脂肪干细胞对D-半乳糖致裸鼠皮肤老化的拮抗作用及对皮肤恢复功能的影响
魏姝玥 王海英 李爱兰 郑优优 李健华 袁春英 游云天 马强
[摘要]目的：本文通過研究脂肪干细胞（Adipose stem cells，ASCs）在D-半乳糖诱导裸鼠皮肤老化的拮抗作用及其对皮肤恢复功能的影响，旨在探讨抗衰老机制并为临床上抗衰老疗法提供新的思路。方法：选择SPF级裸鼠40只，随机分为4组：对照组、D-半乳糖+磷酸盐缓冲液（PBS）组、D-半乳糖+ASCs组与D-半乳糖+氨基胍（AG）组，每组10只。对D-半乳糖+PBS组，D-半乳糖+ASCs组和D-半乳糖+AG组的裸鼠的背部进行皮下注射1 000mg/kg D-半乳糖，每天1次，持续8周。2周之后，3组小鼠背部分别注射PBS缓冲液（0.5ml）、ASCs（1×106/ml）和AG（100mg/kg），均注射至真皮层，每天1次，4周后处死。取每组皮肤组织，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA），黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD），ELISA法测定晚期糖基化终末产物（AGEs）、总胶原蛋白、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平。通过HE染色和马松染色比较各组皮肤组织真皮层厚度及胶原分布比，采用免疫组化测定各组CD31及血管内皮生长因子（VEGF）表达情况。结果：四组裸鼠的体重与模型构建前并无显著差别。对照组裸鼠表现为充满活力，反应敏捷，并且皮肤富有弹性，粪便无明显臭味;衰老小鼠模型皮肤逐渐变弱，变薄，失去弹性，并患有便秘，且排泄物发臭;而经ASCs或AG处理的小鼠裸鼠在处理后情况有所改善。相较于对照组，D-半乳糖+PBS组裸鼠SOD、总胶原蛋白、CD31、VEGF、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平显著降低，MDA及AGEs表达量显著增加，而通过ASCs或AG处理的裸鼠各指标水平均有所改善。HE及马松染色结果显示，相较于对照组，D-半乳糖+PBS组裸鼠真皮层相对较薄，胶原分布比明显降低，而经ASCs或AG处理的裸鼠鼠真皮层有所增厚，胶原分布比显著上升。结论：ASCs移植对D-半乳糖诱发衰老的裸鼠的自由基与糖基化水平具有良好的拮抗作用，为ASCs的移植抵抗肌肤衰老的理论提供了实验依据。
[关键词]脂肪干细胞;D-半乳糖;皮肤老化;裸鼠;拮抗作用
[中图分类号]R622 ? ?[文献标志码]A ? ?[文章编号]1008-6455（2020）01-0062-06
Antagonistic Effect of Adipose-derived Stem Cells on Skin Aging Induced by D-galactose in Nude Mice and its Effect on Skin Recovery
WEI Shu-yue，WANG Hai-ying，LI Ai-lan，ZHENG You-you，LI Jian-hua，YUAN Chun-ying，YOU Yun-tian，MA Qiang
（Department of Dermatology & STD，Dongying People's Hospital，Dongying 257091，Shandong，China）
Abstract： Objective ?To investigate the anti-aging mechanism and provide new ideas for clinical anti-aging therapy by studying the antagonism of adipose-derived stem cells （ASCs） in D-galactose-induced skin aging in nude mice and its effect on skin recovery. Methods Forty-one SPF nude mice were randomly divided into 4 groups： control group， D-galactose +phosphate buffer（PBS） group， D-galactose+ASCs group and D-galactose+aminopurine（AG） Group， 10 in each group. The back of D-galactose+PBS group， D-galactose+ASCs group and D-galactose +AG group were injected subcutaneously with 1 000mg/kg D-galactose once a day for 8 weeks. After 2 weeks， the mice in the three groups were