血浆环状RNA_0002867对HBV相关性肝癌诊断价值的初步研究

    何娅娣?吴振权?侯国良

    【摘要】目的 探討血浆环状RNA_0002867（circ_0002867）对HBV相关性肝细胞癌（肝癌）的诊断价值。方法 分析已发表的测序结果，筛选在肝癌患者的组织和血浆中同时高表达的环状RNA，通过微滴数字PCR（ddPCR）检测35例HBV相关性肝癌患者（肝癌组）及30例HBV相关性肝硬化患者（肝硬化组）血浆circ_0002867表达水平，电化学发光法检测2组患者的血清甲胎蛋白水平，应用受试者工作特征（ROC）曲线分析血浆circ_0002867、血清甲胎蛋白及两者联合对HBV相关性肝癌的诊断价值。结果 在肝癌患者的组织和血浆中同时高表达的环状RNA中取交集筛选出circ_0002867行进一步验证。肝癌组血浆circ_0002867表达水平为（29.63±11.56）copies/ml，高于肝硬化组的（19.15±11.57）copies/ml（P < 0.001）;血浆circ_0002867、血清甲胎蛋白及两者联合诊断HBV相关性肝癌的ROC曲线下面积分别为0.725（95% CI 0.600～0.828）、0.670 （95% CI 0.542～0.781）、0.810（95%CI 0.693～0.896），血浆circ_0002867和血清甲胎蛋白两者联合提高了血清甲胎蛋白诊断HBV相关性肝癌的效能（P < 0.05）。结论 血浆circ_0002867联合血清甲胎蛋白对诊断HBV相关性肝癌具有较好的临床价值。

    【关键词】乙型肝炎病毒;肝细胞癌;诊断;血浆;甲胎蛋白;环状核糖核酸

    Plasma circular RNA_0002867 as a diagnostic biomarker for hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma He Yadi， Wu Zhenquan， Hou Guoliang. Health Management Center， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

    Corresponding author， He Yadi， E-mail： heyadi2015@ 126. com

    【Abstract】Objective To investigate the diagnostic value of plasma circular RNA_0002867 （circ_0002867） for hepatitis B virus （HBV）-related hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods The published sequencing results were analyzed to screen the high expression of circular RNAs in both tissues and plasma of HCC patients. The expression levels of plasma circ_0002867 were detected by digital droplet polymerase chain reaction （ddPCR） in 35 patients with HBV-related HCC and 30 patients with HBV-related liver cirrhosis. The serum alpha-fetoprotein （AFP） levels were determined by electrochemiluminescence in two groups. The receiver operating characteristic （ROC） curve was delineated to analyze diagnostic values of plasma circ_0002867， serum AFP and these two combined for HCC. Results The circ_0002867， which was highly expressed in both tissues and plasma of HCC patients， was screened for subsequent validation. The expression level of plasma circ_0002867 in the HBV-related liver cirrhosis group was significantly lower than that in the HBV-related HCC group （（19.15±11.57） copies/ml vs. （29.63±11.56） copies/ml; P < 0.001））. The area under ROC for plasma circ_0002867， serum AFP， and these two combined was 0.725 （95% CI 0.600-0.828）， 0.670 （95% CI 0.542-0.781） and 0.810 （95% CI 0.693-0.896）， respectively. The combination of serum AFP and plasma circ_0002867 significantly improved the diagnostic accuracy of serum AFP for HBV-related HCC （P < 0.05）. Conclusion Plasma circ_0002867 combined with serum AFP is a potential diagnostic biomarker for HBV-related HCC in clinical practice.

    【Key words】Hepatitis B virus;Hepatocellular carcinoma; Diagnosis;Plasma;Alpha-fetoprotein;

    Circular RNA

    肝细胞癌（肝癌）主要由HBV感染引起，是我国第2常见的消化系统实体瘤，也是恶性肿瘤死亡的第2大原因[1]。肝癌的高病死率与其早期缺乏临床癥状、在发现时大部分已处于晚期密切相关[2]。目前临床上常用的血清甲胎蛋白诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为39% ～ 64%和76% ～ 91%，其效能仍有待提高[3]。一项多中心的回顾性研究表明，Cmi（7个血清微RNA的组合）诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为70% ～ 86%和80% ～ 91%[4]。环状RNA （circRNA）与微RNA同属于非编码RNA。与微RNA相比，circRNA具有闭合环状结构，可耐受核酸外切酶，稳定性更高。有研究显示，血浆组合circRNA （circ_0000976，circ_0007750和circ_0139897）对直径≤3 cm的肝癌具有较高的诊断效能，优于血清甲胎蛋白[5]。本研究分析已发表circRNA测序结果，采用微滴数字PCR （ddPCR）检测技术，探索血浆circRNA对诊断HBV相关性肝癌的价值，现报告如下。

