甲醛溶液对鸡大肠杆菌灭活效果的影响

    于国营等

    摘要：为了优化鸡大肠杆菌疫苗制造过程中的灭活工艺，对甲醛溶液的使用浓度、灭活时间进行了比较，同时选用不同生产厂家的甲醛溶液进行了灭活比较试验。结果表明，对于浓度较高的鸡大肠杆菌菌液，采用37 ℃搅拌灭活，甲醛溶液的终浓度越高，灭活时间越短，灭活效果就越明显；但同时也存在着甲醛溶液的终浓度越高，用灭活彻底的菌液所制备疫苗的副反应就越大。不同生产厂家的甲醛溶液灭活效果无明显差异。

    关键词：甲醛溶液；鸡大肠杆菌；灭活工艺

    中图分类号：S858.31 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）02-0010-03

    甲醛溶液是目前灭活疫苗生产中应用最广泛的灭活剂，成熟的灭活工艺能够保证研制工作的顺利开展和细菌灭活疫苗的生物安全。为了优化鸡大肠杆菌疫苗制造过程中的灭活工艺，对甲醛溶液的使用浓度、灭活时间进行了比较，同时也对不同厂家生产的甲醛溶液进行了灭活比较试验。

    1 材料

    1.1 大肠杆菌菌种

    O1株、O2株、O78株均由青岛易邦生物工程有限公司提供。

    1.2 培养基

    LB液体培养基。

    1.3 菌液

    分别制备O1株、O2株、O78株菌液各2批（201101批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2×1010CFU/mL）。

    1.4 试验鸡

    21～28日龄SPF鸡均购自北京某SPF鸡场。

    1.5 灭活剂

    上海国药集团化学试剂有限公司生产的甲醛，批号为2011304。济南鲁康化学工业有限公司生产的甲醛，批号为110713。

    2 试验设计

    2.1 甲醛溶液灭活浓度和灭活时间的选择

    分别量取201101批O1株、O2株、O78株菌液3份，分别按终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%分别加入上海国药生产的化学纯甲醛溶液，分别置于37 ℃灭活8、12、16、20、24、36 h。各株菌液灭活后，均用LB肉汤培养基2支，各接种0.2ml，37 ℃培养7 d，观察有无细菌生长，以确定菌液灭活是否彻底。

    2.2 疫苗的安全检验

    取“2.1”经0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲醛溶液灭活彻底的201101批O1株、O2株、O78株菌液，按4%加入吐温并混匀后作为水相，再与油相按1：2（V/V）乳化制成疫苗，分别用21～28日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗1 mL，观察14 d有无因注射疫苗引起的不良反应。

    2.3 灭活剂的比较

    在201101批菌液经灭活和安全试验的基础上，使用不同厂家（上海国药、济南鲁康）生产的甲醛溶液，按照“2.1”项选定的灭活条件，分别对201102批O1株、O2株、O78株菌液进行灭活试验，观察不同厂家生产的甲醛溶液的灭活效果有无差异。

    3 结果与分析

    3.1 甲醛溶液灭活浓度和灭活时间的选择

    试验结果（表1）表明，各株菌液在37 ℃条件下，甲醛溶液最终浓度为0.1%搅拌灭活36 h灭活彻底，甲醛溶液最终浓度为0.2%搅拌灭活24 h灭活彻底，甲醛最终浓度为0.3%搅拌灭活16 h均能灭活彻底，甲醛溶液最终浓度为0.4%搅拌灭活12 h灭活彻底。

    3.2 灭活的安全检验

    试验结果（表2）表明，用终浓度为0.1%、0.2%、0.3%甲醛溶液灭活的菌液制备疫苗进行安全检验，试验鸡均未出现注射部位红肿，采食饮水量下降等不良反应；用终浓度为0.4%甲醛溶液灭活的菌液制备疫苗，安检鸡3/10均出现精神一过性不振，2/10饮食略有下降，3/10注射部位发红。

    3.3 灭活剂的比较

    试验结果（表3）表明，上海国药、济南鲁康生产的甲醛溶液按0.3%终浓度分别加入到201102批各株菌液，37 ℃搅拌灭活16 h，均灭活彻底。两厂家生产的同级另甲醛溶液对鸡大肠杆菌的灭活效果无明显差异。

    4 小结与讨论

    本研究用甲醛终浓度为0.1%、0.2%、0.3%灭活的菌液制备疫苗进行安全检验，安检鸡均未出现注射部位红肿，采食饮水量下降等不良反应；用甲醛终浓度为0.4%灭活彻底的菌液制备疫苗，安检鸡3/10精神一过性不振，安检鸡2/10饮食略有下降，3/10注射部位均发红。对于浓度较高的鸡大肠杆菌菌液，甲醛溶液的终浓度越高，灭活时间越短，灭活效果就越明显；但同时也存在着甲醛溶液的终浓度越高，灭活彻底的菌液所制备疫苗的副反应就越大。