injected with PBS buffer （0.5ml）， ASCs （1×106/ml）， and AG （100mg/kg）， respectively， and injected into the dermis layer once a day， and sacrificed 4 weeks later. For each group of skin tissues， malondialdehyde （MDA） was determined by thiobarbituric acid method， superoxide dismutase （SOD），Collagen， type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen were determined by xanthine oxidase method， and advanced glycation end products（AGEs） were determined by ELISA. The dermis thickness and collagen distribution ratio of skin tissue were compared by HE staining and Masson staining. The expression of CD31 and vascular endothelial growth factor（VEGF） in each group were determined by immunohistochemistry. Results ?The body weight of the four groups of nude mice was not significantly different from that before the model was constructed. The nude mice in the control group showed vigorousness， rapid response， and the skin was elastic， and the feces had no obvious odor. The skin of the aging mouse model gradually weakened， thinned， lost elasticity， suffered constipation， and the excrement smelled. Mouse nude mice treated with ASCS or AG improved after treatment. Compared with the control group， the SOD、CD31、VEGF、Collagen， type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen levels of D-galactose+PBS group was significantly decreased， and the expression levels of MDA and AGEs were significantly increased， while the levels of all the indexes of nude mice treated by ASCS or AG were improved. The results of HE and Masson staining showed that the dermis layer of D-galactose+PBS group was relatively thin compared with the control group， and the collagen distribution ratio was significantly decreased， while the dermis layer of nude mice treated with ASCS or AG increased. Thick， collagen distribution ratio increased significantly. Conclusion ?The transplantation of ASCs has a good antagonistic effect on the free radical and glycosylation level of D-galactose-induced aging nude mice， and provides an experimental basis for the theory of ASC transplantation against skin aging.
Key words： adipose stem cells; D-galactose; skin aging; nude mice; antagonism