    对象与方法

    一、研究对象及资料收集

    选择2019年1月至2020年12月佛山市第一人民医院收治的35例HBV相关性肝癌患者为肝癌组;同期收集30例HBV相关性肝硬化患者为肝硬化组。纳入标准：①年龄18 ～ 80岁;②有慢性乙型肝炎病史;③经肝病理活组织检查（活检）确诊为肝癌或肝硬化;④临床资料完整，在治疗前采集外周血。排除标准：外周血RNA提取总量不足。所有受试者均签署知情同意书，并经佛山市第一人民医院医学伦理委员会批准。分别记录2组患者的性别、年龄、身高和体质量，计算BMI。

    二、血清甲胎蛋白检测

    于患者入院后治疗前采用非抗凝干燥无菌真空管收集3～5 ml外周血，室温下以1000转/分离心5 min，取上清至EP管置-80℃保存;按照甲胎蛋白检测试剂盒（电化学发光法，罗氏公司）说明书操作要求及步骤，采用罗氏E601全自动电化学发光免疫分析仪检测血清甲胎蛋白水平。

    三、血浆肝癌特异性circRNA筛选

    分析5对肝癌组织及邻近正常肝组织的circRNA表达谱，共得到191个高表达circRNA;10例HBV相关性肝癌患者及5例HBV相关肝硬化患者的血浆circRNA表达谱，共得到124个高表达circRNA[6-7]。circBase数据库用于注释差异circRNA。通过取交集，筛选出血浆肝癌特异性circRNA。

    四、血浆采集及RNA提取

    于患者入院后治疗前使用经乙二胺四乙酸二钠处理的试管采集约8 ml外周血，采集后2 h内于4℃ 3000×g离心15 min获取血浆，然后立即使用miRNeasy Mini试剂盒（Qiagen）提取血浆中总RNA，操作严格按照试剂盒说明书要求进行。

    五、逆转录模板DNA（cDNA）

    应用逆转录试剂盒Perfect Real Time （TaKaRa），将提取的RNA逆转录为cDNA。按照说明书配置10 μl反应体系，包括2 μl 5倍体积稀释的PrimeScript 缓冲液，0.5 μl PrimeScript 逆转录酶混合物Ⅰ，0.5 μl随机6核苷酸引物（100 μmol/L），RNA和水配置至10 μl。反应程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。

    六、dd PCR检测

    引物序列：circ_0002867正向为5-CCATG

    CCACAGTCCGCAATG-3，反向为5-TCCAACTGC TCCACGACACA-3，产物长度为125 bp。ddPCR使用20 μl反应体系（2 μl cDNA，10 μl QX200 EvaGreen ddPCR Supermix，4 μmol/L上下游引物;

    无酶水替代cDNA设置阴性对照）在QX200 ddPCR系统上进行。向反应体系中加入70 μl微滴生成油生成微滴，吸取40 μl微滴至96孔PCR板在T100TM PCR仪器进行扩增，反应条件：95℃

    5 min;95℃ 30 s，64℃ 60 s，循环45次;4℃ 5 min，

    90℃ 5 min稳定信号;4℃保存。采用微滴分析仪和QuantaSoft软件分析检测结果。

    七、统计学处理

    绘图及统计分析使用SPSS 25.0和R 3.6.1。符合正态分布的计量资料采用表示，组间比较采用t检验;非正态分布用M（Q25，Q75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。使用logisitic回归分析（Enter法）纳入血清甲胎蛋白和血浆circ_0002867两个变量，建立回归方程，绘制受试者工作特征（ROC） 曲线分析血清甲胎蛋白和血浆circ_0002867表达水平对HBV相关性肝癌的诊断效能;采用DeLong检验分析2条ROC曲线之间的差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

    结果

    一、肝硬化组与肝癌组患者的一般资料

    共纳入65例患者，其中肝硬化组30例、肝癌组35例，组间年龄构成、性别构成、BMI和肝功能child-pugh分级比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。肝癌组血清甲胎蛋白水平高于肝硬化组（P < 0.05），见表1。

    二、血浆肝癌特异性circRNA筛选结果

    通过文献[6]肝癌组织和邻近正常肝组织的circRNA表达谱，以及文献[7] HBV相关性肝癌患者及HBV相关肝硬化患者的血浆circRNA表达谱，取交集筛选出circ_0002867行进一步验证，见图1。其在肝癌组织及邻近正常肝组织的差异倍数为3.804，错误发现率（FDR）为0.001;在HBV相关性肝硬化患者血浆的差异倍数为2.057，FDR < 0.001。

