新疆昌吉地区大肠杆菌致奶牛隐性乳房炎的调查与分析

    贾林军　苏艳

    摘要：为解大肠杆菌在新疆昌吉地区奶牛隐性乳房炎流行中所起的作用，试验对昌吉地区奶牛隐性乳房炎病牛乳样进行了大肠杆菌的分离、鉴定及耐药性研究。结果表明，昌吉地区规模化奶牛场的隐性乳房炎阳性率为40.8%，从671份乳样中分离出大肠杆菌64株，占样本数的9.5%，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌三种细菌总数的32.16%。药敏试验结果表明鉴定出的64株大肠杆菌对氧氟沙星、头孢唑林、克林霉素敏感；对青霉素、庆大霉素、氨苄西林中度敏感；对链霉素、四环素有耐药性。

    关键词：昌吉地区；大肠杆菌；奶牛乳房炎；调查与分析

    中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）01-0005-03

    奶牛乳房炎的发病原因是复杂多样的，主要包括物理因素、化学因素和微生物因素，其严重影响产奶量，因此，奶牛隐性乳房炎的防治是一个急需解决的问题。肠杆菌科中的埃希氏大肠杆菌是导致奶牛乳房炎的重要环境病原菌之一。为了解大肠杆菌在新疆昌吉地区奶牛隐性乳房炎流行中所起的作用，试验对昌吉地区奶牛隐性乳房炎病牛乳样进行了大肠杆菌的分离、鉴定及耐药性研究，旨在为科学防治奶牛乳房炎提供科学依据。

    1 试验材料

    1.1 样品来源

    新鲜乳样671份，来自新疆昌吉地区6个规模化牛场的196头奶牛隐性乳房炎病牛。

    1.2 主要仪器

    恒温培养振荡器、隔水式恒温培养箱、电热恒温培养箱，生物显微镜、超净工作台，法国生物梅里埃公司VITEK-2全自动生化分析仪、立式电热压力蒸汽灭菌锅，试管、培养皿若干，奶牛隐性乳房炎诊断盘。

    1.3 培养基及试剂

    LB液体培养基、LB固体培养基、麦康凯琼脂培养基、革兰氏染液。

    1.4 药敏纸片

    氨苄西林、青霉素、氧氟沙星、阿莫西林、链霉素、四环素、克林霉素、庆大霉素、头孢唑啉均购自杭州微生物试剂有限公司。

    2 试验方法

    2.1 隐性乳房炎的检测与奶样的采集

    选取隐性乳房炎阳性奶牛，记录其耳号，常规无菌操作进行人工挤乳，弃去头三把乳汁，从每个乳头取奶2 mL于5 mL EP管内，做好标记，置于放有冰带的采样箱内，尽快送至实验室，-20 ℃保存备用。

    2.2 细菌的分离培养与纯化

    2.2.1 细菌的培养 将乳样反复冻融4次后，每份取50 μL接种于LB肉汤中，作好标记，置于37 ℃恒温培养箱内，220 r/min振荡培养18～24 h。

    2.2.2 液体培养物的涂片观察 取出后用接种环取一环菌液涂片固定，通过革兰氏染色法进行染色后用油镜观察其形态，包括菌体颜色、大小、形状，有无芽孢形成，有无鞭毛等。

    在麦康凯培养基、LB固体培养基上进行四区划线，倒扣于37 ℃恒温培养箱内培养12～18 h。

    2.3 分离菌的形态学鉴定

    观察麦康凯培养基和LB固体培养基上群落的生长状况，包括大小、形状、颜色、表面光滑程度等。

    菌体形态：从麦康凯上挑取圆形、红色、菌落中部为黑色的菌落进行染色。取洁净的载玻片，滴加一小滴生理盐水，将接种环燃烧后蘸取少量菌体接种到水滴上，涂抹均匀，晾干，染色观察。

    挑取形状规则、菌落偏小、表面光滑、中间为黑色的菌落，接种到LB液体培养基内，培养18 h，再次四区划线，挑取单个菌落，染色观察。如此重复，直至菌体在显微镜下观察时形态完全一致时，将单个菌落接种于LB斜面培养基上，4 ℃保存备用。

