葛黄颗粒乙醇渗漉工艺研究
陈玉兰+魏嵋+蒲清荣
摘要：目的优选葛黄颗粒乙醇渗漉工艺。方法以乙醇提取物中有效成分鸢尾苷含量为指标，通过单因素试验比较乙醇渗漉法、乙醇超声法和乙醇回流法，确定葛黄颗粒中醇提药材的提取方法；运用高效液相色谱法，使用正交设计法，优选葛黄颗粒乙醇提取工艺。结果采用乙醇渗漉法提取，最佳工艺为：8倍量60%乙醇，浸泡12h，流速为1mL·min-1。结论采用该渗漉工艺提取，葛黄颗粒乙醇提取物中鸢尾苷的收率较高且稳定。
关键词：渗漉；正交设计；鸢尾苷；高效液相色谱法；葛黄颗粒
中图分类号：R283文献标志码：A文章编号：1007-2349（2018）01-0069-03
【Abstract】Objective： To optimize the process of ethanol percolation in Gehuang Granule. Methods： By taking the content of tectoridin in the ethanol extract as an index and by single factor test， ethanol percolation method， ethanol ultrasonic method and ethanol reflux method were compared to determine the extraction method of alcohol extraction medicinal material in Gezhong granule. By using HPLC and orthogonal design method， the ethanol extraction process of Gezhong Granule was optimized . Results： The best extraction process was ethanol percolation method. The optimum conditions were as follows， 8 times the amount of 60% ethanol， soaking for 12 hours， with 1mL·min-1 of flow rate. Conclusion： According to the percolation process， the yield of tectoridin of ethanol percolation in Gehuang Granule is high and stable.
【Key words】percolation， orthogonal design， tectoridin， HPLC， Gehuang Granules
葛黄颗粒是本院自制的复方中药制剂，具有醒酒解毒、健脾疏肝、清热利湿之功效。处方中有葛花、丹参，主要成分为鸢尾苷、丹参酮ⅡA等脂溶性成分。现代药理研究表明，葛花中所含的鸢尾苷等异黄酮类化合物具有解酒保肝的作用，可使血中乙醇、乙醛浓度下降，以及降低血尿素氮的升高，从而起到解酒作用。鸢尾苷等异黄酮类成分易溶于乙醇。为最大限度地提取方中有效成分，充分发挥解酒、保肝的功效，本实验以鸢尾苷含量为指标，通过单因素试验比较乙醇渗漉法、乙醇超声法和乙醇回流法对葛黄颗粒中有效成分含量的影响，筛选最佳提取方法，并通过正交设计优选最佳乙醇渗漉工艺。
1材料
仪器与材料：HH—S8水浴锅；JA203H天平；AUW120D精密天平；JPCT0328超声机；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-20A紫外可见检测器，LCsolution色谱工作站。鸢尾苷对照品（中国食品药品检定研究院提供，供鉴别用，批号：111632-200602，供含量测定用）。葛花、丹参均购于泸州市宝光中药饮片公司，经西南医科大学庄诚教授鉴定，均符合《中国药典》2015年版相关项下要求。乙腈、甲醇為色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件及系统适用性试验色谱柱：Wonda Sil C18-WR（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸水（20∶80）；流速：1 mL·min-1，检测波长：265 nm，柱温：40℃，理论塔板数按鸢尾苷计算应不低于4000。
2.2对照品溶液的制备精密称取鸢尾苷对照品1.24 mg，置10 mL棕色量瓶中，加入甲醇超声溶解并定容，即得对照品溶液。
