一株白僵菌菌株的分离鉴定及对紫薇梨象成虫致病力的初步研究
张建华 查玉平 陈京元 王义勋 蔡三山 洪承昊 赵东容
摘 要：为了得到用于防控紫薇梨象的高毒力菌株，本试验从野外萤火虫僵虫体表分离出一株白僵菌，通过形态学和分子生物学方法鉴定为球孢白僵菌。致病力研究表明，菌株的孢子浓度达到106个孢子/ mL时，对紫薇梨象的致死率为62.5%，具有成为紫薇梨象成虫生物农药的潜力。
关键词：白僵菌；紫薇梨象；真菌杀虫剂
中图分类号： S476.12文献标识码： A文章编号： 1004-3020（2016）02-0037-03
Abstract：In order to screen highly pathogenic strains to Pseudorobitis gibbus Redtenbacher， a strain of Beauveria sp. was isolated from dead firefly. The isolate was identified as B. bassiana by morphological characteristics and the method of molecular biology. P. gibbus was sprayed with a suspension of fungal spores with 1× 106 mL， and the corrected mortality of adults was 62.5% after 15 d. It indicated that the strain of B. bassiana can be applied to biological control of P. gibbus in fields.
Key words：Beauveria bassiana； Pseudorobitis gibbus； fungal pesticides
紫薇梨象Pseudorobitis gibbus是一种危害紫薇Lagerstroemia indica的重要害虫，主要分布于湖北、山东、江苏、陕西等地[]。紫薇梨象的成虫和幼虫均对紫薇造成危害。其成虫取食嫩叶、嫩梢、花以及幼嫩种子等，幼虫则钻蛀花萼、幼嫩蒴果、种子[2]。目前，对紫薇梨象有较好防治效果的农药有阿维菌素[3]、吡虫啉、氰戊菊酯、甲维盐[]等。
白僵菌是一种对较多农林害虫具有较好防治成效的真菌杀虫剂[4]，但是对紫薇梨象的生物防治研究尚未见报道。本研究从林间采集的萤火虫僵虫上分离纯化出一株白僵菌菌株，并通过形态学和分子生物学方法进行鉴定。本研究用分离出的菌株对紫薇梨象进行了感染试验，以期获得紫薇梨象的高效致病菌株，为其生物防治奠定基础。现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
菌株来自蕲春林间采集到的1头萤火虫僵虫。
1.2 菌株分离、纯化与鉴定
直接在僵虫体表挑取菌丝和孢子粉进行分离。在PDA培养基上培养14 d（26 ℃）后，取分生孢子以0.1 %吐温-80的无菌水配制成浓度为1×10个/mL的孢子悬浮液，然后用接种针分别将孢子悬浮液点植于PDA平板培养基（3 个培养皿），每皿3 点，成正三角形排列，最后置于26 ℃恒温培养箱中培养。第7 d观察记录菌落形态特征。同时挑取少量菌丝和孢子，在显微镜下进行形态学鉴定。
分子生物学鉴定采用ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 区域的特异性PCR扩增，而后测序比对。引物为ITS1F（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）， PCR体系（25 μL）：10× Taq 酶缓冲液，dNTP 各200 mm，MgCl2 3.7 mm，引物各0.4 mm，Taq 酶2 U，模板DNA 5～ 10 ng。PCR 扩增程序为：94 ℃1 min，1 个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30 个循环；最后72 ℃ 7 min。DNA测序由宝生物工程有限公司完成。在GenBank进行检索比对同源序列。
