甜瓜13-脂氧合酶CmLOX18在果实中 可能参与C6挥发性物质的合成

     张 冲 曹嵩晓 靳亚忠 鞠立君 陈强 邢巧娟 齐红岩

    

    

    目的与意义： 浓郁的香气作为薄皮甜瓜最重要的风味特性之一，是近年来研究甜瓜果实品质特性的热点。先前的研究发现，薄皮甜瓜果实中直链酯类含量高达70%，且大部分被认为是通过脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途径合成。脂氧合酶由18个基因成员编码，而且18个成员中，CmLOX18在成熟果实中高度表达，然而目前关于其功能的研究未见报道。因此，笔者通过酵母真核表达系统和转基因技术，解析CmLOX18在果实挥发性物质合成中的功能，希望能够丰富甜瓜果实香气合成的分子機制。

    材料与方法： 以薄皮甜瓜‘玉美人（Cucumis melo var. makuwa Makino）为试材，通过酿酒酵母真核表达系对CmLOX18重组蛋白进行异源表达，并纯化重组体蛋白，测定纯化蛋白的酶学特性;通过高效液相色谱法（HPLC）对CmLOX18重组体蛋白的催化生成产物进行研究，确定CmLOX18蛋白的催化特性;通过聚乙二醇（PEG）介导法，将CmLOX18转入拟南芥原生质体中，对CmLOX18进行亚细胞定位。通过Gateway技术将CmLOX18转入植物超表达载体中，利用农杆菌介导法，将甜瓜CmLOX18转入‘中蔬6号番茄中，利用PCR、Southern blot、western blot 以及活体荧光成像仪鉴定T0代转基因植株;通过实时荧光定量技术检测T1代转基因果实中CmLOX18、SlHPL和番茄LOXs基因家族成员的表达水平;利用气质联用仪（GC-MS）对T1代转基因果实挥发性物质含量进行检测。

    结果与分析： （1）通过酵母真核表达系统，获得CmLOX18重组蛋白，酶活性最高出现在30 °C，pH 4.5缓存液中;重组蛋白CmLOX18的酶动力学参数检测发现米氏常数Km值在以亚油酸（linoleic acid，LA）为底物时，显著高于亚麻酸（linolenic acid，LeA）;两种底物比较，酶促反应最大速度Vmax值，亚油酸约是亚麻酸的4倍，因此，亚油酸是CmLOX18的最适底物; 液相色谱（HPLC）分析表明，CmLOX18酶促反应产物为13S-HPOD，因此确定CmLOX18为13S-LOX类型。（2）亚细胞定位结果表明，CmLOX18定位于植物的非叶绿体细胞器中。（3）T1 代转基因果实中，甜瓜CmLOX18转入引起了番茄SlHPL基因表达水平显著高于野生型，但是并未引起番茄内源LOX基因家族成员基因表达水平的显著改变;转基因植株果实正己醛、反-3-己烯醛和反-3-己烯-1-醇等C6香气物质含量显著高于野生型番茄; C5化合物（1-戊醇和1-戊烯-3-酮）在野生型和转基因果实中并无显著差异。这些结果表明，转基因果实中C6挥发性物质的升高，是由于甜瓜CmLOX18导入和SlHPL基因表达水平升高引起的，CmLOX18可能通过 hydroperoxide lyase （HPL）分支途径参与C6香气物质的合成。

    结? ? 论： 明确了甜瓜CmLOX18的生化特性，即蛋白酶最适催化温度为30 ℃，最适 pH 值为4. 5，催化产物为 13?氢过氧化物;定位于非叶绿体中的 CmLOX18参与果实中正己醛、反-3-己烯醛和反-3-己烯-1-醇等C6香气物质的合成。