玫瑰痤疮与肠道菌群紊乱的相关性研究

    梁博 李国东 何明璇

    [摘要]目的：探討玫瑰痤疮与肠道菌群的相关性。方法：选取2015年1月-2017年12月笔者医院皮肤科门诊确诊的玫瑰痤疮志愿者80例为实验组，并选取同期健康志愿者60例为对照组。采用荧光定量PCR检测肠道菌群中双歧杆菌、肠球菌、肠杆菌、拟杆菌、梭杆菌和乳酸杆菌的拷贝数，分析两组肠道菌群拷贝数的差异，以及肠道菌群与玫瑰痤疮的相关性。结果：玫瑰痤疮志愿者肠道菌群中乳酸杆菌、梭杆菌、双歧杆菌的拷贝数及双歧杆菌与肠杆菌比值 （B/E值）均低于健康对照组，肠球菌及拟杆菌拷贝数高于健康对照组，差异有统计学意义（均P<0.05）;肠杆菌拷贝数稍低于健康对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。乳酸杆菌、梭杆菌及双歧杆菌拷贝数与玫瑰痤疮病情呈负相关（P<0.05）;肠杆菌及肠球菌拷贝数与玫瑰痤疮病情呈正相关（P<0.05）;拟杆菌与玫瑰痤疮病情之间无明显相关性（P>0.05）。结论：肠道菌群紊乱可能在玫瑰痤疮发病中起到一定作用。

    [关键词]玫瑰痤疮;肠道菌群;荧光定量PCR;相关性;菌群紊乱

    [中图分类号]R758.73+3 ? ?[文献标志码]A ? ?[文章编号]1008-6455（2019）07-0048-04

    Clinical Study on the Correlation between Roseacne and Intestinal Flora Disorder

    LIANG Bo，LI Guo-dong，HE Ming-xuan，CUI Zhao，LIU Ya-wei，LI Hui-rong，ZHOU Jian-hua

    （Department of Dermatology，Baoding Second Hospital，Baoding 071000，Hebei，China）

    Abstract： Objective ?To investigate the correlation between rosacea and intestinal flora， and to provide a theoretical basis for the correlation between intestinal flora and the incidence of rosacea. Methods ?From January 2015 to December 2017， we accepted 80 cases of rosacea patients in the dermatology clinic of our hospital as the experimental group， and 60 cases of health examination in our hospital were selected as control group. Real time PCR was used to detect the copy number of Bifidobacterium， Enterococcus， Enterobacter， Bacteroides， Fusobacterium and Lactobacillus in the intestinal flora of the experimental group and the control group. Statistical analysis show the difference of intestinal flora copy number between the two groups， and the correlation between rosacea condition severity and intestinal flora. Results ?The copy number of Lactobacillus， Fusobacterium and Bifidobacterium， and B/E value in the intestine of patients with rosacea were significantly lower than those in the control group， and the copy number of Enterococcus and Bacteroides in the patients with rosacea group were significantly higher than those in the control group， the differences were statistically significant （both P<0.05）. However， Enterobacters copy number of patients with rosacea group slightly lower than that of the normal control group， the difference was not statistically significant （P>0.05）. The copy number of Lactobacillus， Fusobacterium and Bifidobacterium were negatively correlated with rosacea condition severity （P<0.05）. The copy number of Enterobacter and Enterococcus were positively correlated with rosacea condition severity （P<0.05）. The copy number of Bacteroides was not significant correlated with rosacea condition severity （P>0.05）. Conclusion ?The intestinal flora disorder may be related to the pathogenesis of rosacea.

    Key words： rosacea; intestinal flora; real-time PCR; correlation; microbiota disturbance

    玫瑰痤疮是一种常见的面中部皮肤血管及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，主要临床症状表现为阵发性潮红、红斑、丘疹、脓疱等，少数患者可发展成鼻赘，该病好发于30～40岁女性[1]，发病率约为1%～20%[2]。玫瑰痤疮的发病原因及机制至今仍未明确，但有不少学者认为其发病与基因易感性，天然免疫、血管神经功能失调、紫外线辐射和微生物感染等因素存在相关性[3]。

    玫瑰痤疮多见于克罗恩病，溃疡性结肠炎等炎症性肠病患者中，Spoendlin等[4]认为两者之间存在相关性。Parodi等学者[5]发现空肠未知细菌的过度生长（Small intestinal Bacterial Overgrowth， SIBO）和玫瑰痤疮之间存在潜在的关系，但就肠道菌群与玫瑰痤疮的确切关系尚未完全阐明。自2015年1月以来，笔者对玫瑰痤疮与肠道菌群紊乱的相关性进行了研究，现报道如下。

    1 ?资料和方法

    1.1 一般资料：选取2015年1月-2017年12月笔者医院皮肤科门诊的玫瑰痤疮志愿者80例为实验组，其中男47例，女33例;年龄18～60岁，平均年龄（34.7±9.1）岁。选取同期笔者医院健康志愿者60例为对照组，其中男34例，女26例，年龄20～60岁，平均（35.2±10.4）岁。两组患者一般资料比较，无明显统计学差异（P>0.05），具有可比性。

