姜黄素联合PDTC体外抗白血病K562细胞的作用研究
高荧+于宜平+苗久旺
摘要：目的探讨姜黄素联合PDTC体外抗K562细胞的作用。方法MTT法检测姜黄素单独或联用PDTC后对K562细胞增殖活性的影响；Hoechst33342染色法观察细胞凋亡形态；Western blot法检测Cleaved Caspase 3的表达活性。结果10 μmol·L-1姜黃素联合25 μmol·L-1的PDTC后，可显著提高对K562细胞增殖的抑制活性，并显示出诱导细胞凋亡的形态学特征，使细胞Cleaved Caspase 3表达增加。结论姜黄素联合PDTC可增强抗K562细胞作用，机制与诱导K562细胞凋亡作用有关。
关键词：姜黄素；吡咯烷二硫代氨基甲酸盐；细胞凋亡；Caspase 3
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2018）01-0072-03
【Abstract】Objective： To study the effect of curcumin combined with PDTC on anti- leukemia K562 cells in vitro. Methods： MTT assay was used to detect the effect of curcumin alone or in combination with PDTC on the proliferation of K562 cells. The morphology of apoptotic cells was observed by Hoechst33342 staining. The expression activity of Cleaved Caspase 3 was detected by Western blot. Results： After treated with 10 μmol·L-1 curcumin and 25 μmol·L-1 PDTC， the inhibitory activity on proliferation of K562 cells significantly increased， and the morphological characteristics of abduction apoptosis were also proved. The expression of Cleaved Caspase 3 increased. Conclusion： Curcumin combined with PDTC can enhance the anti-K562 cells and its mechanism is related to the abduction apoptosis of K562 cells.
【Key words】curcumin，pyrrolidine dithiocarbamate，apoptosis， Caspase 3
核因子-kappaB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）与肿瘤细胞的增殖、凋亡有密切关系[1]。研究表明，吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）特异性抑制NF-κB后，对人白血病K562细胞的增殖有抑制作用、并可诱导凋亡，还可逆转肿瘤耐药[2]。姜黄素及其类似物抗K562细胞作用明确、且呈多靶点性，但存在不稳定、易降解、体内吸收差、低浓度下抑制活性较弱的缺点[3，4]。采用高效低毒的中药活性成分与肿瘤化疗药联合应用以减少化疗药的用量、提高化疗效果、降低药物不良反应，是抗肿瘤药物研究的重要方向。本文旨在采用低浓度的姜黄素联合PDTC作用于白血病K562细胞，初步探讨姜黄素联合PDTC对抗K562细胞作用的影响，为治疗慢性粒细胞白血病的药物研究提供参考。
1材料与方法
1.1材料人白血病K562细胞（中国科学院上海细胞库）；姜黄素（sigma公司）；优等胎牛血清、RPMI1640培养基（Hyclone，Thermo公司）；MTT试剂盒（南京凯基生物公司）；Hoechst33342（sigma公司）；Cleaved Caspase 3（沈阳万类生物科技有限公司）；PDTC、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF、ECL增强型化学发光试剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Actin、HRP（碧云天生物技术有限公司）。主要仪器有Multiscan MK 3-酶标仪（Thermo公司）、IX51-倒置荧光显微镜（Olympus公司）、ImageQuant LAS 4000凝胶成像系统（GE公司）。
1.2细胞培养将K562细胞培养于RPMI1640培养液（含10% 胎牛血清）中，于37℃、5% CO2恒温培养箱内培养，长至对数生长期用于各实验。