    三、血漿circ_0002867、血清甲胎蛋白对HBV相关性肝癌的诊断效能

    肝癌组血浆circ_0002867表达水平为（29.63

    ±11.56）copies/ml，高于肝硬化组的（19.15± 11.57）copies/ml（t = 3.585，P < 0.001），见图2A。ROC曲线分析显示血浆circ_00028677诊断HBV相关性肝癌的曲线下面积（AUC）为0.725（95% CI 0.600 ～ 0.828），当诊断临界值为17.10 copies/ml时，灵敏度和特异度分别为85.7%和50.0%，其可作为血浆circ_00028677诊断HBV相关性肝癌的最佳临界值，见图2B。

    血浆circ_0002867、血清甲胎蛋白及两者联合诊断HBV相关性肝癌 [Logit（P） = -2.910+0.003×甲胎蛋白+0.095×circ_0002867]的ROC AUC分别为0.725 （95% CI 0.600 ～ 0.828）、0.670 （95% CI 0.542 ～ 0.781）、0.810 （95% CI 0.693 ～ 0.896）。血浆circ_0002867和血清甲胎蛋白两者联合诊断提高了血清甲胎蛋白单一诊断HBV相关性肝癌的效能（Z = 2.483，P = 0.013），其他任2者比较差异均无统计学意义（P均> 0.05）。ROC曲线分析提示血浆circ_0002867与血清甲胎蛋白联合诊断HBV相关性肝癌的灵敏度和特异度分别为65.7%和90.0%，而血清甲胎蛋白单独诊断HBV相关性肝癌的灵敏度和特异度分别为60.0%和80.0%，联合诊断提高了诊断的灵敏度及特异度。

    讨论

    在中国，大多数肝癌患者都有乙型肝炎相关病史，造成炎症和肝细胞再生持续存在，炎症和肝硬化同时存在使得肝癌的早期诊断更加困难[8]。肝癌的预后与治疗时机至关重要，早期肝癌可通过手术或介入的方式取得良好的疗效，但由于肝癌早期缺乏特异的临床症状，很多患者在确诊时已处于晚期，严重影响其预后。目前血清甲胎蛋白是诊断和判断肝癌预后的重要标志物之一，但其易受炎症等指标的影响。因此，急需寻找新的生物标志物用于协助诊断肝癌。液体活检通过检测体液包括血液、尿液中的生物分子如RNA、DNA、蛋白等诊断疾病和预测患者预后，其与传统组织活检相比具有损伤小、取样方便等优势。

    本研究中，我们通过分析已发表测序数据，探索血浆circRNA在HBV相关性肝癌中的诊断价值。首先，我们分别筛选肝癌组织和血浆中circRNA的差异表达谱，通过取交集的方式，寻找到肝癌特异性circRNA （circ_0002867），2项研究中的测序结果表明circ_0002867在肝癌患者的癌组织和血浆中同时高表达。血液样本是临床中最常用的样本之一，收集和保存运输方便，重复检测可行性更强。本研究使用ddPCR检测血浆circ_0002867表达水平，ddPCR为第3代PCR技术，不需要内参基因，可实现对检测物质的绝对定量，对检测微量物质较传统的实时荧光定量PCR相比更具优势[9]。研究显示，肝癌组血浆circ_0002867表达水平高于肝硬化组，提示利用血浆circ_0002867诊断HBV相关性肝癌具有可行性。

    血浆circ_0002867与血清甲胎蛋白两者联合诊断与血清甲胎蛋白单一诊断HBV相关性肝癌的ROC AUC分别为0.810和0.670。与血清甲胎蛋白相比，血浆circ_0002867与血清甲胎蛋白两者联合诊断提高了其诊断效能，尤其是提高了灵敏度和特异度。因此，两者联合可更好地诊断HBV相关性肝癌。值得注意的是，circ_0002867来源于HBV相关性肝癌的组织和血浆中circRNA差异表达谱，此研究结果是否适用于非HBV相关性肝癌，尚有待进一步研究。

    综上所述，circ_0002867联合血清甲胎蛋白可提高血清甲胎蛋白的诊断效能。结合circRNA耐酶稳定和血液样本易获取的优点，血浆circ_0002867联合血清甲胎蛋白诊断HBV相关性肝癌可能具有更高的临床价值，值得进一步研究。

    参? 考? 文? 献

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    （收稿日期：2021-06-01）

    （本文編辑：林燕薇）