    将鸡大肠杆菌菌液，按终浓度0.3%加入甲醛溶液，37 ℃搅拌灭活16 h，灭活彻底，且疫苗安检后未见不良反应。考虑实际生产中影响因素较多，为了保证灭活彻底，同时为减少高浓度甲醛副反应，建议采用甲醛溶液，按0.3%的终浓度在37 ℃条件下搅拌灭活24 h作为实际生产中鸡大肠杆菌（O1株、O2株、O78株）菌液的灭活条件。

    不同厂家生产的甲醛溶液质量基本一致，无明显差异。由于实际生产中，菌液量较大，为防止由于浓度过高引起局部的蛋白凝聚和变性，因此建议将甲醛溶液进行稀释后使用。

    本试验结果是在实验室小量操作等条件下得出的试验结果，在具体研究或生产其他菌株大肠杆菌或其他种类细菌时，其灭活工艺还需要另外进行具体地摸索和验证。尽管如此，依然希望本试验所得出的数据和结论能对相关研究提供一定意义的参考。

    参考文献：

    [1] 白文彬，于康震.动物传染病诊断学[CM3].北京：中国农业出版社，2002.857-862.

    [2] 才学鹏，景志忠，邱昌庆.动物疫苗学[M].北京：中国农业科学技术出版社，2009.317.

    [3] 吴清民.动物传染病学[M].北京：中国农业大学出版社，2002.514-518.

    [4] 冯静兰.中华人民共和国兽用生物制品规程[M].北京：化学工业出版社，2000，75-76.

    摘要：为了优化鸡大肠杆菌疫苗制造过程中的灭活工艺，对甲醛溶液的使用浓度、灭活时间进行了比较，同时选用不同生产厂家的甲醛溶液进行了灭活比较试验。结果表明，对于浓度较高的鸡大肠杆菌菌液，采用37 ℃搅拌灭活，甲醛溶液的终浓度越高，灭活时间越短，灭活效果就越明显；但同时也存在着甲醛溶液的终浓度越高，用灭活彻底的菌液所制备疫苗的副反应就越大。不同生产厂家的甲醛溶液灭活效果无明显差异。

    关键词：甲醛溶液；鸡大肠杆菌；灭活工艺

    中图分类号：S858.31 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）02-0010-03

    甲醛溶液是目前灭活疫苗生产中应用最广泛的灭活剂，成熟的灭活工艺能够保证研制工作的顺利开展和细菌灭活疫苗的生物安全。为了优化鸡大肠杆菌疫苗制造过程中的灭活工艺，对甲醛溶液的使用浓度、灭活时间进行了比较，同时也对不同厂家生产的甲醛溶液进行了灭活比较试验。

    1 材料

    1.1 大肠杆菌菌种

    O1株、O2株、O78株均由青岛易邦生物工程有限公司提供。

    1.2 培养基

    LB液体培养基。

    1.3 菌液

    分别制备O1株、O2株、O78株菌液各2批（201101批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2×1010CFU/mL）。

    1.4 试验鸡

    21～28日龄SPF鸡均购自北京某SPF鸡场。

    1.5 灭活剂

    上海国药集团化学试剂有限公司生产的甲醛，批号为2011304。济南鲁康化学工业有限公司生产的甲醛，批号为110713。

    2 试验设计

    2.1 甲醛溶液灭活浓度和灭活时间的选择

    分别量取201101批O1株、O2株、O78株菌液3份，分别按终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%分别加入上海国药生产的化学纯甲醛溶液，分别置于37 ℃灭活8、12、16、20、24、36 h。各株菌液灭活后，均用LB肉汤培养基2支，各接种0.2ml，37 ℃培养7 d，观察有无细菌生长，以确定菌液灭活是否彻底。

    2.2 疫苗的安全检验

    取“2.1”经0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲醛溶液灭活彻底的201101批O1株、O2株、O78株菌液，按4%加入吐温并混匀后作为水相，再与油相按1：2（V/V）乳化制成疫苗，分别用21～28日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗1 mL，观察14 d有无因注射疫苗引起的不良反应。

    2.3 灭活剂的比较

    在201101批菌液经灭活和安全试验的基础上，使用不同厂家（上海国药、济南鲁康）生产的甲醛溶液，按照“2.1”项选定的灭活条件，分别对201102批O1株、O2株、O78株菌液进行灭活试验，观察不同厂家生产的甲醛溶液的灭活效果有无差异。

    3 结果与分析

    3.1 甲醛溶液灭活浓度和灭活时间的选择

    试验结果（表1）表明，各株菌液在37 ℃条件下，甲醛溶液最终浓度为0.1%搅拌灭活36 h灭活彻底，甲醛溶液最终浓度为0.2%搅拌灭活24 h灭活彻底，甲醛最终浓度为0.3%搅拌灭活16 h均能灭活彻底，甲醛溶液最终浓度为0.4%搅拌灭活12 h灭活彻底。