1.3 感病力测试
采用喷雾法测试。野外分离的白僵菌菌株在PDA培养基上培养14 d（26 ℃）后，取分生孢子以0.1% 吐温-80的无菌水配制成浓度为1× 107个孢子/mL的孢子悬浮液，而后再10倍梯度稀释成 1× 106个孢子/mL、1× 105个孢子/mL的孢子悬浮液。选择羽化期相同的紫薇梨象成虫进行测试，将配置好的白僵菌孢子悬浮液分别对试虫喷雾处理。每个处理组10头，重复4次。以清水做对照。处理后置于27±1℃， 60%～80% RH，L∶D= 14∶10的人工气候箱内饲养，及时补充新鲜无污染的紫薇叶片。第3 d、7 d、15 d观察试虫死亡情况。死亡判定：用昆虫针触碰虫体，如无动作即为死亡。。
1.4 数据调查与统计分析
感染后第3 d、7 d、15 d检查死虫数，根据公式计算死亡率，并统计校正死亡率。
虫口死亡率（%）= 感染前活虫数-感染后活虫数 感染前活虫数 ×100
感染效果（%）= PT-CK 100-CK） ×100
式中： PT—菌液处理后的虫口死亡率
CK—空白对照的虫口死亡率
用DPS2000软件对数据进行新复极差法统计分析。
2 结果与分析
2.1 形态学及分子生物学鉴定
分离的菌株在PDA培养基上培养，其菌落为白色，绒毛状，有同心环，表面平坦无褶皱，有放射沟。在显微镜下，分生孢子为光滑无色的球形，确定该菌株属半知菌亚门Deuteromycotina丝孢纲Hyphomyceres丛梗孢目Moniliales丛梗孢科Moniliaceae白僵菌属Beauveria。
分离菌株的序列登陆GenBank检索表明，与该菌株序列同源性最高的菌株为球孢白僵菌，同源性为100 %。结合形态学鉴定结果，所分离菌株确定为球孢白僵菌Beauveria bassiana。
2.2 感病力测定结果
从表1中可以看出，从萤火虫僵虫上分离的菌株对于紫薇梨象成虫具有较好的感病效果。在施药后15 d，1× 106个孢子/mL和1×107个孢子/mL的孢子悬浮液的防效都达到60 %以上。因此，该菌株具有成为紫薇梨象成虫专用型生物农药的潜力。
3 讨论
紫薇是一种优良的庭院观赏树和绿化行道树，具有重要的观赏和经济价值[5]。紫薇梨象在2007年首次被发现对泰安市紫薇造成严重危害，随后在湖北、安徽等地相继有危害紫薇的报道[3-6]。该虫危害紫薇的整个发育时期，具有种群数量大、扩散快、危害的时间长等特点，大大降低了紫薇的观赏价值，并威胁到种实繁殖[7]。如何有效防治紫薇梨象成为森保科研工作者的重要课题。
白僵菌是一类寄主范围广、持效性良好，与环境友好，对人畜无害的生物农药[4]。而且白僵菌的工业化生产已经比较成熟，可以大批量生产用于生物防治。本研究分离的白僵菌菌株对紫薇梨象成虫具有较强的感病力，根据该虫的生物学特性，在林间喷洒白僵菌可以有效防治成虫，为其生物防治提供新途径。
参 考 文 献
[1]李艳，周光锋，于丽颖，等. 8种药剂对紫薇梨象成虫的室内毒力测定及室外药效试验[J]. 中国森林病虫，2013，32（4）：30-33.
[2]王菊英，周成刚，乔鲁芹，等. 严重危害紫薇的新害虫——紫薇梨象[J]. 中国森林病虫，2010，29（4）：18-20.
[3]查玉平，洪承昊，胡孜进，等.阿维菌素对紫薇梨象的室内毒力评价[J]. 湖北林业科技，2010，（6）：30-31.
[4]查玉平，陈京元，夏剑萍. 白僵菌防治森林害虫的研究与应用[J]. 湖北林业科技，2010，（3）：40-42，39.
[5]靳晓翠，范义荣. 紫薇种质资源概况及应用现状分析[J]. 河北农业科学，2009，13（1）：16-17，20.
[6]唐长贞，唐燕平，康克，等. 皖西南紫薇梨象生活史与危害特性研究[J]. 南京林业大学学报（自然科学版），2015，39（6）：177-180.
[7] 刘大川，周成刚，李艳，等. 紫薇梨象的危害与紫薇生长发育的关系[J]. 环境昆虫学报，2011，33（3）：302-307.