    2.4 生理生化特性鉴定

    采用法国生物梅里埃公司VITEK-2分析仪GN鉴定卡进行分析，严格按仪器要求操作。

    2.4.1 比浊管的制备 根据培养特性和镜检结果，上一步所分离的疑似大肠杆菌接种于斜面，培养18 h，用接种环由外到内刮取菌落接种到事先准备好的专用比浊管内，剧烈震荡，使菌体悬浮，振荡后立刻插入比浊仪，测定其OD值，作好标记，当OD值在0.5～1.0之间时，方可用于生化特性分析鉴定。

    将制备好的比浊管放入法国生物梅里埃公司VITEK-2分析仪，每管放入一个革兰氏阴性菌鉴定卡，将比浊管号输入电脑，按说明书设定好程序。18 h后读取并打印鉴定结果。

    2.5 药物敏感试验

    挑取经过鉴定，确定为埃希氏大肠杆菌的菌株进行药物敏感试验。采用Kirby±Bauer琼脂扩散法操作， 测定大肠杆菌对抗生素药物的敏感性。详见下表1。

    3 结果与分析

    3.1 乳样的采集

    从新疆昌吉地区6个规模化奶牛场196头隐性乳房炎病牛采得乳样671份。

    3.2 细菌分离鉴定结果

    从671份奶样中分离出疑似埃希氏大肠杆菌93株，经VITEK 2全自动生化鉴定仪鉴定出64株埃希氏大肠杆菌，占采集奶样份数的9.5%。

    3.3 药敏试验结果

    药敏试验结果（表2）表明，该地区乳汁分离的大肠杆菌对青霉素、氨苄西林、链霉素、四环素呈现较强的耐药性，其中链霉素耐药率最高，为68.74%，对头孢唑林、氧氟沙星，克林霉素较为敏感。头孢唑林敏感率最高，为32.81%。

    4 小结及讨论

    本试验无菌采集了新疆昌吉地区6个规模化奶牛场的196头经检测为奶牛隐性乳房炎阳性奶牛的乳样共671份，采用常规的微生物学方法对乳样进行了细菌分离鉴定和药敏试验。细菌生化鉴定采用微生物鉴定仪（VITEK2）进行鉴定，药敏试验采用纸片法。结果表明，新疆昌吉地区规模化奶牛场的隐性乳房炎阳性率为40.8%，从671份乳样中分离出大肠杆菌64株，占样本数的9.5%，占大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌3种细菌总数的32.16%（64/199）。药敏试验结果表明鉴定出的64株大肠杆菌对氧氟沙星、头孢唑林、克林霉素敏感；对青霉素、庆大霉素、氨苄西林中度敏感；对链霉素、四环素有耐药性。为大肠杆菌引起的隐形乳房炎提供了预防和治疗的依据。

    由此看来，大肠杆菌在奶牛隐性乳房炎致病菌中所占比例在不同地区存在较大的差异，这可能与不同地区的生物环境及牛场用药制度有关。

    摘要：为解大肠杆菌在新疆昌吉地区奶牛隐性乳房炎流行中所起的作用，试验对昌吉地区奶牛隐性乳房炎病牛乳样进行了大肠杆菌的分离、鉴定及耐药性研究。结果表明，昌吉地区规模化奶牛场的隐性乳房炎阳性率为40.8%，从671份乳样中分离出大肠杆菌64株，占样本数的9.5%，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌三种细菌总数的32.16%。药敏试验结果表明鉴定出的64株大肠杆菌对氧氟沙星、头孢唑林、克林霉素敏感；对青霉素、庆大霉素、氨苄西林中度敏感；对链霉素、四环素有耐药性。

    关键词：昌吉地区；大肠杆菌；奶牛乳房炎；调查与分析

    中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）01-0005-03

    奶牛乳房炎的发病原因是复杂多样的，主要包括物理因素、化学因素和微生物因素，其严重影响产奶量，因此，奶牛隐性乳房炎的防治是一个急需解决的问题。肠杆菌科中的埃希氏大肠杆菌是导致奶牛乳房炎的重要环境病原菌之一。为了解大肠杆菌在新疆昌吉地区奶牛隐性乳房炎流行中所起的作用，试验对昌吉地区奶牛隐性乳房炎病牛乳样进行了大肠杆菌的分离、鉴定及耐药性研究，旨在为科学防治奶牛乳房炎提供科学依据。

