熊去氧胆酸通过干扰白介素-10对小鼠肥胖风险的影响

    高黎黎 张昊

    

    

    

    [摘要]目的：探索熊去氧膽酸（UDCA）通过干扰脂肪组织中白介素-10（IL-10）的水平，对高脂饲料诱导小鼠肥胖风险的影响。方法：将C57BL/6J雄鼠简单随机化分为：Control组、DIO组、+UDCA组及+UDCA+IL-10组，于诱导0、6及8周后测量体重。取小鼠肠系膜白色脂肪（mesenteric white adipose tissue，mWAT），ELISA和western-blot法检测mWAT中IL-10和IL-10Rα的蛋白浓度;RT-PCR法检测产热基因的表达水平。结果：诱导6周后，Control组小鼠体质量较其它高脂诱导组低，差异有统计学意义（P<0.05）;8周后，高脂诱导小鼠中，DIO组小鼠体重最高，+DUCA+IL-10组次之，+DUCA组最低。DIO组mWAT中IL-10含量较Control组高（37.13pg/mg vs 16.29pg/mg， P<0.01），+DUCA组的IL-10含量（19.04pg/mg）较DIO组低（P<0.01），+DUCA+IL-10组的IL-10含量（33.87pg/mg）较+DUCA组高（P<0.05）。此外，各组mWAT中IL-10Rα水平的变化趋势与IL-10相似。+DUCA组mWAT中多个线粒体产热基因的表达较DIO组上调（P<0.05）。结论：UDCA可减少高脂诱导小鼠白色脂肪中IL-10和IL-10Rα水平，增加脂肪细胞线粒体产热基因的表达，降低小鼠的肥胖风险;该效果可被外源性IL-10削弱。

    [关键词]熊去氧胆酸;白介素-10;产热基因;肥胖;风险

    [中图分类号]R589 ? ?[文献标志码]A ? ?[文章编号]1008-6455（2020）01-0068-04

    Effects of Ursodeoxycholic Acid on the Risk of Obesity in Mice Via Inhibiting Interleukin-10

    GAO Li-li1，ZHANG Hao2

    （1.Center for Medical Research and Innovation;2.Department of General Surgery，Shanghai Pudong Hospital/Fudan University Pudong Medical Center，Shanghai 201399，China）

    Abstract： Objective ?To explore the effect of ursodeoxycholic acid（UDCA） on the risk of obesity via inhibiting interleukin-10（IL-10） level in high-fat diet-induced mice. Methods ?Male C57BL/6 mice were divided into four groups using simple random method， including Control group， DIO group， +UDCA group and +UDCA+IL-10 group， body weight were monitored at baseline， 6 weeks and 8 weeks after feeding. Meanwhile， the mesenteric white adipose tissue （mWAT） was collected， and the IL-10 and IL-10Rα protein level were detected by ELISA and western blot assays respectively， then the expression of thermogenic genes were analyzed by real-time PCR. Results ?Compared with other groups， the body weight value of the Control group was the lowest following 6 weeks induction （P<0.05）. After 8 weeks， in high-fat diet-induced mice， the DIO group had the highest body weight， followed by the the +DUCA+IL-10 group and the lowest in the +DUCA group （P<0.05）. In addition， the IL-10 level of mWAT in DIO group was higher than that in the Control group（37.13pg/mg vs 16.29pg/mg， P<0.01）， it was lower in the +UDCA group（19.04pg/mg） than that in the DIO group （P<0.01）， and it was higher in the +UDCA+IL-10 group（33.87pg/mg） than that in the +UDCA group （P<0.05）. As well， the trend of IL-10Rα levels among the groups was similar with IL-10. Whereas most of the mitochondrial thermogenic genes abundance were down-regulated in the DIO group， and up-regulated in the +DUCA group （P<0.05）. Conclusion ?We conclude that UDCA could reduce IL-10 and IL-10Rα levels in WAT， increase mitochondrial thermogenic genes expression in adipocytes， and finally alleviate the risk of obesity in high-fat-diet-induced mice. Importantly， the treatment of exogenous IL-10 could eliminate the role of UDCA in resisting obesity.

    Key words： ursodeoxycholic acid; interleukin-10（IL-10）; thermogenic genes; obesity; risk

    近年来，一些研究证明了免疫系统对脂肪组织的增殖和活化有明显影响，强调了抗炎（Ⅱ型）细胞因子在调节脂肪产热中的重要性。嗜酸性细胞在刺激下产生白细胞介素-4（IL-4）/IL-13，激活产热过程[1-2]。IL-33激活2型先天淋巴细胞（IL-C2），促进米色脂肪生源论[3]。最近，IL-33被证明通过调节解偶联蛋白1（uncoupling protein 1，UCPl）的剪接促进脂肪细胞进行非耦合呼吸[4]。白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是一种多细胞源、多功能的细胞因子[5]。近年来，有研究发现IL-10可通过调节脂肪细胞的染色质重构，限制白色脂肪组织的产热和能量消耗[6]。因此，寻找有效药物阻断IL-10限制脂肪能耗或将成为治疗高脂饮食诱发的代谢紊乱的研究目标。