皮肤老化是在多种因素作用下所致的皮肤衰老现象，由于皮肤中重要成分如水分、透明质酸、弹性蛋白、胶原蛋白等的减少，导致皮肤表现为弹性和柔软性的降低，皱纹出现，皮肤干燥、角化过度以及色素沉着[1-2]。随着社会的发展，关于皮肤的抗老化治疗已成为医学美容的关注热点。由D-半乳糖诱导的啮齿类动物的亚急性衰老模型具有价格低廉、造模简便易行、结果稳定等特点，已广泛运用于抗衰老的药理研究中[3-4]。糖基化是一种在胶原蛋白中游离氨基酸组之间的非酶反应，同时也是由氧活化基因诱导的氧化反应[5]。研究表明，由还原糖和蛋白质之间的反应而诱导的糖基化是引起机体衰老的重要因素[6]。自由基具有超强的氧化能力，其可氧化生物膜的不饱和脂质并产生脂质过氧化物（LPO）[7]。丙二醛（MDA）为自由基的最终产物，研究表明，MDA可影响细胞间的物质交换，最终导致细胞的破裂和死亡[8-9]。机体各类物质的代谢过程均可导致自由基的过氧化反应，从而引起自由基的不平衡。而一旦自由基引起的损害超出了机体的自我恢复能力，将导致细胞分化状态有所改变，影响细胞的分化能力，最终导致皮肤的衰老。
脂肪干细胞（Adipose stem cells，ASCs）可分化为血管内皮细胞和脂肪细胞，并能够促进血管和脂肪组织的形成。ASCs广泛存在于人体内，在一定程度上，其可应用于软组织的填充[10]。已有研究表明，ASCs合成的可注射型支架材料可用于皮肤的抗衰老的软组织填充中[11]。基于此，本研究以C57BL/6-GFP小鼠的双侧腹股沟分离出来的脂肪作为组织来源，在经过分离，培养以及传代后，将脂肪干细胞移植到裸鼠背部的真皮层中。探讨移植后的脂肪干细胞对自由基以及诱发裸鼠亚急性衰老的D-半乳糖的糖基化的影响效应，旨在探讨抗衰老机制并为临床上抗衰老疗法提供新思路。
1 ?材料和方法
1.1 实验动物：选用SPF级裸鼠40只，雄性，体质量17～23g[山东省动物实验中心，合格证：SCXK（鲁）2018-0037]。于屏障环境下饲养1周后开始实验，将40只裸鼠随机分为4组[对照组、D-半乳糖+磷酸盐缓冲液（PBS）组、D-半乳糖+ASCs组与D-半乳糖+氨基胍（AG）组]，每组10只，进行分笼饲养。同时选用SPF级C57BL/6-GFP小鼠10只，用于脂肪干细胞的提取。所有实验用动物饲养环境保持温度为22℃～25℃，湿度为55%～65%，模拟昼夜交替，每日光照12h。
1.2 实验试剂及仪器
1.2.1 主要试剂：高糖DMEM（Hyclone公司），胎牛血清（Gibco公司），青霉素、链霉素（Gibco公司），PBS缓冲液（北京鼎国生物科技有限公司），D-半乳糖（Sigma公司），氨基胍（Sigma公司），丙二醛（MDA）试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），晚期糖基化终末产物（AGEs）ELISA试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），总胶原蛋白ELISA试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），Ⅰ型胶原蛋白ELISA试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），Ⅲ型胶原蛋白ELISA试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），血管内皮生长因子（VEGF）免疫组化试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），CD31免疫组化试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），HE染色试剂（国药集团化学试剂有限公司），马松染色试剂（国药集团化学试剂有限公司）。
1.2.2 主要仪器：倒置顯微镜（日本奥林巴斯公司），光学显微镜（日本奥利巴斯公司），内切式组织匀浆机 （上海朗晟生物科技有限公司），图像数字化处理分析系统（德国LEICA公司），切片机（英国珊顿公司），Bio Rad 450酶标仪（美国Bio Rad公司）。
1.3 方法
1.3.1 脂肪干细胞的分离：取C57BL/6-GFP小鼠的腹股沟处完整的脂肪垫，放置在培养皿中。采用PBS溶液对取下的脂肪垫进行反复冲洗3次以洗掉其表面残留的血液，去除脂肪垫上可见的纤维结缔组织。随后将脂肪垫切成1mm3的小的组织块，并添加同等比例的0.25% Ⅰ型胶原酶，然后将组织块放置到37℃电热恒温水槽中分解45min。在分解过程中，摇晃2～3次并使两种溶液充分混合。分解后，添加培养基[高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）+1%的青霉素混合溶液（10 000IU）]以及同等体积的链霉素（10 000pg/ml）进行中和，并使用2-筛孔进行过滤。将得到的溶液以1 200rpm/min离心5min，使用一次性吸管吸出上清液，将沉淀物加入到1ml培养基中制成悬浮液，随后加入六倍体积的红细胞裂解平衡液，混匀，于常温下孵育8min。孵育结束后，将该溶液再次以1 200rpm/min离心5min，并去除上清液。将沉淀物加入到1ml培养基中制成悬浮液，并将得到的悬浮液接种在培养皿中，于细胞培养箱（37℃，5% CO2）中培养。
