铜、锌对细菌耐药性有促进性作用
朱珏 黄逸强
降低动物对抗生素耐药性问题。不仅需要从减少抗生素的应用着手，还要更进一步考虑猪饲料中锌与铜应用（如种类及用量）的合理问题。
抗生素在猪日粮中的应用已长达几十年了。自19世纪50年代以来，抗生素的促生长作用就已经被广泛熟知。它不仅被用来治疗动物疾病，而且还被用于提高动物生产性能。
抑菌剂（主要是抗生素）的全球应用量很大。如，1994年，丹麦动物养殖生产中抗生素的用量高达200吨，而其中超过一半以上，是被添加到饲料中用于促进动物生长。近几年，随着药物耐药问题的出现，使得抗生素使用一度成为敏感话题，最终导致欧洲各国禁止在动物养殖生产中禁止使用抗生素。
除了抗生素，一些其他饲料添加剂同样具有抗菌和提高动物生产性能的作用，如在猪饲料中超剂量添加锌（特别是氧化锌）和铜（特别是硫酸铜）虽能够改善肠道健康，但它们对细菌耐药性有协同增效作用。
目前基本状况
众所周知，锌元素是许多生物体需求的基本元素。其具有提高猪生产性能的积极性作用早已被人们所熟知。缺锌会导致动物采食量下降、生长缓慢，且严重影响动物皮肤完整性（如角质化不全）。根据NRC猪营养饲养标准，根据猪的生长阶段及体重，锌需求量在50到100ppm之间。由于饲料中锌含量偏低（或者有效锌源含量不明确），需要额外供应补充锌。在欧洲，单胃动物额外补充锌用量最高是150ppm，但在一些国家，断奶仔猪上使用药理剂量锌源（如氧化锌）高达3000ppm。
与锌元素一样，铜也是许多生物机体所必需的微量元素。铜是许多动物体内酶的组成成分，并且也对动物生长有促进性作用。缺铜，动物机体会出现的症状包括：生长受阻、贫血、腿部畸形和发育不良等。虽然，猪对铜的需要量低（每公斤饲料干物质含铜量为4～10ppm），但饲料中还是会额外添加铜。在欧洲，仔猪饲料中铜的最大添加量为170ppm，其他生产阶段猪铜的用量为25ppm。
此外，高剂量添加铜源（硫酸铜）到饲料中，能够在动物肠道中对有害病菌起到有效抑制和杀灭效果。加上，畜牧养殖中药物使用，两者之间存存在协同性作用，使得病菌更容易产生耐药性。这种耐药性作用途径及方式主要有以下几种：
●膜蛋白转运低，从而降低细胞膜渗透压及通透性；
●产生酶，使药物失活；
●抗生素结合位点修饰性作用，使得细胞靶器官改变；
●通过外排泵，将有毒元素外排出体外；
1995年，在丹麦，一种名为阿伏帕星的糖肽类抗生素，被用于动物促生长作用。当时，有21%对阿伏帕星（E.faecium）有抗性作用的屎肠球菌从猪体内分离出来。丹麦发现这些具有耐药性细菌后，分别于1998年和1999年，在肥育猪和仔猪中禁止使用非医疗性抗生素。之后，于2006年，抗生素作为促生长剂被欧盟规定禁止使用。因为铜和锌能够调理肠道微生物，并且能降低断奶仔猪腹泻率功效，所以它们能够取代部分抗生素。过量锌和铜铜会对环境产生副作用，并且也类似于抗生素，能够使环境中的细菌产生耐铜、耐锌作用。为了研究抗生素与微量元素铜和锌的关系。我们就细菌对金属元素和抗生素的抗性作用，是否与金属元素和抗生素之间具有强相关性作用进行了研究。
交叉耐药性研究
耐药性临界值可以用交叉耐药性来诠释。这样就能解释单一基因型决定性因素导致了细菌对金属元素和抗生素的抗性作用。例如，细菌也许能够合成既能携带抗生素，又能携带金属元素的转运蛋白。在对锌产生耐锌细菌能够通过外排泵，将细胞内多余锌含量外排，降低细胞内锌含量，从而保障细胞内外压之间的恒定。同时，这种外排泵对锌或其他分子也有特异性位点的接受作用。因此，这就是具有抗锌作用细菌为什么能够对一种或多种抗生素具有耐药性作用的原因所在。