1.3MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞接种于96孔板，调整细胞浓度为5×103个/mL。隔夜后，加入终浓度为0、1、5、10、30、50 μmol·L-1的姜黄素，及10 μmol·L-1的姜黄素与15、25 μmol·L-1PDTC单用或联用，空白组加入等体积不含药物及细胞的培养基，每组均设置三个复孔。培养48 h后，每孔加入5 mg·mL-1的 MTT溶液10 μL，继续培养3 h，加入100 μL SDS三联液（10%SDS-5%异丁醇-0.012 mol·L-1 HCL），同时各组设置加药但未加MTT对照孔，12h后，570 nm波长处检测吸光度（A）值。按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率=[（空白组A值-药物组A值）/空白组A值]×100%[5]。
1.4Hoechst33342染色法观察细胞凋亡形态取对数生长期细胞，采用不同浓度药物处理后，加入Hoechst 33342（5 μg·mL-1）染色液30 μL，于37℃避光孵育20 min，PBS洗涤2次，调整细胞数后，取适量转入96孔板，于倒置荧光显微镜下观察细胞形态。
1.5Western blot方法检测Cleaved Caspase 3的表达活性取对数生长期细胞，加药后培养48 h，收集细胞，以PBS洗涤细胞2次，加入RIPA裂解液（含1 mmol·L-1的PMSF）冰上
裂解10 min。13000 r·min-1离心10 min，吸取上清，得到细胞总蛋白。用BCA法进行蛋白定量，取30 μg蛋白与上样缓冲液混合，95℃变性5 min。12% SDS-PAGE凝胶中电泳，转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗后4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗室温孵育50 min，TBST洗涤3次，每次10 min，加入ECL增强型化学发光试剂，置于凝胶成像系统成中成像[6]。
1.6统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计分析，所有数据以形式表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为有统计意义。
2结果
2.1姜黄素联合PDTC可增强对K562细胞增殖的抑制作用K562细胞经不同浓度姜黄素作用后，剂量依赖性抑制细胞增殖。但姜黄素低于10 μmol·L-1时对K562细胞增殖的抑制活性均较弱（图1）。采用10 μmol·L-1姜黄素与15、25 μmol·L-1的PDTC联用后，可增强对K562细胞增值的抑制作用，其中10 μmol·L-1姜黄素与25 μmol·L-1的PDTC联用比PDTC单用对K562细胞的抑制活性有统计学意义（P<0.01）。
2.2姜黄素联合PDTC可增强诱导K562细胞凋亡作用不同浓度药物作用于K562细胞48 h后，形态学观察发现，空白组细胞核荧光均匀、形态基本完整；10 μmol·L-1姜黄素组有少量细胞核荧光增强，表现出较弱的凋亡特征；25 μmol·L-1 PDTC组部分细胞核表现出亮蓝色荧光，细胞核浓缩，呈现出凋亡特征；联合用药组细胞核浓缩、破碎，并出现凋亡小体，凋亡现象明显，提示姜黄素联合PDTC可增强诱导K562细胞凋亡作用（图2）。
2.3姜黄素联合PDTC可增强诱导K562细胞的Caspases 3活化作用药物作用于K562细胞48 h后，空白组及10 μmol·L-1姜黄素组诱导K562细胞Cleaved Caspase 3的表达较弱，与25 μmol·L-1PDTC联合后作用增强，提示姜黄素联合PDTC可增强诱导K562细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase 3活性表达（图3）。
3讨论
慢性粒细胞白血病为恶性骨髓增殖性疾病，其发病率为1.6/10万～2/10万，占白血病发病总数的15%[7]。化学治疗是慢性粒细胞白血病的治疗方法之一，但化疗药物常存在不良反应大、耐药等问题。NF-κB是细胞中重要的信号传导因子，可通过基因调控发挥生物学功能，包括调节细胞的凋亡、参与免疫炎症反应以及肿瘤的发生发展等[8]。NF-κB被抑制后，可通过调控线粒体膜蛋白如bcl-2等，继而激活Caspases诱导细胞凋亡。文献研究表明，NF-κB抑制剂PDTC具有抗K562细胞作用、可逆转化疗药对K562细胞耐药，诱导细胞凋亡是其作用机制之一。
姜黄素是一种具有良好应用前景的天然多酚类物质，抗肿瘤作用广泛，而诱导细胞凋亡是其重要机制。姜黄素可通过重塑多种分子靶点诱导细胞凋亡，包括上调死亡受体4/5、活化Caspase 3、促进细胞色素c的释放、抑制Bcl-2蛋白及c-Myc表达等[9]。但稳定性差、水溶性差且口服给药生物利用度较低等缺点，限制姜黄素抗肿瘤药效的发挥。将姜黄素与其他药物联合应用，作为恶性肿瘤治疗的辅助用药，用以增强化疗药的抗肿瘤效果、降低化疗药的毒副作用，是姜黄素临床应用开发研究的一个重要研究方向。研究表明，姜黄素可通过下调Bcl-2表达、活化Caspase 3等机制诱导K562细胞凋亡[10]。姜黄素联合黄连素作用于K562细胞，两者联用对细胞增殖的抑制具有协同作用[11]。姜黄素亦可与三氧化二砷或氯尼达明联合，降低线粒体膜电位，释放凋亡活性物质，激活线粒体凋亡途径从而诱导K562细胞凋亡[12]。已有研究将PDTC与姜黄素联用，PDTC可显著增强姜黄素对肾癌ACHN细胞的放射增敏作用[13]。