    3.2 灭活的安全检验

    试验结果（表2）表明，用终浓度为0.1%、0.2%、0.3%甲醛溶液灭活的菌液制备疫苗进行安全检验，试验鸡均未出现注射部位红肿，采食饮水量下降等不良反应；用终浓度为0.4%甲醛溶液灭活的菌液制备疫苗，安检鸡3/10均出现精神一过性不振，2/10饮食略有下降，3/10注射部位发红。

    3.3 灭活剂的比较

    试验结果（表3）表明，上海国药、济南鲁康生产的甲醛溶液按0.3%终浓度分别加入到201102批各株菌液，37 ℃搅拌灭活16 h，均灭活彻底。两厂家生产的同级另甲醛溶液对鸡大肠杆菌的灭活效果无明显差异。

    4 小结与讨论

    本研究用甲醛终浓度为0.1%、0.2%、0.3%灭活的菌液制备疫苗进行安全检验，安检鸡均未出现注射部位红肿，采食饮水量下降等不良反应；用甲醛终浓度为0.4%灭活彻底的菌液制备疫苗，安检鸡3/10精神一过性不振，安检鸡2/10饮食略有下降，3/10注射部位均发红。对于浓度较高的鸡大肠杆菌菌液，甲醛溶液的终浓度越高，灭活时间越短，灭活效果就越明显；但同时也存在着甲醛溶液的终浓度越高，灭活彻底的菌液所制备疫苗的副反应就越大。

    将鸡大肠杆菌菌液，按终浓度0.3%加入甲醛溶液，37 ℃搅拌灭活16 h，灭活彻底，且疫苗安检后未见不良反应。考虑实际生产中影响因素较多，为了保证灭活彻底，同时为减少高浓度甲醛副反应，建议采用甲醛溶液，按0.3%的终浓度在37 ℃条件下搅拌灭活24 h作为实际生产中鸡大肠杆菌（O1株、O2株、O78株）菌液的灭活条件。

    不同厂家生产的甲醛溶液质量基本一致，无明显差异。由于实际生产中，菌液量较大，为防止由于浓度过高引起局部的蛋白凝聚和变性，因此建议将甲醛溶液进行稀释后使用。

    本试验结果是在实验室小量操作等条件下得出的试验结果，在具体研究或生产其他菌株大肠杆菌或其他种类细菌时，其灭活工艺还需要另外进行具体地摸索和验证。尽管如此，依然希望本试验所得出的数据和结论能对相关研究提供一定意义的参考。

    参考文献：

    [1] 白文彬，于康震.动物传染病诊断学[CM3].北京：中国农业出版社，2002.857-862.

    [2] 才学鹏，景志忠，邱昌庆.动物疫苗学[M].北京：中国农业科学技术出版社，2009.317.

    [3] 吴清民.动物传染病学[M].北京：中国农业大学出版社，2002.514-518.

    [4] 冯静兰.中华人民共和国兽用生物制品规程[M].北京：化学工业出版社，2000，75-76.

    摘要：为了优化鸡大肠杆菌疫苗制造过程中的灭活工艺，对甲醛溶液的使用浓度、灭活时间进行了比较，同时选用不同生产厂家的甲醛溶液进行了灭活比较试验。结果表明，对于浓度较高的鸡大肠杆菌菌液，采用37 ℃搅拌灭活，甲醛溶液的终浓度越高，灭活时间越短，灭活效果就越明显；但同时也存在着甲醛溶液的终浓度越高，用灭活彻底的菌液所制备疫苗的副反应就越大。不同生产厂家的甲醛溶液灭活效果无明显差异。

    关键词：甲醛溶液；鸡大肠杆菌；灭活工艺

    中图分类号：S858.31 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）02-0010-03

    甲醛溶液是目前灭活疫苗生产中应用最广泛的灭活剂，成熟的灭活工艺能够保证研制工作的顺利开展和细菌灭活疫苗的生物安全。为了优化鸡大肠杆菌疫苗制造过程中的灭活工艺，对甲醛溶液的使用浓度、灭活时间进行了比较，同时也对不同厂家生产的甲醛溶液进行了灭活比较试验。