    1 试验材料

    1.1 样品来源

    新鲜乳样671份，来自新疆昌吉地区6个规模化牛场的196头奶牛隐性乳房炎病牛。

    1.2 主要仪器

    恒温培养振荡器、隔水式恒温培养箱、电热恒温培养箱，生物显微镜、超净工作台，法国生物梅里埃公司VITEK-2全自动生化分析仪、立式电热压力蒸汽灭菌锅，试管、培养皿若干，奶牛隐性乳房炎诊断盘。

    1.3 培养基及试剂

    LB液体培养基、LB固体培养基、麦康凯琼脂培养基、革兰氏染液。

    1.4 药敏纸片

    氨苄西林、青霉素、氧氟沙星、阿莫西林、链霉素、四环素、克林霉素、庆大霉素、头孢唑啉均购自杭州微生物试剂有限公司。

    2 试验方法

    2.1 隐性乳房炎的检测与奶样的采集

    选取隐性乳房炎阳性奶牛，记录其耳号，常规无菌操作进行人工挤乳，弃去头三把乳汁，从每个乳头取奶2 mL于5 mL EP管内，做好标记，置于放有冰带的采样箱内，尽快送至实验室，-20 ℃保存备用。

    2.2 细菌的分离培养与纯化

    2.2.1 细菌的培养 将乳样反复冻融4次后，每份取50 μL接种于LB肉汤中，作好标记，置于37 ℃恒温培养箱内，220 r/min振荡培养18～24 h。

    2.2.2 液体培养物的涂片观察 取出后用接种环取一环菌液涂片固定，通过革兰氏染色法进行染色后用油镜观察其形态，包括菌体颜色、大小、形状，有无芽孢形成，有无鞭毛等。

    在麦康凯培养基、LB固体培养基上进行四区划线，倒扣于37 ℃恒温培养箱内培养12～18 h。

    2.3 分离菌的形态学鉴定

    观察麦康凯培养基和LB固体培养基上群落的生长状况，包括大小、形状、颜色、表面光滑程度等。

    菌体形态：从麦康凯上挑取圆形、红色、菌落中部为黑色的菌落进行染色。取洁净的载玻片，滴加一小滴生理盐水，将接种环燃烧后蘸取少量菌体接种到水滴上，涂抹均匀，晾干，染色观察。

    挑取形状规则、菌落偏小、表面光滑、中间为黑色的菌落，接种到LB液体培养基内，培养18 h，再次四区划线，挑取单个菌落，染色观察。如此重复，直至菌体在显微镜下观察时形态完全一致时，将单个菌落接种于LB斜面培养基上，4 ℃保存备用。

    2.4 生理生化特性鉴定

    采用法国生物梅里埃公司VITEK-2分析仪GN鉴定卡进行分析，严格按仪器要求操作。

    2.4.1 比浊管的制备 根据培养特性和镜检结果，上一步所分离的疑似大肠杆菌接种于斜面，培养18 h，用接种环由外到内刮取菌落接种到事先准备好的专用比浊管内，剧烈震荡，使菌体悬浮，振荡后立刻插入比浊仪，测定其OD值，作好标记，当OD值在0.5～1.0之间时，方可用于生化特性分析鉴定。

    将制备好的比浊管放入法国生物梅里埃公司VITEK-2分析仪，每管放入一个革兰氏阴性菌鉴定卡，将比浊管号输入电脑，按说明书设定好程序。18 h后读取并打印鉴定结果。

    2.5 药物敏感试验

    挑取经过鉴定，确定为埃希氏大肠杆菌的菌株进行药物敏感试验。采用Kirby±Bauer琼脂扩散法操作， 测定大肠杆菌对抗生素药物的敏感性。详见下表1。

    3 结果与分析

    3.1 乳样的采集

    从新疆昌吉地区6个规模化奶牛场196头隐性乳房炎病牛采得乳样671份。

    3.2 细菌分离鉴定结果

    从671份奶样中分离出疑似埃希氏大肠杆菌93株，经VITEK 2全自动生化鉴定仪鉴定出64株埃希氏大肠杆菌，占采集奶样份数的9.5%。

    3.3 药敏试验结果

    药敏试验结果（表2）表明，该地区乳汁分离的大肠杆菌对青霉素、氨苄西林、链霉素、四环素呈现较强的耐药性，其中链霉素耐药率最高，为68.74%，对头孢唑林、氧氟沙星，克林霉素较为敏感。头孢唑林敏感率最高，为32.81%。