2.3标准曲线的制备依次精密吸取鸢尾苷对照品溶液2.5、5、10、15、20 μL注入液相色谱仪，测定。以峰面积（A）为纵坐标（Y），进样量（mg）为横坐标（X），绘制标准曲线，得到回归方程：Y=4537.6X-5486，r=0.9998（n=5）。见表1和图1～3。
2.4提取方法比较取葛花、丹参粉碎成粗颗粒（过20目筛），各精密称取单倍处方量3份，混匀。
2.4.1乙醇渗漉法取1份粗颗粒，加适量60%乙醇浸润30 min，取脱脂棉一团垫在渗漉筒底部铺平，装筒，加入20倍量60%乙醇，加盖密闭24 h，以1～3 mL·min-1流速进行渗漉，收集渗漉液，减压浓缩至适量，恒温干燥，得提取物1。
2.4.2乙醇超声法取1份粗颗粒，置烧瓶中，加入20倍量60%乙醇浸泡30 min，超声提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量，恒温干燥，得提取物2。
2.4.3乙醇回流法取1份粗颗粒，置磨口烧瓶中，加20倍量60%乙醇浸泡30 min，加热回流提取2次，每次1 h，放冷，滤过，收集滤液减压浓缩至适量，恒温干燥，得提取物3。
2.5供试品溶液的制备分别取提取物各0.25 g，精密称定，加入75%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声提取40 min，取出，放冷，补足重量，滤过，取续滤液，过0.45 μm滤膜，滤过，即得。
2.6提取方法比较结果按2.1项下色谱条件测定含量，结果发现鸢尾苷提取量依次为15.10，13.22，10.06 mg·g-1，即乙醇渗漉法提取的鸢尾苷含量最高。
2.7正交试验样品的制备选择乙醇浓度、浸泡时间、乙醇用量、流速为因素，选用L9（34）因素水平表安排正交试验。各因素水平见表2。按单倍量处方药材的配比，准确称取9份样品，按表2中9种工艺条件组合进行渗漉提取，提取液浓缩成稠膏备用。
2.9方法学考察
2.9.1精密度试验精密吸取对照品溶液，连续重复进样5次，每次进样10 μL进行测定，结果RSD为1.59%（n=5）。表明该方法、该仪器测定鸢尾苷精密度符合要求。
2.9.2稳定性试验精密吸取对照品溶液10 μL，分别在0，2，4，8，10h进样，测定各峰面积，其积分面积RSD为0.58%（n=5）。表明鸢尾苷用该方法在该仪器上10 h内测定结果较稳定，符合要求。
2.9.3重现性试验取1号样品干浸膏，依法重复提取并测定5次，结果1号浸膏的含量平均值为16.0304 mg·g-1，RSD为2.24%（n=5），表明该方法重现性试验符合要求。
2.9.4 加样回收率试验 精密称取1号样品0.075g共6份，分别精密加入一定量的鸢尾苷对照品溶液（精密称取鸢尾苷对照品10.20 mg于25 mL量瓶中，加75%乙醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为0.408 mg·mL-1的对照品溶液）3 mL至样品中，再精密吸取22 mL 75%乙醇，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，各取10 μL进样测定，计算加样回收率。结果见表3。鸢尾苷平均回收率为102.53 %，RSD为2.55 %，表明本方法准确可靠。
2.10样品的测定取正交试验干浸膏，按2.5项下制备供试品溶液。按上述色谱条件，进样10μL，测定峰面积，计算含量。根据各因素对提取工艺影响的贡献大小给予不同的权重系数：干浸膏得率为20%，鸢尾苷含量为80%，再进行加权求和：综合评分=（干浸膏收率/干浸膏收率最大值）×20%+（鸢尾苷含量/鸢尾苷含量最大值）*80%。正交试验结果见表4及表5。
由表4和表5可以看出因素A，即乙醇浓度对鸢尾苷含量有显著影响（P<0.05），影响因素大小顺序为 A>D>B>C，及乙醇浓度>流速>浸泡时间>乙醇用量。优选的工艺为 A2B1C3D1。乙醇用量影响不大，为节约成本，乙醇用量选择为8倍量，即最佳提取工艺为：处方药材加8 倍量60%乙醇，浸泡 12h，渗漉速度为 1 mL·min-1。
2.12验证试验由于葛黄颗粒醇提工艺的最佳方案没有在正交试验因素表内，因此课题组对最佳醇提工艺进行了6次验证。结果见表6。根据药材含量，计算鸢尾苷提取率为：71.4119%。
3讨论
葛黄解酒颗粒处方来源于名老中医经验方，该制剂药味较多，葛花、丹参的主要有效成分为醇溶性成分，为配合工业化生产的需要，故采用乙醇提取。本文通过粗略比较3种不同的乙醇提取方法，结果渗漉法提取工艺既具有较高的提取率，又能为大生产节约生产成本。
参考文献：
[1]张蓉蓉，吴大正.野葛解酒机制的研究进展[J].上海中医药大学学报，2007，21（2）：80-82.
