植物组织培养中污染防控方法研究

    张朕 马艳丽

    摘 要：植物组织培养在植物转基因技术实施、植物繁殖、新品种培育中具有重要意义，但植物组织培养中极易发生植物材料污染，致使科研和生产无法进行，运行成本增加。本文通过近年的大量实验，分析了植物组织培养污染发生原因，并总结了较好的防控污染方法。

    关键词：植物；组织培养；污染防控

    文章编号：1004-7026（2018）01-0066-02 中国图书分类号：Q943.1 文献标志码：A

    植物组织培养是20世纪初以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术，这项技术已在科研和生产中得到广泛应用，经过多年发展研究技术已相对成熟。但是在组培过程中仍易发生污染，致使科研和生产成本增加。项目组成员在多次组织培养实验中，总结出如下组织培养污染防控方法。

    1 组培环境无菌防控

    在进行组织培养之前，首先要建立组培实验室。实验室包括准备室、无菌操作室（接种室）和培养室。植物组织培养是一种要求做到无菌操作和无菌培养的技术，这种技术有两个个主要目的：一是防止实验室的培养物被外来微生物，如皮肤、衣服或周围环境中的微生物污染；二是防止实验工作者被微生物感染。组培环境中造成污染影响的因素主要是室内空气中漂浮的细菌和真菌孢子，因此我们在实验之前都会对接种环境和培养环境进行灭菌处理。包括每次接种前都要用紫外线灭菌灯对接种环境和无菌操作台进行15分钟照射，并用75%酒精擦拭无菌操作台和接种人双手；接种时一旁点燃酒精灯，并使玻璃罩门开到仅够实验人员伸入双手接种程度即可。

    2 外植体消毒

    外植体因生长环境的原因，使其表面会带有细菌，同时外植体的内生细菌也会造成组织培养的污染，为此，适宜采取以下防控措施：

    2.1 外植体表面消毒处理

    将外植体先用洗衣粉或者肥皂水浸泡30分钟，然后用清水清洗。将外植体移至无菌室用75%酒精浸泡10～15s，用无菌水冲洗2～3遍，再用0.1%升汞浸泡10min，倒出后用无菌水冲洗3遍，才可以进行接种。

    2.2 外植体内生细菌的杀菌处理

    2.2.1 多次消毒（灭菌）。先用饱和香皂水对外植体浸泡20～30min，再用0.1%高锰酸钾溶液处理5min，然后用4%次氯酸钠加0.1%升汞消毒，最后用500mg/L先锋霉素或羧苄青霉素的无菌水洗，都取得了理想的消毒效果，可使污染率降低50%[1]。

    2.2.2 使用混合的消毒液消毒。对于乳汁等分泌物较多的外植体用含聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、抗坏血酸、多菌灵、氨苄青霉素或氯霉素的混合液预处理，既可减少酚和乳汁的分泌，也减少了污染。

    3 操作过程中污染防控措施

    3.1 实验器材灭菌

    实验器材包括各种玻璃材质的培养器皿如：培养皿，锥形瓶等，和各种铁质的接种用具如：镊子，剪刀，接种用刀等。

    3.1.1 培养器皿灭菌。培养器皿多为玻璃材质，在使用前清洗干净并放入烘箱中采取干热灭菌法进行灭菌，以备培养基配制和接种实验使用。

    3.1.2 接种用具灭菌。接种用具多为铁质，所以可以采取灼烧法灭菌。接种时接种用刀和镊子等在进行多次使用后，放在酒精灯外焰上进行灼烧，达到灭菌目的，避免因接种用具上沾染细菌造成感染。

    3.2 实验药剂灭菌

    实验药剂配制完成后要进行灭菌处理，多采用高压蒸汽灭菌法对接种所用培养基进行灭菌：将配制好的培养基倒入培养所用经过灭菌处理的培养皿中并封口，放入高压蒸汽灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌。注意灭菌后不宜马上打开高压蒸汽灭菌锅，防止因培养皿内外气压引起培养皿封口膜被气压顶开。

    4 其他污染防控方法

    组培过程中可以在培养基中加入抗生素和抑菌剂来达到抑制细菌生长，控制污染的目的。

    4.1 加入杀菌剂

    组培污染病原菌主要为细菌和霉菌，以及少量酵母菌和放线菌。抗生素往往只对细菌或霉菌有抑 （杀）作用：一般用于防治病害的化学农药等主要抑 （杀）霉菌，有些对细菌也有抑制作用；化学防腐剂往往对细菌和霉菌都有抑（杀）作用。因此，单一杀菌剂防制组培污染一般效果较差，并且容易使病原菌产生抗药性，因此可以考虑加入多种杀菌剂[2]。

    4.2 加入抗生素

    我们选择孔雀竹芋、天鹅绒竹芋、马铃薯、山藥、甘薯做接种的植物材料，抗生素选用硫酸庆大霉素、氯霉素，以及杀菌剂爱力克，其中加入爱力克全部培养基未经过高压蒸汽灭菌，培养基配方共9种（见表1）。15天后观察污染情况。未加入抗生素的孔雀竹芋5个配方平均污染率为35%、天鹅绒竹芋27.5%、马铃薯75%、山药25%、甘薯55%；加入抗生素的孔雀竹芋5个配方平均污染率为4.38%、天鹅绒竹芋5.00%、马铃薯6.25%、山药6.25%、甘薯3.125%。

    4.3 严格控制环境和外植体消毒

    鉴于第一次接种污染率过高，在对接种环境和外植体消毒条件进行严格把控后进行第二次接种实验。接种环境消毒包括接种前使用紫外线灯照射30min，同时打开臭氧发生器并保证接种全程使其处于工作状态。外植体消毒更加严格每次使用酒精和升汞消毒少量外植体，少量多次消毒，保证消毒过的外植体会立刻完成接种。

    通过实验数据可以看出，在相同接种情况下加入抗生素可以极大程度上降低外植体的污染率，其中加入爱力克的培养基甚至未经过高温高压灭菌器污染率依然低于正常培养基。并且严格控制接种环境和外植体消毒同样可以达到降低外植体污染率的目的。

    5 实验结论

    导致植物组织培养污染原因可归结为3个方面：一是组织培养室或接种室的清洁问题；二是外植体自身带菌；三是组织培养过程各环节操作不适宜或不严格。

    但实验中发现外植体交叉污染现象较为普遍，所以控制住外植体交叉污染情况同样可以做到降低污染率的目的。

    某些外植体如马铃薯，甘薯，山药等的表皮不易消毒，在组培中选择正确的外植体和消毒方式也是降低污染率的重要措施。

    待解决问题：实验过程中发现，在同样培养时间和培养条件下，外植体在加入抗生素的培养基中的愈伤组织发生数量明显低于未加入抗生素培养基上愈伤组织的发生数量。

    参考文献：

    [1]周鹏，郑学勤，陈向明.成龄番木瓜的快繁技术[J].热带作物学报，1995，16（2）：66-69.