本研究采用姜黄素和PDTC联合用药，联合用药组对K562细胞的增殖抑制作用优于姜黄素组和PDTC组，且10 μmol·L-1姜黄素与25 μmol·L-1的PDTC联合后作用比较明显，有显著性差异，提示姜黄素联合PDTC可增强抗K562细胞作用效果，从诱导細胞凋亡的形态学及凋亡相关蛋白Cleaved Caspase 3的表达方面证实两者协同诱导K562细胞凋亡为其增效机制。
参考文献：
[1]黄培林，朱世能，陆世伦.NF-κB、IκB与肿瘤细胞凋亡[J].实用癌症杂志，2001，16（1）：103-104+107.
[2]杨婷婷，薛天阳，许伟.NF-κB抑制剂PDTC逆转K562/AO_2细胞耐药性及其机制的研究[J].中国实验血液学杂志，2010，18（4）：903-908.
[3]苗久旺，张钦德，王洪波，等.双去甲氧基姜黄素通过降低线粒体膜电位诱导人白血病K562细胞凋亡[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（24）：109-113.
[4]Hatcher H，Planalp R，Cho J，et al.Curcumin：from ancient medicine to current clinical trials[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2008，65（11）：1-22.
[5]苗久旺，张忠泉，张亚宏，等.新型氮芥衍生物XHH诱导K562细胞凋亡的研究[J].华西药学杂志，2012，27（01）：005-008.
[6]Li YB，Gao JL，Zhong ZF，et al.Bisdemethoxycurcumin suppresses MCF-7 cells proliferation by inducing ROS accumulation and modulating senescence-related pathways[J].Pharmacological Reports，2013，65（3）：700-709.
[7]中華医学会血液学分会.中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南（2016年版）[J].中华血液学杂志，2016，37（8）：633-639.
[8]Karin M.Nuclear factor-κB in cancer development and progression[J].Nature，2006，441（7092）：431-436.
[9]Roxas M.Curcumin as “Curecumin”：from kitchen to clinic[J].Biochemical Pharmacology，2008，75（4）：787-809.
[10]Jia YL，Li J，Qin ZH，et al.Autophagic and apoptotic mechanisms of curcumin-induced death in K562 cells[J].Journal of Asian Natural Products Research，2009，11（11）：918-928.
[11]Balakrishna A，Kumar M H.Evaluation of synergetic anticancer activity of berberine and curcumin on different models of A549，Hep-G2，MCF-7，Jurkat，and K562 cell lines[J].BioMed Research International 2015，2015（4）：1-7.
[12]Sánchez Y，Simón G P，Calvio E，et al.Curcumin stimulates reactive oxygen species production and potentiates apoptosis induction by the antitumor drugs arsenic trioxide and lonidamine in human myeloid leukemia cell lines[J].Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics，2010，335（1）：114-123.
[13]Li G，Wang Z，Chong T，et al.Curcumin enhances the radiosensitivity of renal cancer cells by suppressing NF-κB signaling pathway[J].Biomedicine & pharmacotherapy，2017，94：974-981.
