
图2 冰冻对海水型硝化细菌制剂中
氨氧化细菌活性的影响
2.2 冰冻对亚硝酸盐氧化细菌活性的影响
冰冻对淡水型硝化细菌中亚硝酸盐氧化细菌活性的影响见图3，从图3中可以看出，对照组亚硝酸盐氮下降明显快于实验组，20 mg/L亚硝酸盐经4 d即可降至检测不出。而冰冻5 d的实验组经7 d处理后，亚硝酸盐氮降至1.2 mg/L；冰冻10 d的实验组经7 d处理后亚硝酸盐氮仍为15.0 mg/L。
图3 冰冻对淡水型硝化细菌制剂中
氨氧化细菌活性的影响
经计算，对照组亚硝酸盐氮降解速率为360 mg NO2--N/gMlvss?d，冰冻5 d组亚硝酸盐氮降解速率为193 mg NH3-N/gMlvss?d，冰冻10 d组氨氮降解速率为51 mg NO2--N/gMlvss?d，冰冻对淡水硝化细菌制剂中亚硝酸盐氧化细菌的活性有较为明显的抑制作用。
冰冻对海水型硝化细菌中亚硝酸盐氧化细菌活性的影响见图4，从图中可以看出，对照组亚硝酸盐氮下降明显快于实验组，20 mg/L亚硝酸盐经7 d即可降至0.7 mg/L。而冰冻5 d的实验组经7 d处理后，亚硝酸盐氮降至4.7 mg/L；冰冻10 d的实验组经7 d处理后亚硝酸盐氮仍为7.7 mg/L。
经计算，对照组亚硝酸盐氮降解速率为461 mg NO2--N/gMlvss?d，冰冻5 d组亚硝酸盐氮降解速率为353 mg NH3-N/gMlvss?d，冰冻10 d组亚硝酸盐氮降解速率为283 mg NO2--N/gMlvss?d，冰冻对海水型硝化细菌制剂中亚硝酸盐氧化细菌的活性有较为明显的抑制作用。
图4 冰冻对海水型硝化细菌制剂
亚硝酸盐氧化细菌活性的影响
冰冻对于硝化细菌具有明显的抑制作用，且抑制作用随时间增长而加强，主要是由于低温形成的冰晶对细菌细胞具有伤害作用，细胞内结冰则对细胞膜、细胞器乃至整个细胞产生破坏作用。从实验结果看，冰冻对淡水型硝化细菌的影响要大于海水型硝化细菌，分析原因可能是海水型硝化细菌的实验是在人工海水条件下进行的，较高的离子强度对硝化细菌细胞具有一定的保护作用。3 结论
冰冻对淡水型硝化细菌和海水型硝化细菌制剂活性均有较为明显的抑制作用，且10 d处理组的抑制作用高于5 d处理组。
冰冻对淡水型硝化细菌制剂活性的抑制作用大于海水型硝化细菌制剂。
液体硝化细菌制剂在冬季运输和保存过程中要采取保温措施，以避免由于冰冻导致的菌剂活性降低。
参考文献：
[1] 刘志培,刘双江.硝化作用微生物的分子生物学研究进展[J].应用与环境生物学报,2004（04）:521-525
[2] 朱晓东,张根玉,朱雅珠,等.硝化细菌的生物学特性以及在水产养殖中的应用[J].水产科技情报,2009,36(5):221-224
[3] Mauret M,Paulion E,Peutch-Costes E,et al.Application of experimental research methodology to the study of nitrification in mixed culture[J].Water Sci.Technol.,1996,34(1/2):245-252
[4] 王歆鹏,陈坚,华兆哲,等.硝化菌群在不同条件下的增殖速率和硝化活性[J].应用与环境生物学报,1999,5(1): 64-68
[5] Sudarno U,Winter J,Gallert C.Effect of varying salinity,temperature,ammonia and nitrous acid concentrations on nitrification of saline wastewater in fixed-bed reactors[J].Bioresour.Technol.,2011,102(10):5665-5673
[6] 刘冉,周洋,宋志文,等.硝化细菌对海参养殖系统水质的净化效果[J].河北渔业,2012（2）:15-18
[7] 宋志文,徐敏,温少鹏,等.硝化细菌制剂对淡水水族箱水质的净化效果[J].河北渔业,2007（7）:29-31
[8] 周洋,孔小蓉,宋志文,等.硝化细菌对海水水族箱硝化功能建立过程的影响[J].河北渔业,2009（3）:4-6
[9] 吴伟,宋志文,于弘路,等.氨负荷对水族箱硝化功能建立过程的影响[J].河北渔业,2010（11）:4-7
[10] 中华人民共和国环境保护部.水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法( HJ535-2009).北京:中国环境科学出版社,2009
[11] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法(第四版)[M].北京:中国环境科学出版社,2002
Effects of frost on the activity of nitrifying bacteria preparation
REN Jie1,ZHOU Yang2,KONG Xiao
--------------------------------------------------------------------------------
rong1,SONG Zhi
--------------------------------------------------------------------------------
wen1
(1. Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China; 2.Management Office of Jihongtan Reservoir, the project of
water diversion from the Yellow River into Qingdao in Shandong, Qingdao 266111, China )
Abstract：Simulated conditions in the laboratory to study frost effects on activity of ammonia-oxidizing bacteria and nitrite-oxidizing bacteria in freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.The results showed that frost had obvious inhibitory effect on activity of freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.And the inhibitory effect on frost for ten days was greater than on frost for five days,the inhibitory effect on activity of nitrifying bacteria preparation was greater than on marine nitrifying bacteria preparation.In order to avoid the decrease of bacteria preparation activity because of frost,insulation measures should be taken to liquid nitrifying bacteria preparation during the transport and storage in winter.