    1.2 纳入及排除标准：纳入标准：①符合玫瑰痤疮的诊断标准;②除外寻常型痤疮、脂溢性皮炎及糖皮质激素依赖性皮炎等其他面部慢性皮肤炎症;③年龄18～60岁，性别不限;④所有患者知情同意，自愿参加本研究并签署知情同意书。排除标准：①患有严重系统性疾病者;②年龄<18岁;③有胃肠道疾病者;④既往有胃肠道手术史者;⑤妊娠、拟妊娠、哺乳期女性;⑥近2个月内口服药物或行物理治疗，或近1个月内口服糖皮质激素、抗生素、抗过敏药物者。

    1.3 皮损面积评分：根据2004年美国国家玫瑰痤疮协会专家委员会（NRSEC）制定的玫瑰痤疮分型标准[6]，选取红斑毛细血管扩张期、丘疹脓疱期、鼻赘期三期患者作为研究对象，其中红斑毛细血管扩张期18例，丘疹脓疱期46例，鼻赘期16例。根据皮损面积及严重程度指数分别对红斑、毛细血管扩张、丘疹及脓疱数目、皮损面积进行评分[7]。皮损总积分=（红斑评分+毛细血管扩张评分+丘疹及脓疱数目）×皮损面积评分。试验组皮损评分4～24分，平均（13.37±4.67）分。评分标准见表1。

    1.4 方法

    1.4.1 标本收集：收集两组志愿者清晨新鲜中段粪便约5g于无菌干燥试管内，迅速保存于-80℃超低温冰箱中。

    1.4.2 肠道细菌DNA提取：取2g湿粪便样品溶于20ml灭菌PBS，震荡摇匀，10min后以3 000r/min速度离心5min，取上清，上述操作重复3次;以12 000r/min速度离心10min，弃上清，取沉淀并使用20ml PBS悬浮，12 000r/min速度离心5min，重复3次。将洗涤后菌体用2ml无菌水悬浮混匀，分别装入2个EP管。然后根据DNA提取试剂盒（Biovision，美国）说明书进行粪便DNA的提取。

    1.4.3 PCR引物设计：根据文献报道[8-9]，设计双歧杆菌、肠球菌、肠杆菌、拟杆菌、梭杆菌和乳酸杆菌的菌属特异性引物，并在Gene Bank基因库内比对不同引物序列的特異性和代表性。见表2。

    1.4.4 荧光定量PCR：将质粒标准品连续10倍梯度稀释，获得102～1012个拷贝/ml的标准品作为模板，行荧光定量PCR。其反应体系为20μl：SYBR Green Master Mix 10μl，上下游引物各0.5μl，模板DNA 2μl，ddH2O 7μl;反应条件：95℃变性5min;95℃变性10s、退火温度（见表2）20s、72℃延伸30s，共45个循环;反应完毕后进行溶解曲线分析，根据Ct值建立标准曲线。待测样品DNA稀释后，体系与条件同上，进行荧光定量 PCR检测肠道菌群中双歧杆菌、肠球菌、肠杆菌、拟杆菌、梭杆菌和乳酸杆菌的拷贝数量，同时计算双歧杆菌与肠杆菌比值（B/E值），B/E值<1提示患者肠道抗定植能力弱，肠道菌群紊乱;B/E值>1，则提示患者肠道抗定植能力强。

    1.5 统计学分析：所得数据均录入SPSS 25.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x?±s）表示，行t检验，采用Pearson相关系数行相关性分析。

    2 ?结果

    2.1 两组肠道菌群状况对比：玫瑰痤疮患者肠道菌群中的乳酸杆菌、梭杆菌、双歧杆菌的拷贝数及B/E值均明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;肠杆菌拷贝数虽稍低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。玫瑰痤疮组肠球菌及拟杆菌的拷贝数显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

    2.2 肠道菌群与玫瑰痤疮的相关性分析：将肠道菌群拷贝数与玫瑰痤疮的皮损评分进行Pearson相关性分析，肠道菌群中的乳酸杆菌、梭杆菌及双歧杆菌拷贝数与玫瑰痤疮呈负相关性（P<0.05）;肠球菌及拟杆菌玫瑰痤疮呈正相关（P<0.05）;肠杆菌与玫瑰痤疮的发病相关性不显著（P>0.05），见表4。

    3 ?讨论

    人体内有数以万计的肠道菌群疏密有致地分布于消化道之中，在营养物质代谢、免疫调节及维生素合成等过程中发挥不可替代的作用[10]。肠道菌群的组成、数量、分布及生物活性与人体各种代谢活动、消化系统疾病、免疫功能及感染等疾病有着密切联系[11]。研究发现，肠道菌群稳态失衡与多种疾病相关，如：2型糖尿病、代谢综合征、肥胖、炎症性肠病，高血压及神经系统疾病等[12]。