食品中李斯特氏菌的分离鉴定
郭瑞军
摘 ? 要： 英诺克李斯特氏菌与有毒性单核细胞增生李斯特氏菌的菌落特征和生化特征相似，仅溶血试验结果不同。本文通过对河南省濮阳市市售凉皮进行检验，分離纯化出一株李斯特氏菌，利用单增李斯特氏菌生化鉴定条进行检验，结果显示木糖和甘露醇两项生化试验结果为阴性，且溶血试验结果为阴性，符合英诺克李斯特氏菌的判定标准。同时，VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统也准确鉴定出该菌为英诺克李斯特氏菌（概率为99%）。
关键词：李斯特氏菌 ?英诺克李斯特氏菌 ?VITEK 2 Compact
1 引言
李斯特氏菌属是革兰氏阳性杆菌，属内有两个种具有致病性，即单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和伊氏李斯特菌（L.ivanovii），前者致病性强，是重要的食源性致病菌之一，人体感染后的主要临床表现有败血症、脑膜炎等。单核细胞增生李斯特氏菌往往存在于肉制品和乳制品中，并能够在低温条件下繁殖，因其严重威胁人类健康，故我国食品中致病菌限量标准规定该菌不得检出。
英诺克李斯特氏菌（L.innocua）虽无致病性，却在食物中广泛存在。通过查阅国内相关论文研究来分析李斯特氏菌对我国食品的污染状况，结果显示在所有食物类型中，英诺克李斯特氏菌的检出率最高，其次为单核细胞增生李斯特氏菌[1]。骆玲飞等[2]通过对320份食品进行检验发现，英诺克李斯特氏菌的检出率为7.19%，共计23株，占检出李斯特氏菌总数的63.89%，这表明该菌会给食品安全带来极大隐患。此外，由于英诺克李斯特氏菌与单核细胞增生李斯特氏菌较为相似，且不易区分，因此容易造成误判[3-4]。本研究通过对河南省濮阳市市售凉皮进行检验，分离出一株李斯特氏菌，利用单增李斯特氏菌生化鉴定条和VITEK 2 Compact进行鉴定，以判定该菌是否为单核细胞增生李斯特氏菌，希望能够为李斯特氏菌的准确鉴定提供参考依据。
2 材料与方法
2.1 材料
河南省濮阳市市售凉皮。
2.2 方法
按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30-2016）进行检验。样品经过两次增菌（LB1、LB2）培养后，划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板上，在36℃培养箱中培养24～48h后，挑选典型菌落进行木糖和鼠李糖生化试验，同时划线接种到TSA-YE平板上。
在对木糖阴性、鼠李糖阳性的菌落进行革兰氏染色、动力试验和溶血试验的同时，利用单增李斯特氏菌生化鉴定条和VITEK 2 Compact进行检验。
3. 实验结果
3.1 分离初筛
取LB2培养液接种到选择性琼脂平板上进行培养观察发现，李斯特氏菌显色平板上出现蓝绿色菌落，PALCAM琼脂平板上出现灰绿色菌落。挑取选择性琼脂平板上的典型菌落划线接种到TSA-YE平板上，同时接种到木糖和鼠李糖发酵管中进行培养。结果显示，木糖为阴性，鼠李糖为阳性。
3.2 镜检和动力试验
利用革兰氏染色液试剂盒对TSA-YE平板上的菌落进行染色，显微镜下观察菌株为革兰氏阳性短杆菌。用接种针挑取菌落穿刺接种到SIM生化管中，30℃培养48h后观察发现，菌落沿穿刺线呈伞状生长。
3.3 生化鉴定结果
利用单增李斯特氏菌生化鉴定条对TSA-YE平板上的可疑菌落进行检验，结果显示，仅木糖和甘露醇两项生化试验结果为阴性，过氧化氢酶、葡萄糖和麦芽糖等生化试验结果均为阳性（见表1），由此判定该菌株为单核细胞增生李斯特氏菌或英诺克李斯特氏菌。
3.4 溶血试验
将纯化培养后的可疑菌落划线接种到血琼脂平板上，36℃培养48h后于明亮处观察，发现菌落周围无溶血圈，由此判定该菌株为英诺克李斯特氏菌。
3.5 VITEK 2 Compact鉴定结果
挑取TSA-YE平板上的可疑菌落划线接种到含5%羊血的胰酶大豆琼脂（TSAB）上，36℃培养18～24h后制成0.5～0.63McF的菌悬液并上机检验，8h后给出分析报告。结果显示，D-木糖（dXYL）和D-甘露醇（dMAN）等26项生化试验结果为阴性，D-麦芽糖（dMAL）等17项生化试验结果为阳性（见表2），无不吻合的典型生化谱，故结果判定为英诺克李斯特氏菌（概率为99%），为极好的鉴定。
4 讨论
常规检验过程中，溶血试验是区分单核细胞增生李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的关键。国标方法指出，溶血试验中的菌落接种分为刺种和划线两种方法。刺种过程中可以将血平板划分成20～25个小格，每个小格接种一个可疑菌落，即让多个菌落集中在同一个平板上，便于对比观察且节约成本。然而，该方法对检验人员的操作要求较高——穿刺时要尽量接近血平板底部而又不能刺破，否则会影响试验结果。划线接种方法方便快捷，适合少量样品的检验，但划线过程需按标准操作，避免菌落连成一片，进而影响结果判定。
VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统具有自动化程度高、速度快、准确性好等特点，在食品安全检验中具有重要的应用价值。同时，该系统对上机检验的样品要求较高——对菌液的纯度、浓度和培养时间等有着严格要求。通过比对单核细胞增生李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的43项生化鉴定结果，发现两种菌存在PIPLC、LeuA和LAC这3项生化试验结果不同[5]。有研究指出，VITEK 2 Compact不能有效区分单核细胞增生李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌[4-6]，而李苗苗[7]的研究结果与该结论不同，且本研究已利用VITEK 2 Compact准确鉴定出可疑菌落为英诺克李斯特氏菌。由于VITEK 2 Compact偶尔不能有效区分单核细胞增生李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌，因此在实验室条件允许的情况下，建议采用多种方法综合判定，确保准确鉴定李斯特氏菌。
参考文献：
[1] Jianshun Chen， Xiaofeng Zhang， Lingling Mei，et al. Prevalence of Listeria in Chinese food products from 13 provinces between 2000 and 2007 and virulence characterization of Listeria monocytogenes isolates.[J]. Foodborne Pathogens and Disease， 2009， 6（1）：7-14.
[2] 骆玲飞，王小光，刘继倩，等.部分市售农副产品李斯特菌污染情况调查及毒力基因检测[J].中国食品卫生杂志，2010，22（3）：275-277.
[3] 曾梅锦，林彩华，许如苏，等.单增李斯特菌比对试验结果与分析[J].检验检疫科学，2006，16（3）：6-8.
[4] 苏静，于烽，刘艳，等.单增李斯特氏菌国家标准检验方法的验证与探讨[J]. 疾病预防控制通报，2015，30（4）：84-85.
[5] 陈洁，周剑，郑露.食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证分析[J].河南预防医学杂志，2018，29（11）：832-837.
[6] 丁秀琼，杨劲，刘骁，等.3种方法检测食品中单增李斯特菌能力验证结果分析[J]. 检验检疫学刊，2018，28（06）：15-18.
[7] 李苗苗.食品中单增李斯特菌检出的能力验证[J].食品安全导刊，2018，224（33）：71-72.