    1 材料

    1.1 大肠杆菌菌种

    O1株、O2株、O78株均由青岛易邦生物工程有限公司提供。

    1.2 培养基

    LB液体培养基。

    1.3 菌液

    分别制备O1株、O2株、O78株菌液各2批（201101批和201102批菌液的活菌含量均不低于1.2×1010CFU/mL）。

    1.4 试验鸡

    21～28日龄SPF鸡均购自北京某SPF鸡场。

    1.5 灭活剂

    上海国药集团化学试剂有限公司生产的甲醛，批号为2011304。济南鲁康化学工业有限公司生产的甲醛，批号为110713。

    2 试验设计

    2.1 甲醛溶液灭活浓度和灭活时间的选择

    分别量取201101批O1株、O2株、O78株菌液3份，分别按终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%分别加入上海国药生产的化学纯甲醛溶液，分别置于37 ℃灭活8、12、16、20、24、36 h。各株菌液灭活后，均用LB肉汤培养基2支，各接种0.2ml，37 ℃培养7 d，观察有无细菌生长，以确定菌液灭活是否彻底。

    2.2 疫苗的安全检验

    取“2.1”经0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲醛溶液灭活彻底的201101批O1株、O2株、O78株菌液，按4%加入吐温并混匀后作为水相，再与油相按1：2（V/V）乳化制成疫苗，分别用21～28日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗1 mL，观察14 d有无因注射疫苗引起的不良反应。

    2.3 灭活剂的比较

    在201101批菌液经灭活和安全试验的基础上，使用不同厂家（上海国药、济南鲁康）生产的甲醛溶液，按照“2.1”项选定的灭活条件，分别对201102批O1株、O2株、O78株菌液进行灭活试验，观察不同厂家生产的甲醛溶液的灭活效果有无差异。

    3 结果与分析

    3.1 甲醛溶液灭活浓度和灭活时间的选择

    试验结果（表1）表明，各株菌液在37 ℃条件下，甲醛溶液最终浓度为0.1%搅拌灭活36 h灭活彻底，甲醛溶液最终浓度为0.2%搅拌灭活24 h灭活彻底，甲醛最终浓度为0.3%搅拌灭活16 h均能灭活彻底，甲醛溶液最终浓度为0.4%搅拌灭活12 h灭活彻底。

    3.2 灭活的安全检验

    试验结果（表2）表明，用终浓度为0.1%、0.2%、0.3%甲醛溶液灭活的菌液制备疫苗进行安全检验，试验鸡均未出现注射部位红肿，采食饮水量下降等不良反应；用终浓度为0.4%甲醛溶液灭活的菌液制备疫苗，安检鸡3/10均出现精神一过性不振，2/10饮食略有下降，3/10注射部位发红。

    3.3 灭活剂的比较

    试验结果（表3）表明，上海国药、济南鲁康生产的甲醛溶液按0.3%终浓度分别加入到201102批各株菌液，37 ℃搅拌灭活16 h，均灭活彻底。两厂家生产的同级另甲醛溶液对鸡大肠杆菌的灭活效果无明显差异。

    4 小结与讨论

    本研究用甲醛终浓度为0.1%、0.2%、0.3%灭活的菌液制备疫苗进行安全检验，安检鸡均未出现注射部位红肿，采食饮水量下降等不良反应；用甲醛终浓度为0.4%灭活彻底的菌液制备疫苗，安检鸡3/10精神一过性不振，安检鸡2/10饮食略有下降，3/10注射部位均发红。对于浓度较高的鸡大肠杆菌菌液，甲醛溶液的终浓度越高，灭活时间越短，灭活效果就越明显；但同时也存在着甲醛溶液的终浓度越高，灭活彻底的菌液所制备疫苗的副反应就越大。

    将鸡大肠杆菌菌液，按终浓度0.3%加入甲醛溶液，37 ℃搅拌灭活16 h，灭活彻底，且疫苗安检后未见不良反应。考虑实际生产中影响因素较多，为了保证灭活彻底，同时为减少高浓度甲醛副反应，建议采用甲醛溶液，按0.3%的终浓度在37 ℃条件下搅拌灭活24 h作为实际生产中鸡大肠杆菌（O1株、O2株、O78株）菌液的灭活条件。

    不同厂家生产的甲醛溶液质量基本一致，无明显差异。由于实际生产中，菌液量较大，为防止由于浓度过高引起局部的蛋白凝聚和变性，因此建议将甲醛溶液进行稀释后使用。

    本试验结果是在实验室小量操作等条件下得出的试验结果，在具体研究或生产其他菌株大肠杆菌或其他种类细菌时，其灭活工艺还需要另外进行具体地摸索和验证。尽管如此，依然希望本试验所得出的数据和结论能对相关研究提供一定意义的参考。

    参考文献：

    [1] 白文彬，于康震.动物传染病诊断学[CM3].北京：中国农业出版社，2002.857-862.

    [2] 才学鹏，景志忠，邱昌庆.动物疫苗学[M].北京：中国农业科学技术出版社，2009.317.

    [3] 吴清民.动物传染病学[M].北京：中国农业大学出版社，2002.514-518.

    [4] 冯静兰.中华人民共和国兽用生物制品规程[M].北京：化学工业出版社，2000，75-76.