联合耐药性研究
耐药性临界值可以用联合耐药性来诠释。一般而言，通过转运因子（如质粒）能够使得不同耐药性基因发生在同一个遗传组分。一些文献研究中有涉及到金属元素-抗生素相关的质粒表达。例如，金黄色葡萄球菌（S.aureus）的对锌与甲氧西林抗性作用研究、屎肠杆菌（E.faecium）对铜与大环内酯和糖肽类抗性的相关性研究等，都表明了金属元素与抗生素联合使用能使受体细菌对它们产生耐性。
锌
在金黄色葡萄球菌（S.aureus）中，对比对镉与锌具有抗性作用的基因片段--czrC。从不同国家对猪菌株研究发现：易感锌菌株中发现存在czrC基因的仅有不到1%， 而95%czrC基因在对锌具有抗性作用菌株中被发现。另外，该研究发现对锌具有抗性作用菌株，同时也对甲氧西林有很强的抗性作用。对甲氧西林易感菌株，它们也都对氯化锌易感；而对甲氧西林具有耐受作用菌株，超过90%菌株也对氯化锌具有抗性作用，这说明对锌和甲氧西林抗性作用具有相关性。
另外一个试验表明：虽然丹麦猪体内并没有没有发现对甲氧西林易感菌株，但74%对甲氧西林具有抗性菌株，同样也对锌具有抗性作用。一般来讲，对这些具有抗性作用的菌株对锌的最低抑制浓度（MIC）是普通最低抑制浓度的4倍（对甲氧西林具有抗性作用的黄金色葡萄球菌的MIC是8mM，而对易感耐甲氧西林的黄金葡萄球菌的MIC仅2mM）。总之，选择对锌具有抗性作用的细菌，意味着其对药物也会有抗性作用（图1）。
在欧洲、加拿大和美国中西部地区出现过类似于对甲氧西林具有抗性作用的黄金葡萄球菌（MRSA），其主要作用基因片段名为克隆基因片段398，该基因片段是通过使用四环素和氧化锌协同性作用促进生成的。这种菌株于近期在澳大利亚和新西兰被发现。将该菌株（黄金葡萄球菌（MRSA）定植在猪鼻骨上，发现在使用氧化锌和四环素实验组猪对甲氧西林具的抗性作用的黄金葡萄球菌（MRSA）数量更高，且增殖速度非常快。在三周后，所有试验中含有阴性MRSA菌株的猪，最终也因为感染阳性MRSA猪而呈现阳性反应。
铜
在铜的应用上面也出现了类似现象。铜可以使细菌对大环内酯类和糖肽类抗生素的抗性作用增强。能获得对铜具有抗性作用的细菌一般是革兰氏阴性菌，而革兰氏阳性菌很少对铜有抗性作用。这跟tcrB基因（可转让的铜电阻同源CopB）有关。在对丹麦屎肠球菌（E.faecium）菌株研究中发现：这种基因出现与饲粮中铜水平有直接相关性。对铜有抗性作用菌株在猪菌株中很常见（49个菌株中有45个被发现）。同样也在禽的菌株中非常常见（10/29），而在牛（5/32）、羊（0/22）以及人（3/29）身上发现这种耐受性菌株很少。在猪上面出现如此高的耐受性菌株也能够解释为：因养殖过程中使用了高铜而造成。因此，超过一半以上的猪菌株对大环内酯类具有耐药性作用，并且几乎四分之一的菌株对糖肽类具有耐药性作用。
在这个研究中，所有对糖肽类具有耐受性菌株对大环内酯类和铜都耐受，并且对所有大环内酯类耐受性作用的菌株也对铜具有耐受性。其中仅有4株铜耐受菌株（组中低于10%）对抗生素易感。tcrB基因（可转让的铜电阻同源CopB）对铜有耐受性作用，而erm（B）对大环内酯类有抗性作用。这些都在猪菌株的同一质粒被发现。对糖肽类具有抗性作用基因也能物理性嫁接到tcrB基因上，而对其具有抗性作用。