1.3.2 半乳糖诱导裸鼠衰老模型的构建：对D-半乳糖+PBS组，D-半乳糖+ASCs治疗组和D-半乳糖+AG组的裸鼠的背部进行皮下注射1 000mg/kg D-半乳糖，每天1次，持续8周。所有的注射操作均采用无菌技术，并用紫药水对每一个注射点进行标记。
1.3.3 分组干预：ASCs在分离、培养和传代后，将第三代ASCs通过0.05%消化酶进行分解;对得到的细胞悬浮液以1 000rpm/min离心5min。离心结束后，去掉上清液，并加入0.5ml的PBS溶液重新对细胞进行悬浮。并调整细胞浓度为1×106/ml。
模型构建两周之后，对D-半乳糖+PBS组，D-半乳糖+ASCs治疗组和D-半乳糖+AG组裸鼠背部分别注射PBS缓冲液（0.5ml）、ASCs（1×106/ml）和AG（100mg/kg），均注射至真皮层，每天1次，4周后处死。
1.3.4 检测指标：从每组裸鼠的注射区域取下0.5g的皮肤组织块。然后采用预冷的生理盐水冲洗组织块，并去除皮下脂肪和结缔组织，用滤纸擦干皮肤组织块。采用组织匀浆机（于冰水环境下）将皮肤组织制成10%的组织匀浆，反复溶解三次，直到细胞被完全破坏，所有成分均在液相状态进行分离。取各组的上清液进行与老化相关的生物标志物以及晚期糖基化终末产物的检测。具体操作步骤按照相应的说明书进行。采用硫代巴比妥酸法测定MDA，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD），ELISA法测定晚期糖基化终末产物（AGEs）、总胶原蛋白、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平。
取每组裸鼠的注射区域的皮肤组织块，将其制成切片。所有皮肤组织块切片均用HE染色、马松染色进行处理。比较各组皮肤组织真皮层厚度及胶原分布比，采用免疫组化测定各组CD31及血管内皮生长因子（VEGF）表达情况，VEGF工作溶液的稀释率为1：500，CD31工作溶液的稀释率为1：100。
1.4 统计学分析：采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计数资料用例数和百分数表示，计量数据用平均值±标准差（x?±s）表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA），组间两两比较，若方差齐性，采用LSD检验，若方差不齐，采用Dunnett-t3检验，检验水准α=0.05。
2 ?结果
2.1 四组裸鼠一般状况及体质量变化情况：四组裸鼠的体重与模型构建前并无显著差别。对照组裸鼠表现为充满活力，反应敏捷，并且皮肤富有弹性，粪便无明显臭味;衰老小鼠模型皮肤逐渐变弱，变薄，失去弹性，并患有便秘，且排泄物发臭;而经ASCs或AG处理的小鼠裸鼠在处理后情况有所改善。见图1。
2.2 四组SOD及MDA水平比较：相较于对照组，D-半乳糖+PBS组裸鼠SOD水平显著降低，MDA水平显著增加，而通过ASCS或AG处理的裸鼠各指标水平均有所改善。见图2。
2.3 四组AGEs水平比较：相较于对照组，D-半乳糖+PBS组裸鼠AGEs水平显著增加，而通过ASCs或AG处理的裸鼠AGEs水平有所改善。见图3。
2.4 四组真皮层厚度以及胶原比值情况比较：HE染色组织学观察结果显示，在注射D-半乳糖后，小鼠皮肤及其附属器官发生显著变化。HE染色后，小鼠皮肤的真皮层变成红色，细胞核呈深蓝色，在胶原纤维中可见大量的深蓝色的梭形成纤维细胞核。在光学显微镜下对每个皮肤样品的真皮厚度进行统计分析。注射4周后，四组皮肤样品的真皮层的厚度均发生显著变化。组织学检测发现，与对照组相比，在D-半乳糖模型组的小鼠的真皮层厚度相对较薄，而经过ASCs或AG处理后，裸鼠皮肤真皮层厚度显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4～5。
马松染色组织学观察结果显示，在显微镜下可以看到位于皮肤真皮层有大量的束状排列的胶原纤维。染色胶原纤维呈现蓝色，而肌纤维则呈现红色。与对照组相比，D-半乳糖致衰老模型组的胶原分布比明显降低，而经过ASCs或AG处理后，裸鼠胶原分布比显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5～6。
2.5 四组CD31及VEGF水平比较：相较于对照组，D-半乳糖+PBS组裸鼠CD31及VEGF表达量显著降低，而通过ASCs或AG处理的裸鼠CD31及VEGF表达量有所改善。见图7～8。