[2]姚美村，廖祎婷，袁月梅，等.不同葛花提取物对乙醇致小鼠肝损伤保护作用的比较研究[J].时珍国医国药，2011，22（4）：883-885.
[3]曾明，邸晓辉.葛根及葛花对酒精代谢的研究[J].医药论坛杂志，2010，31（23）：203-205.
[4]尹俊亭，仲英，孙敬勇，等.葛花化学成分的研究（Ⅰ）[J].中草药，2006，37（3）：350-351.
[5]华卡，黄宇.高效液相色谱法测定不同产地葛花中葛花苷的含量[J].中南药学，2012，10（6）：435-437.
[6]陳玉兰，蒲清荣，魏嵋，等.HPLC法测定葛花药材中鸢尾苷的含量[J].亚太传统医药，2016，12（156）：22-23.
[7]刘立辉，李卫民，高英.HPLC同时测定野葛花中鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷、鸢尾苷、鸢尾苷元的含量[J].中国中药杂志，2010，35（17）：2308-2311.
[8]赵剑，蒲清荣，陈玉兰，等.茵陈四苓颗粒乙醇提取工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（22）：31-34.
（收稿日期：2017-10-10）
摘要：目的优选葛黄颗粒乙醇渗漉工艺。方法以乙醇提取物中有效成分鸢尾苷含量为指标，通过单因素试验比较乙醇渗漉法、乙醇超声法和乙醇回流法，确定葛黄颗粒中醇提药材的提取方法；运用高效液相色谱法，使用正交设计法，优选葛黄颗粒乙醇提取工艺。结果采用乙醇渗漉法提取，最佳工艺为：8倍量60%乙醇，浸泡12h，流速为1mL·min-1。结论采用该渗漉工艺提取，葛黄颗粒乙醇提取物中鸢尾苷的收率较高且稳定。
关键词：渗漉；正交设计；鸢尾苷；高效液相色谱法；葛黄颗粒
中图分类号：R283文献标志码：A文章编号：1007-2349（2018）01-0069-03
【Abstract】Objective： To optimize the process of ethanol percolation in Gehuang Granule. Methods： By taking the content of tectoridin in the ethanol extract as an index and by single factor test， ethanol percolation method， ethanol ultrasonic method and ethanol reflux method were compared to determine the extraction method of alcohol extraction medicinal material in Gezhong granule. By using HPLC and orthogonal design method， the ethanol extraction process of Gezhong Granule was optimized . Results： The best extraction process was ethanol percolation method. The optimum conditions were as follows， 8 times the amount of 60% ethanol， soaking for 12 hours， with 1mL·min-1 of flow rate. Conclusion： According to the percolation process， the yield of tectoridin of ethanol percolation in Gehuang Granule is high and stable.
