利用SSR技术快速鉴定2个辣椒杂交品种纯度
陈琛 罗俊杰 陈卫国
摘要：利用SSR分子标记技术，对辣椒杂交种甘科4号和甘科10号及其父母本进行引物筛选和纯度鉴定，旨在建立供试品种的高效纯度鉴定体系，并对公布的辣椒SSR核心引物进行验证。结果表明， 2个品种各筛选出1对引物在亲本间有明显差异，在杂交种中表现为共显性，分别为Es330和Epms923。利用这2对引物分别对供试品种进行纯度鉴定，甘科4号的纯度为96.4%，与田间种植鉴定纯度98.2%相差1.8百分点;甘科10号的纯度为91.8%，与田间种植鉴定纯度92.7%相差0.9百分点。说明筛选出的2对引物对甘科4号和甘科10号种子纯度的鉴定结果真实可靠，可以用于杂交种纯度的高效快速鉴定。
关键词：辣椒; SSR分子标记;纯度鉴定
Abstract：In this study，pepper hybrid cultivars Ganke 4、Ganke 10 and their parental inbred lines were used to identify hybrid purity by SSR markers， aiming at establishing a quick and efficient purity identification system for tested varieties， verifying? the published pepper SSR core primers at the same time. The results showed that there was one primer pair selected in each cultivars，named Es330 and Epms923， which had significant difference between the parental inbred lines， and showed co-dominance in the hybrids. Using the two primer pairs to identify the purity of the tested varieties，the purity of Ganke 4 was 96.4%， which had 1.8 percentage point difference from the purity of 98.2% identified in field. the purity of Ganke 10 was 91.8%，which had 0.9 percentage point difference from the purity of 92.7% by field identification. It was proved that the identification of hybrid purity of Ganke 4 and Ganke 10 were authentic and reliable， the two SSR markers could be used for efficient and rapid identification of hybrid purity.
辣椒（Capsicum annuum L.）在中國每年的种植面积超过200万hm2，是中国栽培面积最大的蔬菜作物之一[1 ]。生产上使用的大多数品种为杂交一代。中国的辣椒杂交育种的研究始于20世纪70年代，培育出了许多优良品种，如早丰1号、湘研系列、杭椒1号、陇椒2号等[2 ]。杂交品种能整合亲本的优良基因，显著提高辣椒产量、质量及抗病抗逆性。但辣椒是常异花授粉植物，在杂交种子生产过程中常因隔离区不好、去雄不彻底、风媒虫媒传粉等原因导致种子混杂，使品种的纯度和真实性下降。