2.6 四组总胶原蛋白、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平比较：相较于对照组，D-半乳糖+PBS组裸鼠总胶原蛋白、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平显著降低，而通过ASCs或AG处理的裸鼠各指标水平均有所改善。
3 ?讨论
皮肤衰老主要与真皮层中纤维细胞的减少以及细胞生物学功能的降低有关。皮肤的真皮结构老化主要表现在真皮消除外部物质的能力降低，真皮层厚度变薄，以及胶原分解的增多，胶原合成的减少，以及分解酶活性的增强[12]。目前，自体脂肪组织被认为是最好的软组织填充材料之一。作为脂肪组织移植的一种理想细胞，ASCs已经被证实为在抵抗衰老，修复软组织损伤以及提高移植性脂肪的成活率方面具有显著效果[13]。已有研究表明，ASCs可促进脂肪组织的更新[14];脂肪细胞的寿命通常是2～10年，ASCs来源的细胞可以作为死亡的脂肪细胞的替代细胞。随着年龄的增加，脂肪组织可能会逐渐萎缩，其原因可能为ASC生成的逐渐减少，以及可再生性组织的不断弱化。Kim等[15]以及Lee等[16]的研究发现，ASCs的上清液可加速在真皮内层的成纤维细胞的增殖以及Ⅰ型胶原的分泌，同时还具有降低成纤维细胞的凋亡能力。此外，ASCs的注射可减少由紫外线B（UVB）而导致的小鼠皮肤皱纹，并增加胶原蛋白的含量和真皮的厚度。
本研究中，通过HE染色及马松染色结果显示，D-半乳糖的注射，可能会导致皮肤真皮层变薄，并使胶原分泌减少。而ASCs可以逆转由D-半乳糖诱发的小鼠的真皮层厚度和胶原分泌的变化。而ELISA结果显示，ASCs可改善由D-半乳糖诱发的小鼠总胶原蛋白、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白的分泌。既往研究表明，脂肪干细胞能够分泌胶原蛋白[17]，但是仍认为，ASCs主要功能是通过旁分泌机制加快成纤维细胞增殖和胶原蛋白的产生，从而增加胶原蛋白的含量和真皮层厚度;移植后的脂肪干细胞能够刺激成纤维细胞分泌并合成胶原，同时刺激分泌大量的新的细胞外基质，从而修复真皮原有的弹性纤维，重建肌肤结构，同时能够增加真皮厚度，增加皮肤弹性，改善皮肤纹理。
MDA是一类性质活跃的交联剂，其能与磷脂酰乙醇胺迅速反应并产生荧光色素，然后进一步形成含有蛋白质、肽和脂质的层状脂褐质，沉积在细胞和组织中。这类物质会导致机体各种生物大分子功能結构的异常，并破坏细胞的结构和功能，最终导致身体老化。机体中，与老化相关的酶如SOD和谷胱甘肽过氧化物酶可相互调节以消除机体内过多的自由基并减少脂质过氧化物MDA的产生。但随着年龄的增长，SOD的活性不断降低，从而导致MDA的含量不断增加。目前研究中，SOD的活性及MDA含量已作为反映机体衰老指标之一[18-19]。本研究中，经过D-半乳糖诱导后，SOD的活性明显降低，而MDA的水平则显著提高;而通过 ASC移植后，SOD的活性则得到明显的升高，MDA的水平则明显降低。而且经过ASCS处理后，老化的裸鼠的精神状态得到改善，其皮肤光泽也得到了恢复。这提示ASCs移植具有一定的抗衰老能力。
糖基化是胶原中游离氨基之间的一种非酶反应，也是氧活化基团诱导的氧化反应。当机体受到外界物质的刺激时，胶原中的氨基酸往往被暴露，进而导致细胞外液的氨基酸和葡萄糖之间产生非酶糖基化，从而产生新的残留物即晚期糖基化终末产物。随着晚期糖基化终末产物的增加，胶原形成分子间的交联，結缔组织的通透性降低，组织的延展性和硬度增加并且胶原的含量逐渐降低，最终诱发真皮层变薄，皮肤弹性的减弱，从而加速机体的衰老。本研究结果显示，脂肪干细胞的移植可以有效地抑制晚期糖基化终末产物的产生，从而拮抗糖基化。
目前，也有研究认为ASCs的抗衰老机制是促进血管的生成。大量证据表明，脂肪干细胞能够通过分泌的VEGF以及肝细胞生长因子来加速组织血管的生成[20-21]。本研究结果表明，ASCs能够通过分泌VEGF而诱导皮肤组织血管的生成，而CD31免疫组化染色结果也进一步证实了ASCs可以为皮肤组织提供营养物。
综上所述，ASCs可以提高抗氧化酶的活性，并减少脂质过氧化物的生成，促进胶原蛋白的分泌，同时还可逆转D-半乳糖诱导产生的晚期糖基化终末产物的过度生成。酶活性以及晚期糖基化终末产物的变化可能与某些功能细胞以及缺乏及时更新的干细胞的衰老和功能减退相关。虽然具体的机制并不清楚，但是认为，脂肪干细胞可以通过以下的机制修复或重建组织，这些机制为：首先，ASCs以类似于间充质干细胞的形式移植到皮肤组织，其可以通过旁分泌而分泌细胞生长因子，进而刺激细胞修复;其次，ASCs可以为需要修复的皮肤组织提供抗氧化剂和自由基清除剂，从而消除在局部环境中释放的有毒物质，加速活性细胞的修复，并将这些细胞分化成功能细胞以替换老化的功能细胞，从而保持机体平衡。
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[收稿日期]2019-05-31
本文引用格式：魏姝玥，王海英，李愛兰，等.脂肪干细胞对D-半乳糖致裸鼠皮肤老化的拮抗作用及对皮肤恢复功能的影响[J].中国美容医学，2020，29（1）：62-67.