【Key words】percolation， orthogonal design， tectoridin， HPLC， Gehuang Granules
葛黄颗粒是本院自制的复方中药制剂，具有醒酒解毒、健脾疏肝、清热利湿之功效。处方中有葛花、丹参，主要成分为鸢尾苷、丹参酮ⅡA等脂溶性成分。现代药理研究表明，葛花中所含的鸢尾苷等异黄酮类化合物具有解酒保肝的作用，可使血中乙醇、乙醛浓度下降，以及降低血尿素氮的升高，从而起到解酒作用。鸢尾苷等异黄酮类成分易溶于乙醇。为最大限度地提取方中有效成分，充分发挥解酒、保肝的功效，本实验以鸢尾苷含量为指标，通过单因素试验比较乙醇渗漉法、乙醇超声法和乙醇回流法对葛黄颗粒中有效成分含量的影响，筛选最佳提取方法，并通过正交设计优选最佳乙醇渗漉工艺。
1材料
仪器与材料：HH—S8水浴锅；JA203H天平；AUW120D精密天平；JPCT0328超声机；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-20A紫外可见检测器，LCsolution色谱工作站。鸢尾苷对照品（中国食品药品检定研究院提供，供鉴别用，批号：111632-200602，供含量测定用）。葛花、丹参均购于泸州市宝光中药饮片公司，经西南医科大学庄诚教授鉴定，均符合《中国药典》2015年版相关项下要求。乙腈、甲醇為色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件及系统适用性试验色谱柱：Wonda Sil C18-WR（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸水（20∶80）；流速：1 mL·min-1，检测波长：265 nm，柱温：40℃，理论塔板数按鸢尾苷计算应不低于4000。
2.2对照品溶液的制备精密称取鸢尾苷对照品1.24 mg，置10 mL棕色量瓶中，加入甲醇超声溶解并定容，即得对照品溶液。
2.3标准曲线的制备依次精密吸取鸢尾苷对照品溶液2.5、5、10、15、20 μL注入液相色谱仪，测定。以峰面积（A）为纵坐标（Y），进样量（mg）为横坐标（X），绘制标准曲线，得到回归方程：Y=4537.6X-5486，r=0.9998（n=5）。见表1和图1～3。
2.4提取方法比较取葛花、丹参粉碎成粗颗粒（过20目筛），各精密称取单倍处方量3份，混匀。
2.4.1乙醇渗漉法取1份粗颗粒，加适量60%乙醇浸润30 min，取脱脂棉一团垫在渗漉筒底部铺平，装筒，加入20倍量60%乙醇，加盖密闭24 h，以1～3 mL·min-1流速进行渗漉，收集渗漉液，减压浓缩至适量，恒温干燥，得提取物1。
2.4.2乙醇超声法取1份粗颗粒，置烧瓶中，加入20倍量60%乙醇浸泡30 min，超声提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量，恒温干燥，得提取物2。
2.4.3乙醇回流法取1份粗颗粒，置磨口烧瓶中，加20倍量60%乙醇浸泡30 min，加热回流提取2次，每次1 h，放冷，滤过，收集滤液减压浓缩至适量，恒温干燥，得提取物3。
2.5供试品溶液的制备分别取提取物各0.25 g，精密称定，加入75%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声提取40 min，取出，放冷，补足重量，滤过，取续滤液，过0.45 μm滤膜，滤过，即得。
2.6提取方法比较结果按2.1项下色谱条件测定含量，结果发现鸢尾苷提取量依次为15.10，13.22，10.06 mg·g-1，即乙醇渗漉法提取的鸢尾苷含量最高。
2.7正交试验样品的制备选择乙醇浓度、浸泡时间、乙醇用量、流速为因素，选用L9（34）因素水平表安排正交试验。各因素水平见表2。按单倍量处方药材的配比，准确称取9份样品，按表2中9种工艺条件组合进行渗漉提取，提取液浓缩成稠膏备用。
2.9方法学考察