目前鉴定种子纯度的常用方法有田间形态鉴定法、同工酶电泳技术、种子贮藏蛋白电泳技术和DNA分子标记鉴定法[3 ]。田间形态鉴定要经历一个植物学生长周期，耗时长，成本高，且易受到栽培环境、气候因素影响，对鉴定人员的要求也较高，需要鉴定者有丰富的工作经验，熟悉鉴定品种及其亲本的植物学性状差异和亲子间的遗传特性等;其次，由于部分骨干亲本的频繁使用使育成品种间的差异也逐渐缩小，仅根据外观形态难以准确区分不同品种间的差异。同工酶具有组织特异性，多态性较低，且酶易失活，对操作的要求较为严格。蛋白质电泳是基于种子贮藏蛋白的多样性通过电泳加以区分，但当品种数量较多，亲缘关系相近时难以鉴别[4 ]。SSR（Simple sequence repeat）是一类可遗传的DNA串联重复序列，通常由1～6个核苷酸串联重复组成，是一种常用的分子标记。除了操作简便、多态性高、准确性高等优点，SSR标记呈共显性遗传，可以用以区分纯合体和杂合体，是杂交种纯度鉴定的理想手段，也是目前应用最为广泛的分子标记技术[5 ]。目前，SSR分子标记技术已经被应用于西瓜[6 ]、油菜[3 ]、玉米[7 ]、马铃薯[8 ]等农作物种子纯度的鉴定上，并且被证实是一种高效、可靠的方法。我们选取辣椒杂交一代品种甘科4号和甘科10号及其父母本为材料，应用NY/T 2475-2013 行业标准中报道的22对辣椒SSR核心引物对以上2个品种进行纯度鉴定，初步建立甘科4号和甘科10号种子纯度的SSR检测体系，并对标准中公布的核心引物的有效性进行验证。
1? ?材料与方法
1.1? ?供试材料
供试辣椒杂交种甘科4号、甘科10号及亲本材料均由甘肃绿星农业科技有限责任公司选育并提供。每品种选取饱满种子120粒，于2019年5月均匀播种在育苗盘中，长出2片真叶时随机选取110株幼苗剪下叶片提取DNA。同时在塑料大棚内种植2个供试品种材料各100株以上进行田间种植鉴定。将SSR分子标记鉴定结果与田间种植鉴定结果进行对比分析。
1.2? ?试验方法
1.2.1? ? 基因组DNA提取? ? SSR标记引物筛选所使用的DNA采用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取，提取完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 测定DNA样品的浓度和质量，将DNA稀释至50 ng/μL ，保存在-20 ℃冰箱备用。杂交种纯度鉴定所用的DNA参照Weigel的DNA快速提取法[9 ]，所提DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop进行质量和浓度检测，保存于4 ℃冰箱备用。所用试剂包括Tris-HCl（pH 7.5）、NaCl、EDTA、SDS、异丙醇等。
1.2.2? ? SSR引物筛选? ? 根据NY/T 2475-2013 行业标准中公布的辣椒SSR核心引物序列合成引物22对，由西安擎科生物技术有限公司合成。以甘科4号和甘科10号及各自亲本DNA为模板进行PCR扩增，筛选在父母本中有差异且在杂交种中表现为共显形的引物。PCR反应体系15 μL，由2×taq MasterMix 7.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物（10 μmol/L ）各0.6 μL、ddH2O 5.3 μL组成。扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。退火温度根据每对引物的Tm值设置。取PCR扩增产物2 μL经6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色后拍照记录。
1.2.3? ? SSR标记鉴定种子纯度? ? 以每个品种单株DNA110份和亲本DNA为模板，用筛选出的引物进行PCR扩增，根据电泳结果计算杂交种纯度。
2? ?结果与分析
2.1? ?SSR引物的筛选
经试验发现，甘科4号和甘科10号2个辣椒品种各有1对引物Es330 和Epms923在亲本间有明显差异，且在F1代杂交种中表现为共显形。引物Es330可以鉴定甘科4号（图1D），引物Epms923可以鉴定甘科10号（图1E）。其余引物大致可分为以下几种：在父、母、子代中均具有无差异条带（图1A）;在父、母本中分别扩增出不同的条带，而在子代中扩增出的条带与父母本中一方相同（图1B）;在父、母本中扩增出的条带无差异，而在子代中扩增出不同的条带（图1C）。Es330和Epms923的序列及PCR程序见表1。
2.2? ?杂交种纯度鉴定
用筛选出的两对SSR引物分别对甘科4号和甘科10号的110个单株DNA样本进行扩增鉴定纯度。引物Es330对甘科4号的鉴定结果（图2）所示，第75、106号单株的条带与母本一致，属于母本特异谱带;第92号单株的条带与父本带型一致，属父本特异谱带;第37号单株既无母本条带也没有父本条带，其余的106个单株都具有父母本杂合条带，种子纯度为96.4%。