（责任编辑：郑京津）
摘 要：为了得到用于防控紫薇梨象的高毒力菌株，本试验从野外萤火虫僵虫体表分离出一株白僵菌，通过形态学和分子生物学方法鉴定为球孢白僵菌。致病力研究表明，菌株的孢子浓度达到106个孢子/ mL时，对紫薇梨象的致死率为62.5%，具有成为紫薇梨象成虫生物农药的潜力。
关键词：白僵菌；紫薇梨象；真菌杀虫剂
中图分类号： S476.12文献标识码： A文章编号： 1004-3020（2016）02-0037-03
Abstract：In order to screen highly pathogenic strains to Pseudorobitis gibbus Redtenbacher， a strain of Beauveria sp. was isolated from dead firefly. The isolate was identified as B. bassiana by morphological characteristics and the method of molecular biology. P. gibbus was sprayed with a suspension of fungal spores with 1× 106 mL， and the corrected mortality of adults was 62.5% after 15 d. It indicated that the strain of B. bassiana can be applied to biological control of P. gibbus in fields.
Key words：Beauveria bassiana； Pseudorobitis gibbus； fungal pesticides
紫薇梨象Pseudorobitis gibbus是一种危害紫薇Lagerstroemia indica的重要害虫，主要分布于湖北、山东、江苏、陕西等地[]。紫薇梨象的成虫和幼虫均对紫薇造成危害。其成虫取食嫩叶、嫩梢、花以及幼嫩种子等，幼虫则钻蛀花萼、幼嫩蒴果、种子[2]。目前，对紫薇梨象有较好防治效果的农药有阿维菌素[3]、吡虫啉、氰戊菊酯、甲维盐[]等。
白僵菌是一种对较多农林害虫具有较好防治成效的真菌杀虫剂[4]，但是对紫薇梨象的生物防治研究尚未见报道。本研究从林间采集的萤火虫僵虫上分离纯化出一株白僵菌菌株，并通过形态学和分子生物学方法进行鉴定。本研究用分离出的菌株对紫薇梨象进行了感染试验，以期获得紫薇梨象的高效致病菌株，为其生物防治奠定基础。现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
菌株来自蕲春林间采集到的1头萤火虫僵虫。
1.2 菌株分离、纯化与鉴定
直接在僵虫体表挑取菌丝和孢子粉进行分离。在PDA培养基上培养14 d（26 ℃）后，取分生孢子以0.1 %吐温-80的无菌水配制成浓度为1×10个/mL的孢子悬浮液，然后用接种针分别将孢子悬浮液点植于PDA平板培养基（3 个培养皿），每皿3 点，成正三角形排列，最后置于26 ℃恒温培养箱中培养。第7 d观察记录菌落形态特征。同时挑取少量菌丝和孢子，在显微镜下进行形态学鉴定。
分子生物学鉴定采用ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 区域的特异性PCR扩增，而后测序比对。引物为ITS1F（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）， PCR体系（25 μL）：10× Taq 酶缓冲液，dNTP 各200 mm，MgCl2 3.7 mm，引物各0.4 mm，Taq 酶2 U，模板DNA 5～ 10 ng。PCR 扩增程序为：94 ℃1 min，1 个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30 个循环；最后72 ℃ 7 min。DNA测序由宝生物工程有限公司完成。在GenBank进行检索比对同源序列。