2.9.1精密度试验精密吸取对照品溶液，连续重复进样5次，每次进样10 μL进行测定，结果RSD为1.59%（n=5）。表明该方法、该仪器测定鸢尾苷精密度符合要求。
2.9.2稳定性试验精密吸取对照品溶液10 μL，分别在0，2，4，8，10h进样，测定各峰面积，其积分面积RSD为0.58%（n=5）。表明鸢尾苷用该方法在该仪器上10 h内测定结果较稳定，符合要求。
2.9.3重现性试验取1号样品干浸膏，依法重复提取并测定5次，结果1号浸膏的含量平均值为16.0304 mg·g-1，RSD为2.24%（n=5），表明该方法重现性试验符合要求。
2.9.4 加样回收率试验 精密称取1号样品0.075g共6份，分别精密加入一定量的鸢尾苷对照品溶液（精密称取鸢尾苷对照品10.20 mg于25 mL量瓶中，加75%乙醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为0.408 mg·mL-1的对照品溶液）3 mL至样品中，再精密吸取22 mL 75%乙醇，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，各取10 μL进样测定，计算加样回收率。结果见表3。鸢尾苷平均回收率为102.53 %，RSD为2.55 %，表明本方法准确可靠。
2.10样品的测定取正交试验干浸膏，按2.5项下制备供试品溶液。按上述色谱条件，进样10μL，测定峰面积，计算含量。根据各因素对提取工艺影响的贡献大小给予不同的权重系数：干浸膏得率为20%，鸢尾苷含量为80%，再进行加权求和：综合评分=（干浸膏收率/干浸膏收率最大值）×20%+（鸢尾苷含量/鸢尾苷含量最大值）*80%。正交试验结果见表4及表5。
由表4和表5可以看出因素A，即乙醇浓度对鸢尾苷含量有显著影响（P<0.05），影响因素大小顺序为 A>D>B>C，及乙醇浓度>流速>浸泡时间>乙醇用量。优选的工艺为 A2B1C3D1。乙醇用量影响不大，为节约成本，乙醇用量选择为8倍量，即最佳提取工艺为：处方药材加8 倍量60%乙醇，浸泡 12h，渗漉速度为 1 mL·min-1。
2.12验证试验由于葛黄颗粒醇提工艺的最佳方案没有在正交试验因素表内，因此课题组对最佳醇提工艺进行了6次验证。结果见表6。根据药材含量，计算鸢尾苷提取率为：71.4119%。
3讨论
葛黄解酒颗粒处方来源于名老中医经验方，该制剂药味较多，葛花、丹参的主要有效成分为醇溶性成分，为配合工业化生产的需要，故采用乙醇提取。本文通过粗略比较3种不同的乙醇提取方法，结果渗漉法提取工艺既具有较高的提取率，又能为大生产节约生产成本。
参考文献：
[1]张蓉蓉，吴大正.野葛解酒机制的研究进展[J].上海中医药大学学报，2007，21（2）：80-82.
[2]姚美村，廖祎婷，袁月梅，等.不同葛花提取物对乙醇致小鼠肝损伤保护作用的比较研究[J].时珍国医国药，2011，22（4）：883-885.
[3]曾明，邸晓辉.葛根及葛花对酒精代谢的研究[J].医药论坛杂志，2010，31（23）：203-205.
[4]尹俊亭，仲英，孙敬勇，等.葛花化学成分的研究（Ⅰ）[J].中草药，2006，37（3）：350-351.
[5]华卡，黄宇.高效液相色谱法测定不同产地葛花中葛花苷的含量[J].中南药学，2012，10（6）：435-437.
[6]陳玉兰，蒲清荣，魏嵋，等.HPLC法测定葛花药材中鸢尾苷的含量[J].亚太传统医药，2016，12（156）：22-23.
[7]刘立辉，李卫民，高英.HPLC同时测定野葛花中鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷、鸢尾苷、鸢尾苷元的含量[J].中国中药杂志，2010，35（17）：2308-2311.
[8]赵剑，蒲清荣，陈玉兰，等.茵陈四苓颗粒乙醇提取工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（22）：31-34.
（收稿日期：2017-10-10）