（收稿日期：2017-10-27）
摘要：目的探讨姜黄素联合PDTC体外抗K562细胞的作用。方法MTT法检测姜黄素单独或联用PDTC后对K562细胞增殖活性的影响；Hoechst33342染色法观察细胞凋亡形态；Western blot法检测Cleaved Caspase 3的表达活性。结果10 μmol·L-1姜黃素联合25 μmol·L-1的PDTC后，可显著提高对K562细胞增殖的抑制活性，并显示出诱导细胞凋亡的形态学特征，使细胞Cleaved Caspase 3表达增加。结论姜黄素联合PDTC可增强抗K562细胞作用，机制与诱导K562细胞凋亡作用有关。
关键词：姜黄素；吡咯烷二硫代氨基甲酸盐；细胞凋亡；Caspase 3
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2018）01-0072-03
【Abstract】Objective： To study the effect of curcumin combined with PDTC on anti- leukemia K562 cells in vitro. Methods： MTT assay was used to detect the effect of curcumin alone or in combination with PDTC on the proliferation of K562 cells. The morphology of apoptotic cells was observed by Hoechst33342 staining. The expression activity of Cleaved Caspase 3 was detected by Western blot. Results： After treated with 10 μmol·L-1 curcumin and 25 μmol·L-1 PDTC， the inhibitory activity on proliferation of K562 cells significantly increased， and the morphological characteristics of abduction apoptosis were also proved. The expression of Cleaved Caspase 3 increased. Conclusion： Curcumin combined with PDTC can enhance the anti-K562 cells and its mechanism is related to the abduction apoptosis of K562 cells.
【Key words】curcumin，pyrrolidine dithiocarbamate，apoptosis， Caspase 3
核因子-kappaB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）与肿瘤细胞的增殖、凋亡有密切关系[1]。研究表明，吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）特异性抑制NF-κB后，对人白血病K562细胞的增殖有抑制作用、并可诱导凋亡，还可逆转肿瘤耐药[2]。姜黄素及其类似物抗K562细胞作用明确、且呈多靶点性，但存在不稳定、易降解、体内吸收差、低浓度下抑制活性较弱的缺点[3，4]。采用高效低毒的中药活性成分与肿瘤化疗药联合应用以减少化疗药的用量、提高化疗效果、降低药物不良反应，是抗肿瘤药物研究的重要方向。本文旨在采用低浓度的姜黄素联合PDTC作用于白血病K562细胞，初步探讨姜黄素联合PDTC对抗K562细胞作用的影响，为治疗慢性粒细胞白血病的药物研究提供参考。
1材料与方法
1.1材料人白血病K562细胞（中国科学院上海细胞库）；姜黄素（sigma公司）；优等胎牛血清、RPMI1640培养基（Hyclone，Thermo公司）；MTT试剂盒（南京凯基生物公司）；Hoechst33342（sigma公司）；Cleaved Caspase 3（沈阳万类生物科技有限公司）；PDTC、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF、ECL增强型化学发光试剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Actin、HRP（碧云天生物技术有限公司）。主要仪器有Multiscan MK 3-酶标仪（Thermo公司）、IX51-倒置荧光显微镜（Olympus公司）、ImageQuant LAS 4000凝胶成像系统（GE公司）。
1.2细胞培养将K562细胞培养于RPMI1640培养液（含10% 胎牛血清）中，于37℃、5% CO2恒温培养箱内培养，长至对数生长期用于各实验。