引物Epms923对甘科10号的鉴定结果图3所示，表现为母本特异谱带的单株有第16、19、26、37、54、79、85、90号，共8株。第52号单株既无母本特异条带也没有父本特异条带，应为混杂的其他品种种子。没有检测到只具有父本特异条带的单株。其余101个单株具有双亲杂合条带，种子纯度为91.8%。电泳结果统计见表2。
2.3? ?田间种植纯度鉴定与SSR分子标记鉴定结果比较
田间种植鉴定在最佳鉴定时期（果实成熟期）进行，此时辣椒鉴定品种特有的植物学性状已完全表现出来，便于准确鉴定。主要依据鉴定品种的植物学性状表现（植株高矮、茎节颜色、叶片长宽比、花器颜色、果实纵横径及比例、果实形状及颜色、果面皱褶多少等）。进行形态学差异鉴别，将田间种植鉴定结果与SSR分子标记鉴定结果进行对比，2个品种的鉴定结果偏差分别为1.8、0.9百分点（表3）。
3? ?结论与讨论
利用SSR分子标记技术，对辣椒杂交种甘科4号和甘科10号及其父母本进行引物筛选和纯度鉴定，并对公布的辣椒SSR核心引物进行验证。结果表明， 2个品种各筛选出1对引物在亲本间有明显差异，在杂交种中表现为共显形，分别为Es330和Epms923。利用这2对引物分别对供试品种进行纯度鉴定，甘科4号的纯度为96.4%，与田间种植鉴定纯度98.2%相差1.8百分点;甘科10号的纯度为91.8%，与田间种植鉴定纯度92.7%相差0.9百分点。说明筛选出的2对引物对甘科4号和甘科10号种子纯度的鉴定结果真实可靠，可以用于杂交种纯度的高效快速鉴定。
辣椒杂交种生产通常采取蕾期人工去雄杂交授粉完成，造成种子不纯的原因主要有去雄不彻底导致母本自交、由于风媒虫媒等原因导致母本被非父本的花粉污染、机械或人为疏漏导致种子混杂。从试验结果来看，2个品种的不纯单株大部分是母本自交后代，说明造成种子不纯的最主要原因为去雄不彻底形成的母本自交种。这与李淑红等[10 ]对3个辣椒品種鉴定纯度得出的结论一致。SSR鉴定结果与田间种植鉴定结果的纯度偏差在2个品种中均小于2%，说明利用分子标记鉴定辣椒杂交种子纯度是一种准确、可靠的方法，也证明了本文采用的引物来源NY/T 2475-2013 行业标准的有效性。
本试验对每个品种只用了1对SSR引物进行鉴定，结果与田间种植鉴定结果相近。刘子记等[11 ]利用3对SSR标记对热辣2号杂交种进行纯度鉴定，结果显示3对标记的鉴定结果完全一致，并且与田间鉴定的结果也完全一致;杨双娟等[12 ]用2对引物鉴定了豫椒101杂交种的纯度，结果只相差0.5%，近乎一致。这些研究结果表明，单对SSR引物就可以对杂交种纯度进行鉴定。但是，也有研究中发现，并非所有引物都具有这样的准确性。傅鸿妃等[1 ]利用2对引物用于杭椒新品种H12的纯度鉴定，结果分别为95.8%和89.6%，田间鉴定结果为94.5%，存在较大偏差。Sundaram 等[13 ]利用多对SSR引物用于杂交水稻的纯度鉴定，指出多对引物比单对引物的检测结果更准确。因此在纯度鉴定时选择合适的SSR引物十分重要。
分子标记相关试验中，通常需要大批量提取DNA。常用的DNA提取方法一般采用CTAB法或使用试剂盒，不仅耗时耗力，且后者成本较高。本文采用的DNA提取方法，是在Weigel的SDS快速提取植物DNA方法的基础上加以改进，无须使用液氮研磨和氯仿、PVP、异戊醇等有毒化学试剂，且经后续试验检测DNA的质量也较好。该方法能够实现短时间大批量植物DNA样本的制备，为SSR分子标记试验提供了极大便利。
参考文献：
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[12] 杨双娟，于文涛，原玉香，等.? 辣椒品种豫椒101纯度鉴定的SSR標记筛选[J].? 分子植物育种，2019，17（222）：7433-7437.
[13] SUNDARAM R M，NAVEENKUMAR B，BIRADAR S K，et al. Identification of informative SSR markers capable of distinguishing hybrid rice parental lines and their utilization in seed assessment[J].? Euphytica，2008，163：215-224.
（本文责编：杨? ? 杰）