Key words：nitrifying bacteria preparation; frost; activity; degradation rate
（收稿日期：2014-01-27）
图4 冰冻对海水型硝化细菌制剂
亚硝酸盐氧化细菌活性的影响
冰冻对于硝化细菌具有明显的抑制作用，且抑制作用随时间增长而加强，主要是由于低温形成的冰晶对细菌细胞具有伤害作用，细胞内结冰则对细胞膜、细胞器乃至整个细胞产生破坏作用。从实验结果看，冰冻对淡水型硝化细菌的影响要大于海水型硝化细菌，分析原因可能是海水型硝化细菌的实验是在人工海水条件下进行的，较高的离子强度对硝化细菌细胞具有一定的保护作用。3 结论
冰冻对淡水型硝化细菌和海水型硝化细菌制剂活性均有较为明显的抑制作用，且10 d处理组的抑制作用高于5 d处理组。
冰冻对淡水型硝化细菌制剂活性的抑制作用大于海水型硝化细菌制剂。
液体硝化细菌制剂在冬季运输和保存过程中要采取保温措施，以避免由于冰冻导致的菌剂活性降低。
参考文献：
[1] 刘志培,刘双江.硝化作用微生物的分子生物学研究进展[J].应用与环境生物学报,2004（04）:521-525
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[8] 周洋,孔小蓉,宋志文,等.硝化细菌对海水水族箱硝化功能建立过程的影响[J].河北渔业,2009（3）:4-6
[9] 吴伟,宋志文,于弘路,等.氨负荷对水族箱硝化功能建立过程的影响[J].河北渔业,2010（11）:4-7
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[11] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法(第四版)[M].北京:中国环境科学出版社,2002
Effects of frost on the activity of nitrifying bacteria preparation
REN Jie1,ZHOU Yang2,KONG Xiao
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rong1,SONG Zhi
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wen1
(1. Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China; 2.Management Office of Jihongtan Reservoir, the project of
water diversion from the Yellow River into Qingdao in Shandong, Qingdao 266111, China )
Abstract：Simulated conditions in the laboratory to study frost effects on activity of ammonia-oxidizing bacteria and nitrite-oxidizing bacteria in freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.The results showed that frost had obvious inhibitory effect on activity of freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.And the inhibitory effect on frost for ten days was greater than on frost for five days,the inhibitory effect on activity of nitrifying bacteria preparation was greater than on marine nitrifying bacteria preparation.In order to avoid the decrease of bacteria preparation activity because of frost,insulation measures should be taken to liquid nitrifying bacteria preparation during the transport and storage in winter.
Key words：nitrifying bacteria preparation; frost; activity; degradation rate
（收稿日期：2014-01-27）
图4 冰冻对海水型硝化细菌制剂
亚硝酸盐氧化细菌活性的影响
冰冻对于硝化细菌具有明显的抑制作用，且抑制作用随时间增长而加强，主要是由于低温形成的冰晶对细菌细胞具有伤害作用，细胞内结冰则对细胞膜、细胞器乃至整个细胞产生破坏作用。从实验结果看，冰冻对淡水型硝化细菌的影响要大于海水型硝化细菌，分析原因可能是海水型硝化细菌的实验是在人工海水条件下进行的，较高的离子强度对硝化细菌细胞具有一定的保护作用。3 结论
冰冻对淡水型硝化细菌和海水型硝化细菌制剂活性均有较为明显的抑制作用，且10 d处理组的抑制作用高于5 d处理组。
冰冻对淡水型硝化细菌制剂活性的抑制作用大于海水型硝化细菌制剂。
液体硝化细菌制剂在冬季运输和保存过程中要采取保温措施，以避免由于冰冻导致的菌剂活性降低。
参考文献：
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[8] 周洋,孔小蓉,宋志文,等.硝化细菌对海水水族箱硝化功能建立过程的影响[J].河北渔业,2009（3）:4-6
[9] 吴伟,宋志文,于弘路,等.氨负荷对水族箱硝化功能建立过程的影响[J].河北渔业,2010（11）:4-7
[10] 中华人民共和国环境保护部.水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法( HJ535-2009).北京:中国环境科学出版社,2009
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Effects of frost on the activity of nitrifying bacteria preparation
REN Jie1,ZHOU Yang2,KONG Xiao
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rong1,SONG Zhi
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(1. Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China; 2.Management Office of Jihongtan Reservoir, the project of
water diversion from the Yellow River into Qingdao in Shandong, Qingdao 266111, China )
Abstract：Simulated conditions in the laboratory to study frost effects on activity of ammonia-oxidizing bacteria and nitrite-oxidizing bacteria in freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.The results showed that frost had obvious inhibitory effect on activity of freshwater and marine nitrifying bacteria preparation.And the inhibitory effect on frost for ten days was greater than on frost for five days,the inhibitory effect on activity of nitrifying bacteria preparation was greater than on marine nitrifying bacteria preparation.In order to avoid the decrease of bacteria preparation activity because of frost,insulation measures should be taken to liquid nitrifying bacteria preparation during the transport and storage in winter.
Key words：nitrifying bacteria preparation; frost; activity; degradation rate
（收稿日期：2014-01-27）