1.3MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞接种于96孔板，调整细胞浓度为5×103个/mL。隔夜后，加入终浓度为0、1、5、10、30、50 μmol·L-1的姜黄素，及10 μmol·L-1的姜黄素与15、25 μmol·L-1PDTC单用或联用，空白组加入等体积不含药物及细胞的培养基，每组均设置三个复孔。培养48 h后，每孔加入5 mg·mL-1的 MTT溶液10 μL，继续培养3 h，加入100 μL SDS三联液（10%SDS-5%异丁醇-0.012 mol·L-1 HCL），同时各组设置加药但未加MTT对照孔，12h后，570 nm波长处检测吸光度（A）值。按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率=[（空白组A值-药物组A值）/空白组A值]×100%[5]。
1.4Hoechst33342染色法观察细胞凋亡形态取对数生长期细胞，采用不同浓度药物处理后，加入Hoechst 33342（5 μg·mL-1）染色液30 μL，于37℃避光孵育20 min，PBS洗涤2次，调整细胞数后，取适量转入96孔板，于倒置荧光显微镜下观察细胞形态。
1.5Western blot方法检测Cleaved Caspase 3的表达活性取对数生长期细胞，加药后培养48 h，收集细胞，以PBS洗涤细胞2次，加入RIPA裂解液（含1 mmol·L-1的PMSF）冰上
裂解10 min。13000 r·min-1离心10 min，吸取上清，得到细胞总蛋白。用BCA法进行蛋白定量，取30 μg蛋白与上样缓冲液混合，95℃变性5 min。12% SDS-PAGE凝胶中电泳，转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗后4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗室温孵育50 min，TBST洗涤3次，每次10 min，加入ECL增强型化学发光试剂，置于凝胶成像系统成中成像[6]。
1.6统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计分析，所有数据以形式表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为有统计意义。
2结果
2.1姜黄素联合PDTC可增强对K562细胞增殖的抑制作用K562细胞经不同浓度姜黄素作用后，剂量依赖性抑制细胞增殖。但姜黄素低于10 μmol·L-1时对K562细胞增殖的抑制活性均较弱（图1）。采用10 μmol·L-1姜黄素与15、25 μmol·L-1的PDTC联用后，可增强对K562细胞增值的抑制作用，其中10 μmol·L-1姜黄素与25 μmol·L-1的PDTC联用比PDTC单用对K562细胞的抑制活性有统计学意义（P<0.01）。
2.2姜黄素联合PDTC可增强诱导K562细胞凋亡作用不同浓度药物作用于K562细胞48 h后，形态学观察发现，空白组细胞核荧光均匀、形态基本完整；10 μmol·L-1姜黄素组有少量细胞核荧光增强，表现出较弱的凋亡特征；25 μmol·L-1 PDTC组部分细胞核表现出亮蓝色荧光，细胞核浓缩，呈现出凋亡特征；联合用药组细胞核浓缩、破碎，并出现凋亡小体，凋亡现象明显，提示姜黄素联合PDTC可增强诱导K562细胞凋亡作用（图2）。
2.3姜黄素联合PDTC可增强诱导K562细胞的Caspases 3活化作用药物作用于K562细胞48 h后，空白组及10 μmol·L-1姜黄素组诱导K562细胞Cleaved Caspase 3的表达较弱，与25 μmol·L-1PDTC联合后作用增强，提示姜黄素联合PDTC可增强诱导K562细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase 3活性表达（图3）。
3讨论
慢性粒细胞白血病为恶性骨髓增殖性疾病，其发病率为1.6/10万～2/10万，占白血病发病总数的15%[7]。化学治疗是慢性粒细胞白血病的治疗方法之一，但化疗药物常存在不良反应大、耐药等问题。NF-κB是细胞中重要的信号传导因子，可通过基因调控发挥生物学功能，包括调节细胞的凋亡、参与免疫炎症反应以及肿瘤的发生发展等[8]。NF-κB被抑制后，可通过调控线粒体膜蛋白如bcl-2等，继而激活Caspases诱导细胞凋亡。文献研究表明，NF-κB抑制剂PDTC具有抗K562细胞作用、可逆转化疗药对K562细胞耐药，诱导细胞凋亡是其作用机制之一。
姜黄素是一种具有良好应用前景的天然多酚类物质，抗肿瘤作用广泛，而诱导细胞凋亡是其重要机制。姜黄素可通过重塑多种分子靶点诱导细胞凋亡，包括上调死亡受体4/5、活化Caspase 3、促进细胞色素c的释放、抑制Bcl-2蛋白及c-Myc表达等[9]。但稳定性差、水溶性差且口服给药生物利用度较低等缺点，限制姜黄素抗肿瘤药效的发挥。将姜黄素与其他药物联合应用，作为恶性肿瘤治疗的辅助用药，用以增强化疗药的抗肿瘤效果、降低化疗药的毒副作用，是姜黄素临床应用开发研究的一个重要研究方向。研究表明，姜黄素可通过下调Bcl-2表达、活化Caspase 3等机制诱导K562细胞凋亡[10]。姜黄素联合黄连素作用于K562细胞，两者联用对细胞增殖的抑制具有协同作用[11]。姜黄素亦可与三氧化二砷或氯尼达明联合，降低线粒体膜电位，释放凋亡活性物质，激活线粒体凋亡途径从而诱导K562细胞凋亡[12]。已有研究将PDTC与姜黄素联用，PDTC可显著增强姜黄素对肾癌ACHN细胞的放射增敏作用[13]。