另外，猪粪能够做肥料，这些抗生素能够通过粪便而转移到土壤中。有研究表明土壤中细菌对抗生素的耐药性和对铜的抗性作用有相关性作用。例如：在对铜耐受的细菌中出现对耐氨苄西林耐受性细菌出现率要比对铜易感的细菌要显著性高。因此，耐铜细菌出现频率是铜易感细菌的两倍。
这些具有抗性作用细菌能通过动物和环境之间，在动物中快速广泛的繁殖与分布。当铜和锌选择了这些具有抗性作用细菌，那么抗生素对他们的抑制及杀害作用会越来越小。这样，这些具有双重抗性作用细菌（对抗生素和金属元素都有抗性作用）在动物之间、动物与环境之间的繁殖、感染与传播水平感染与传播就这么发生了。
抗性的传播
此外，易感细菌也许能通过接触这些抗性细菌从而变得具有抗性。这是因为微生物之间可能存在着基因物质的交换。耐受基因一般存在于基因转运因子中，如质粒、转位子等，这些能够促成抗性作用通过水平感染而得以快速传播。细菌通过结合的方式也许能够接受其他细胞的质粒或转位子。此外，它们也能通过将外源基因转运方式嫁接到自己的基因组上。特别是DNA也许能够通过噬菌体将抗性基因从一个细菌转换到另外一个细菌上。之后，细菌开始通过细胞分裂将抗药性基因片段转运到它们的子细胞上。因此，高剂量应用铜和锌会创造出对金属元素和抗生素都具有抗性作用新一代细菌，这种抗性作用增强的细菌不仅会对动物健康造成威胁，还会通过水平与垂直传播，使土壤中产生大量具有抗性作用细菌，从而使得环境安全与人类健康受到威胁。因此应该要合理选择铜、锌种类及适宜的应用剂量，从而构建动物、人类、环境之间的和谐。
降低动物对抗生素耐药性问题。不仅需要从减少抗生素的应用着手，还要更进一步考虑猪饲料中锌与铜应用（如种类及用量）的合理问题。
抗生素在猪日粮中的应用已长达几十年了。自19世纪50年代以来，抗生素的促生长作用就已经被广泛熟知。它不仅被用来治疗动物疾病，而且还被用于提高动物生产性能。
抑菌剂（主要是抗生素）的全球应用量很大。如，1994年，丹麦动物养殖生产中抗生素的用量高达200吨，而其中超过一半以上，是被添加到饲料中用于促进动物生长。近几年，随着药物耐药问题的出现，使得抗生素使用一度成为敏感话题，最终导致欧洲各国禁止在动物养殖生产中禁止使用抗生素。
除了抗生素，一些其他饲料添加剂同样具有抗菌和提高动物生产性能的作用，如在猪饲料中超剂量添加锌（特别是氧化锌）和铜（特别是硫酸铜）虽能够改善肠道健康，但它们对细菌耐药性有协同增效作用。
目前基本状况
众所周知，锌元素是许多生物体需求的基本元素。其具有提高猪生产性能的积极性作用早已被人们所熟知。缺锌会导致动物采食量下降、生长缓慢，且严重影响动物皮肤完整性（如角质化不全）。根据NRC猪营养饲养标准，根据猪的生长阶段及体重，锌需求量在50到100ppm之间。由于饲料中锌含量偏低（或者有效锌源含量不明确），需要额外供应补充锌。在欧洲，单胃动物额外补充锌用量最高是150ppm，但在一些国家，断奶仔猪上使用药理剂量锌源（如氧化锌）高达3000ppm。
与锌元素一样，铜也是许多生物机体所必需的微量元素。铜是许多动物体内酶的组成成分，并且也对动物生长有促进性作用。缺铜，动物机体会出现的症状包括：生长受阻、贫血、腿部畸形和发育不良等。虽然，猪对铜的需要量低（每公斤饲料干物质含铜量为4～10ppm），但饲料中还是会额外添加铜。在欧洲，仔猪饲料中铜的最大添加量为170ppm，其他生产阶段猪铜的用量为25ppm。