1.3 感病力测试
采用喷雾法测试。野外分离的白僵菌菌株在PDA培养基上培养14 d（26 ℃）后，取分生孢子以0.1% 吐温-80的无菌水配制成浓度为1× 107个孢子/mL的孢子悬浮液，而后再10倍梯度稀释成 1× 106个孢子/mL、1× 105个孢子/mL的孢子悬浮液。选择羽化期相同的紫薇梨象成虫进行测试，将配置好的白僵菌孢子悬浮液分别对试虫喷雾处理。每个处理组10头，重复4次。以清水做对照。处理后置于27±1℃， 60%～80% RH，L∶D= 14∶10的人工气候箱内饲养，及时补充新鲜无污染的紫薇叶片。第3 d、7 d、15 d观察试虫死亡情况。死亡判定：用昆虫针触碰虫体，如无动作即为死亡。。
1.4 数据调查与统计分析
感染后第3 d、7 d、15 d检查死虫数，根据公式计算死亡率，并统计校正死亡率。
虫口死亡率（%）= 感染前活虫数-感染后活虫数 感染前活虫数 ×100
感染效果（%）= PT-CK 100-CK） ×100
式中： PT—菌液处理后的虫口死亡率
CK—空白对照的虫口死亡率
用DPS2000软件对数据进行新复极差法统计分析。
2 结果与分析
2.1 形态学及分子生物学鉴定
分离的菌株在PDA培养基上培养，其菌落为白色，绒毛状，有同心环，表面平坦无褶皱，有放射沟。在显微镜下，分生孢子为光滑无色的球形，确定该菌株属半知菌亚门Deuteromycotina丝孢纲Hyphomyceres丛梗孢目Moniliales丛梗孢科Moniliaceae白僵菌属Beauveria。
分离菌株的序列登陆GenBank检索表明，与该菌株序列同源性最高的菌株为球孢白僵菌，同源性为100 %。结合形态学鉴定结果，所分离菌株确定为球孢白僵菌Beauveria bassiana。
2.2 感病力测定结果
从表1中可以看出，从萤火虫僵虫上分离的菌株对于紫薇梨象成虫具有较好的感病效果。在施药后15 d，1× 106个孢子/mL和1×107个孢子/mL的孢子悬浮液的防效都达到60 %以上。因此，该菌株具有成为紫薇梨象成虫专用型生物农药的潜力。
3 讨论
紫薇是一种优良的庭院观赏树和绿化行道树，具有重要的观赏和经济价值[5]。紫薇梨象在2007年首次被发现对泰安市紫薇造成严重危害，随后在湖北、安徽等地相继有危害紫薇的报道[3-6]。该虫危害紫薇的整个发育时期，具有种群数量大、扩散快、危害的时间长等特点，大大降低了紫薇的观赏价值，并威胁到种实繁殖[7]。如何有效防治紫薇梨象成为森保科研工作者的重要课题。
白僵菌是一类寄主范围广、持效性良好，与环境友好，对人畜无害的生物农药[4]。而且白僵菌的工业化生产已经比较成熟，可以大批量生产用于生物防治。本研究分离的白僵菌菌株对紫薇梨象成虫具有较强的感病力，根据该虫的生物学特性，在林间喷洒白僵菌可以有效防治成虫，为其生物防治提供新途径。
参 考 文 献
[1]李艳，周光锋，于丽颖，等. 8种药剂对紫薇梨象成虫的室内毒力测定及室外药效试验[J]. 中国森林病虫，2013，32（4）：30-33.
[2]王菊英，周成刚，乔鲁芹，等. 严重危害紫薇的新害虫——紫薇梨象[J]. 中国森林病虫，2010，29（4）：18-20.
[3]查玉平，洪承昊，胡孜进，等.阿维菌素对紫薇梨象的室内毒力评价[J]. 湖北林业科技，2010，（6）：30-31.
[4]查玉平，陈京元，夏剑萍. 白僵菌防治森林害虫的研究与应用[J]. 湖北林业科技，2010，（3）：40-42，39.
[5]靳晓翠，范义荣. 紫薇种质资源概况及应用现状分析[J]. 河北农业科学，2009，13（1）：16-17，20.
[6]唐长贞，唐燕平，康克，等. 皖西南紫薇梨象生活史与危害特性研究[J]. 南京林业大学学报（自然科学版），2015，39（6）：177-180.
[7] 刘大川，周成刚，李艳，等. 紫薇梨象的危害与紫薇生长发育的关系[J]. 环境昆虫学报，2011，33（3）：302-307.
（责任编辑：郑京津）