    4 小结及讨论

    本试验无菌采集了新疆昌吉地区6个规模化奶牛场的196头经检测为奶牛隐性乳房炎阳性奶牛的乳样共671份，采用常规的微生物学方法对乳样进行了细菌分离鉴定和药敏试验。细菌生化鉴定采用微生物鉴定仪（VITEK2）进行鉴定，药敏试验采用纸片法。结果表明，新疆昌吉地区规模化奶牛场的隐性乳房炎阳性率为40.8%，从671份乳样中分离出大肠杆菌64株，占样本数的9.5%，占大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌3种细菌总数的32.16%（64/199）。药敏试验结果表明鉴定出的64株大肠杆菌对氧氟沙星、头孢唑林、克林霉素敏感；对青霉素、庆大霉素、氨苄西林中度敏感；对链霉素、四环素有耐药性。为大肠杆菌引起的隐形乳房炎提供了预防和治疗的依据。

    由此看来，大肠杆菌在奶牛隐性乳房炎致病菌中所占比例在不同地区存在较大的差异，这可能与不同地区的生物环境及牛场用药制度有关。

    摘要：为解大肠杆菌在新疆昌吉地区奶牛隐性乳房炎流行中所起的作用，试验对昌吉地区奶牛隐性乳房炎病牛乳样进行了大肠杆菌的分离、鉴定及耐药性研究。结果表明，昌吉地区规模化奶牛场的隐性乳房炎阳性率为40.8%，从671份乳样中分离出大肠杆菌64株，占样本数的9.5%，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌三种细菌总数的32.16%。药敏试验结果表明鉴定出的64株大肠杆菌对氧氟沙星、头孢唑林、克林霉素敏感；对青霉素、庆大霉素、氨苄西林中度敏感；对链霉素、四环素有耐药性。

    关键词：昌吉地区；大肠杆菌；奶牛乳房炎；调查与分析

    中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）01-0005-03

    奶牛乳房炎的发病原因是复杂多样的，主要包括物理因素、化学因素和微生物因素，其严重影响产奶量，因此，奶牛隐性乳房炎的防治是一个急需解决的问题。肠杆菌科中的埃希氏大肠杆菌是导致奶牛乳房炎的重要环境病原菌之一。为了解大肠杆菌在新疆昌吉地区奶牛隐性乳房炎流行中所起的作用，试验对昌吉地区奶牛隐性乳房炎病牛乳样进行了大肠杆菌的分离、鉴定及耐药性研究，旨在为科学防治奶牛乳房炎提供科学依据。

    1 试验材料

    1.1 样品来源

    新鲜乳样671份，来自新疆昌吉地区6个规模化牛场的196头奶牛隐性乳房炎病牛。

    1.2 主要仪器

    恒温培养振荡器、隔水式恒温培养箱、电热恒温培养箱，生物显微镜、超净工作台，法国生物梅里埃公司VITEK-2全自动生化分析仪、立式电热压力蒸汽灭菌锅，试管、培养皿若干，奶牛隐性乳房炎诊断盘。

    1.3 培养基及试剂

    LB液体培养基、LB固体培养基、麦康凯琼脂培养基、革兰氏染液。

    1.4 药敏纸片

    氨苄西林、青霉素、氧氟沙星、阿莫西林、链霉素、四环素、克林霉素、庆大霉素、头孢唑啉均购自杭州微生物试剂有限公司。

    2 试验方法

    2.1 隐性乳房炎的检测与奶样的采集

    选取隐性乳房炎阳性奶牛，记录其耳号，常规无菌操作进行人工挤乳，弃去头三把乳汁，从每个乳头取奶2 mL于5 mL EP管内，做好标记，置于放有冰带的采样箱内，尽快送至实验室，-20 ℃保存备用。