此外，高剂量添加铜源（硫酸铜）到饲料中，能够在动物肠道中对有害病菌起到有效抑制和杀灭效果。加上，畜牧养殖中药物使用，两者之间存存在协同性作用，使得病菌更容易产生耐药性。这种耐药性作用途径及方式主要有以下几种：
●膜蛋白转运低，从而降低细胞膜渗透压及通透性；
●产生酶，使药物失活；
●抗生素结合位点修饰性作用，使得细胞靶器官改变；
●通过外排泵，将有毒元素外排出体外；
1995年，在丹麦，一种名为阿伏帕星的糖肽类抗生素，被用于动物促生长作用。当时，有21%对阿伏帕星（E.faecium）有抗性作用的屎肠球菌从猪体内分离出来。丹麦发现这些具有耐药性细菌后，分别于1998年和1999年，在肥育猪和仔猪中禁止使用非医疗性抗生素。之后，于2006年，抗生素作为促生长剂被欧盟规定禁止使用。因为铜和锌能够调理肠道微生物，并且能降低断奶仔猪腹泻率功效，所以它们能够取代部分抗生素。过量锌和铜铜会对环境产生副作用，并且也类似于抗生素，能够使环境中的细菌产生耐铜、耐锌作用。为了研究抗生素与微量元素铜和锌的关系。我们就细菌对金属元素和抗生素的抗性作用，是否与金属元素和抗生素之间具有强相关性作用进行了研究。
交叉耐药性研究
耐药性临界值可以用交叉耐药性来诠释。这样就能解释单一基因型决定性因素导致了细菌对金属元素和抗生素的抗性作用。例如，细菌也许能够合成既能携带抗生素，又能携带金属元素的转运蛋白。在对锌产生耐锌细菌能够通过外排泵，将细胞内多余锌含量外排，降低细胞内锌含量，从而保障细胞内外压之间的恒定。同时，这种外排泵对锌或其他分子也有特异性位点的接受作用。因此，这就是具有抗锌作用细菌为什么能够对一种或多种抗生素具有耐药性作用的原因所在。
联合耐药性研究
耐药性临界值可以用联合耐药性来诠释。一般而言，通过转运因子（如质粒）能够使得不同耐药性基因发生在同一个遗传组分。一些文献研究中有涉及到金属元素-抗生素相关的质粒表达。例如，金黄色葡萄球菌（S.aureus）的对锌与甲氧西林抗性作用研究、屎肠杆菌（E.faecium）对铜与大环内酯和糖肽类抗性的相关性研究等，都表明了金属元素与抗生素联合使用能使受体细菌对它们产生耐性。
锌
在金黄色葡萄球菌（S.aureus）中，对比对镉与锌具有抗性作用的基因片段--czrC。从不同国家对猪菌株研究发现：易感锌菌株中发现存在czrC基因的仅有不到1%， 而95%czrC基因在对锌具有抗性作用菌株中被发现。另外，该研究发现对锌具有抗性作用菌株，同时也对甲氧西林有很强的抗性作用。对甲氧西林易感菌株，它们也都对氯化锌易感；而对甲氧西林具有耐受作用菌株，超过90%菌株也对氯化锌具有抗性作用，这说明对锌和甲氧西林抗性作用具有相关性。
另外一个试验表明：虽然丹麦猪体内并没有没有发现对甲氧西林易感菌株，但74%对甲氧西林具有抗性菌株，同样也对锌具有抗性作用。一般来讲，对这些具有抗性作用的菌株对锌的最低抑制浓度（MIC）是普通最低抑制浓度的4倍（对甲氧西林具有抗性作用的黄金色葡萄球菌的MIC是8mM，而对易感耐甲氧西林的黄金葡萄球菌的MIC仅2mM）。总之，选择对锌具有抗性作用的细菌，意味着其对药物也会有抗性作用（图1）。