本研究采用姜黄素和PDTC联合用药，联合用药组对K562细胞的增殖抑制作用优于姜黄素组和PDTC组，且10 μmol·L-1姜黄素与25 μmol·L-1的PDTC联合后作用比较明显，有显著性差异，提示姜黄素联合PDTC可增强抗K562细胞作用效果，从诱导細胞凋亡的形态学及凋亡相关蛋白Cleaved Caspase 3的表达方面证实两者协同诱导K562细胞凋亡为其增效机制。
参考文献：
[1]黄培林，朱世能，陆世伦.NF-κB、IκB与肿瘤细胞凋亡[J].实用癌症杂志，2001，16（1）：103-104+107.
[2]杨婷婷，薛天阳，许伟.NF-κB抑制剂PDTC逆转K562/AO_2细胞耐药性及其机制的研究[J].中国实验血液学杂志，2010，18（4）：903-908.
[3]苗久旺，张钦德，王洪波，等.双去甲氧基姜黄素通过降低线粒体膜电位诱导人白血病K562细胞凋亡[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（24）：109-113.
[4]Hatcher H，Planalp R，Cho J，et al.Curcumin：from ancient medicine to current clinical trials[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2008，65（11）：1-22.
[5]苗久旺，张忠泉，张亚宏，等.新型氮芥衍生物XHH诱导K562细胞凋亡的研究[J].华西药学杂志，2012，27（01）：005-008.
[6]Li YB，Gao JL，Zhong ZF，et al.Bisdemethoxycurcumin suppresses MCF-7 cells proliferation by inducing ROS accumulation and modulating senescence-related pathways[J].Pharmacological Reports，2013，65（3）：700-709.
[7]中華医学会血液学分会.中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南（2016年版）[J].中华血液学杂志，2016，37（8）：633-639.
[8]Karin M.Nuclear factor-κB in cancer development and progression[J].Nature，2006，441（7092）：431-436.
[9]Roxas M.Curcumin as “Curecumin”：from kitchen to clinic[J].Biochemical Pharmacology，2008，75（4）：787-809.
[10]Jia YL，Li J，Qin ZH，et al.Autophagic and apoptotic mechanisms of curcumin-induced death in K562 cells[J].Journal of Asian Natural Products Research，2009，11（11）：918-928.
[11]Balakrishna A，Kumar M H.Evaluation of synergetic anticancer activity of berberine and curcumin on different models of A549，Hep-G2，MCF-7，Jurkat，and K562 cell lines[J].BioMed Research International 2015，2015（4）：1-7.
[12]Sánchez Y，Simón G P，Calvio E，et al.Curcumin stimulates reactive oxygen species production and potentiates apoptosis induction by the antitumor drugs arsenic trioxide and lonidamine in human myeloid leukemia cell lines[J].Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics，2010，335（1）：114-123.
[13]Li G，Wang Z，Chong T，et al.Curcumin enhances the radiosensitivity of renal cancer cells by suppressing NF-κB signaling pathway[J].Biomedicine & pharmacotherapy，2017，94：974-981.
（收稿日期：2017-10-27）