    2.2 细菌的分离培养与纯化

    2.2.1 细菌的培养 将乳样反复冻融4次后，每份取50 μL接种于LB肉汤中，作好标记，置于37 ℃恒温培养箱内，220 r/min振荡培养18～24 h。

    2.2.2 液体培养物的涂片观察 取出后用接种环取一环菌液涂片固定，通过革兰氏染色法进行染色后用油镜观察其形态，包括菌体颜色、大小、形状，有无芽孢形成，有无鞭毛等。

    在麦康凯培养基、LB固体培养基上进行四区划线，倒扣于37 ℃恒温培养箱内培养12～18 h。

    2.3 分离菌的形态学鉴定

    观察麦康凯培养基和LB固体培养基上群落的生长状况，包括大小、形状、颜色、表面光滑程度等。

    菌体形态：从麦康凯上挑取圆形、红色、菌落中部为黑色的菌落进行染色。取洁净的载玻片，滴加一小滴生理盐水，将接种环燃烧后蘸取少量菌体接种到水滴上，涂抹均匀，晾干，染色观察。

    挑取形状规则、菌落偏小、表面光滑、中间为黑色的菌落，接种到LB液体培养基内，培养18 h，再次四区划线，挑取单个菌落，染色观察。如此重复，直至菌体在显微镜下观察时形态完全一致时，将单个菌落接种于LB斜面培养基上，4 ℃保存备用。

    2.4 生理生化特性鉴定

    采用法国生物梅里埃公司VITEK-2分析仪GN鉴定卡进行分析，严格按仪器要求操作。

    2.4.1 比浊管的制备 根据培养特性和镜检结果，上一步所分离的疑似大肠杆菌接种于斜面，培养18 h，用接种环由外到内刮取菌落接种到事先准备好的专用比浊管内，剧烈震荡，使菌体悬浮，振荡后立刻插入比浊仪，测定其OD值，作好标记，当OD值在0.5～1.0之间时，方可用于生化特性分析鉴定。

    将制备好的比浊管放入法国生物梅里埃公司VITEK-2分析仪，每管放入一个革兰氏阴性菌鉴定卡，将比浊管号输入电脑，按说明书设定好程序。18 h后读取并打印鉴定结果。

    2.5 药物敏感试验

    挑取经过鉴定，确定为埃希氏大肠杆菌的菌株进行药物敏感试验。采用Kirby±Bauer琼脂扩散法操作， 测定大肠杆菌对抗生素药物的敏感性。详见下表1。

    3 结果与分析

    3.1 乳样的采集

    从新疆昌吉地区6个规模化奶牛场196头隐性乳房炎病牛采得乳样671份。

    3.2 细菌分离鉴定结果

    从671份奶样中分离出疑似埃希氏大肠杆菌93株，经VITEK 2全自动生化鉴定仪鉴定出64株埃希氏大肠杆菌，占采集奶样份数的9.5%。

    3.3 药敏试验结果

    药敏试验结果（表2）表明，该地区乳汁分离的大肠杆菌对青霉素、氨苄西林、链霉素、四环素呈现较强的耐药性，其中链霉素耐药率最高，为68.74%，对头孢唑林、氧氟沙星，克林霉素较为敏感。头孢唑林敏感率最高，为32.81%。

    4 小结及讨论

    本试验无菌采集了新疆昌吉地区6个规模化奶牛场的196头经检测为奶牛隐性乳房炎阳性奶牛的乳样共671份，采用常规的微生物学方法对乳样进行了细菌分离鉴定和药敏试验。细菌生化鉴定采用微生物鉴定仪（VITEK2）进行鉴定，药敏试验采用纸片法。结果表明，新疆昌吉地区规模化奶牛场的隐性乳房炎阳性率为40.8%，从671份乳样中分离出大肠杆菌64株，占样本数的9.5%，占大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌3种细菌总数的32.16%（64/199）。药敏试验结果表明鉴定出的64株大肠杆菌对氧氟沙星、头孢唑林、克林霉素敏感；对青霉素、庆大霉素、氨苄西林中度敏感；对链霉素、四环素有耐药性。为大肠杆菌引起的隐形乳房炎提供了预防和治疗的依据。

    由此看来，大肠杆菌在奶牛隐性乳房炎致病菌中所占比例在不同地区存在较大的差异，这可能与不同地区的生物环境及牛场用药制度有关。