在欧洲、加拿大和美国中西部地区出现过类似于对甲氧西林具有抗性作用的黄金葡萄球菌（MRSA），其主要作用基因片段名为克隆基因片段398，该基因片段是通过使用四环素和氧化锌协同性作用促进生成的。这种菌株于近期在澳大利亚和新西兰被发现。将该菌株（黄金葡萄球菌（MRSA）定植在猪鼻骨上，发现在使用氧化锌和四环素实验组猪对甲氧西林具的抗性作用的黄金葡萄球菌（MRSA）数量更高，且增殖速度非常快。在三周后，所有试验中含有阴性MRSA菌株的猪，最终也因为感染阳性MRSA猪而呈现阳性反应。
铜
在铜的应用上面也出现了类似现象。铜可以使细菌对大环内酯类和糖肽类抗生素的抗性作用增强。能获得对铜具有抗性作用的细菌一般是革兰氏阴性菌，而革兰氏阳性菌很少对铜有抗性作用。这跟tcrB基因（可转让的铜电阻同源CopB）有关。在对丹麦屎肠球菌（E.faecium）菌株研究中发现：这种基因出现与饲粮中铜水平有直接相关性。对铜有抗性作用菌株在猪菌株中很常见（49个菌株中有45个被发现）。同样也在禽的菌株中非常常见（10/29），而在牛（5/32）、羊（0/22）以及人（3/29）身上发现这种耐受性菌株很少。在猪上面出现如此高的耐受性菌株也能够解释为：因养殖过程中使用了高铜而造成。因此，超过一半以上的猪菌株对大环内酯类具有耐药性作用，并且几乎四分之一的菌株对糖肽类具有耐药性作用。
在这个研究中，所有对糖肽类具有耐受性菌株对大环内酯类和铜都耐受，并且对所有大环内酯类耐受性作用的菌株也对铜具有耐受性。其中仅有4株铜耐受菌株（组中低于10%）对抗生素易感。tcrB基因（可转让的铜电阻同源CopB）对铜有耐受性作用，而erm（B）对大环内酯类有抗性作用。这些都在猪菌株的同一质粒被发现。对糖肽类具有抗性作用基因也能物理性嫁接到tcrB基因上，而对其具有抗性作用。
另外，猪粪能够做肥料，这些抗生素能够通过粪便而转移到土壤中。有研究表明土壤中细菌对抗生素的耐药性和对铜的抗性作用有相关性作用。例如：在对铜耐受的细菌中出现对耐氨苄西林耐受性细菌出现率要比对铜易感的细菌要显著性高。因此，耐铜细菌出现频率是铜易感细菌的两倍。
这些具有抗性作用细菌能通过动物和环境之间，在动物中快速广泛的繁殖与分布。当铜和锌选择了这些具有抗性作用细菌，那么抗生素对他们的抑制及杀害作用会越来越小。这样，这些具有双重抗性作用细菌（对抗生素和金属元素都有抗性作用）在动物之间、动物与环境之间的繁殖、感染与传播水平感染与传播就这么发生了。
抗性的传播
此外，易感细菌也许能通过接触这些抗性细菌从而变得具有抗性。这是因为微生物之间可能存在着基因物质的交换。耐受基因一般存在于基因转运因子中，如质粒、转位子等，这些能够促成抗性作用通过水平感染而得以快速传播。细菌通过结合的方式也许能够接受其他细胞的质粒或转位子。此外，它们也能通过将外源基因转运方式嫁接到自己的基因组上。特别是DNA也许能够通过噬菌体将抗性基因从一个细菌转换到另外一个细菌上。之后，细菌开始通过细胞分裂将抗药性基因片段转运到它们的子细胞上。因此，高剂量应用铜和锌会创造出对金属元素和抗生素都具有抗性作用新一代细菌，这种抗性作用增强的细菌不仅会对动物健康造成威胁，还会通过水平与垂直传播，使土壤中产生大量具有抗性作用细菌，从而使得环境安全与人类健康受到威胁。因此应该要合理选择铜、锌种类及适宜的应用剂量，从而构建动物、人类、环境之间的和谐。