    熊去氧胆酸（UDCA）是亲水性胆汁酸（BA）并已作为胆汁淤积和慢性肝炎的保肝药物;它也是经美国食品药品管理局批准用于治疗原发性胆汁胆管炎（PBC）的一种药物[7-8]。最近研究显示，UDCA能调节多个分子靶点，发挥抗炎、降脂和改善糖代谢的作用，具有治疗肥胖及肥胖所致的代谢性疾病的潜能[9]。但其具体的作用机制不是十分清楚。随着现代社会肥胖和肥胖相关代谢性疾病的高发，阐明UDCA作为一种安全、有效的肥胖治疗手段的机制备受关注。有研究显示，UDCA能抑制高脂诱导小鼠肝脏IL-10的表达[10]。那它对脂肪内IL-10的调控如何，能否通过对IL-10水平的干扰影响脂肪组织的能量代谢水平，缓解肥胖。本实验以高脂诱导小鼠为模型，探索UDCA通过干扰脂肪组织中IL-10的水平，对高脂饲料诱导C57BL/6J小鼠肥胖风险的影响，为研究UDCA减轻机体肥胖的作用机制提供理论依据。

    1 ?资料和方法

    1.1 動物模型：SPF级雄性C57BL/6J小鼠，8周龄， 体质量（20±2）g，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK（沪）2012-0002]。简单随机化分为4组，每组8只：①Control组（普通喂养）;②DIO组（高脂诱导，美国，Research Diets，D12492）;③+UDCA组（高脂+UDCA诱导）;④+UDCA+IL-10组（高脂+UDCA+IL-10诱导）。从第7周起，对+UDCA组、+UDCA+IL-10组行UDCA灌胃2周（50mg/kg，1次/d，UDCA原液溶解在33%乙醇，33%二甲亚砜，33%吐温-80中，使用时按1：50稀释于0.5M NaCl溶液;UDCA，Sigma-Aldrich，U5127）。第8周起，对+UDCA+IL-10组行IL-10腹腔注射干预1周（10μg/kg，隔天1次，共计4次;IL-10，PEPRO-TECH，210-10）。干预结束后处死小鼠，取肠系膜脂肪组织（mesenteric white adipose tissue， mWAT）冻存。

    1.2 方法

    1.2.1 体质量检测：分别检测各组小鼠基线和诱导6周及8周后的体质量，检测前禁食6h，正常给水。

    1.2.2 Real-time PCR：按说明书将储于液氮的mWAT取50g研磨成匀浆后，提取总RNA并测其浓度及A260：A280值，取比值1.8～2.0者，然后逆转录成cDNA，采用两步法PCR扩增标准程序：预变性，95℃ 10min，1个循环进行cDNA变性;PCR反应：95℃ 15s，59℃ 1min。40个循环放大;熔化曲线分析（60℃～95℃），以验证单个产品的存在。引物由上海生工生物技术有限公司合成。内参为GAPDH基因，使用 delta-delta Ct方法计算mRNA水平：2-ΔΔCT，ΔΔCT=（Ct目标基因-CtGAPDH）实验组-（Ct目标基因-CtGAPDH）对照组，见表1。

    1.2.3 Western-blot法：组织匀浆后，14 000r/min离心5min提取蛋白，取上清定量后加入上样缓冲液于8%的SDS-PAGE，完毕后转膜。牛奶封闭后，分别加入1：1 000的IL-10Rα抗体（ab225820，abcam）及1：1 000的β-actin抗体（4967L，CST）4℃孵育过夜后，TBST 漂洗2遍，加入用辣根过氧化物酶标记的二抗，室温轻摇1h，洗膜后曝光。

    1.2.4 ELISA法：组织样本mWAT（0.3g）置于800μl预冷提取缓冲液（100mM Trizma Base pH7.5， 10mM EDTA，100mM NaF，10mM Na4P2O7，10mM Na3VO4，2mM PMSF，0.1mg/ml 抑肽酶）。匀浆后，添加80μl 10% Triton X-100至样品，冰上放置30min，4℃离心40min（20817g）。吸取上清，以牛血清白蛋白为参照，采用Bradford法测定蛋白浓度。定量测定IL-10蛋白浓度，ELISA（DuoSet ELISA、R&D Systems，Minneapolis，MN，USA），重复测量，取平均值。

    1.3 统计学分析：采用SPSS 22.0软件进行数据分析，数据采用x?±s形式表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，检验水准α=0.05。采用GraphPad Prism 7软件以x?±s形式作图。

    2 ?结果

    2.1 各组小鼠体质量比较：各组小鼠的体质量基线水平比较差异无统计学意义（F=1.79，P>0.05）。造模8周后，与Control组比较，DIO组小鼠体质量增长较为明显，差异有统计学意义（t=16.86，P<0.001）;与DIO组相比，+UDCA组体质量降低（t=4.55，P<0.001）;与UDCA组相比，+UDCA+IL-10组体质量增加，差异有统计学意义（t=2.91，P<0.05）。见表2。

    2.2 各组小鼠mWAT中IL-10浓度比较：ELISA测定mWAT的IL-10蛋白浓度，结果显示DIO组IL-10含量为37.13pg/mg，较Control组16.29pg/mg增高（t=4.04，P<0.01），说明高脂诱导可以引起小鼠mWAT中IL-10含量的增高;+DUCA组IL-10含量为19.04pg/mg，较DIO组下降（t=3.51，P<0.01），说明+UDCA干预可以引起小鼠mWAT中IL-10的含量减低;+DUCA+IL-10组IL-10含量为33.87pg/mg，较+DUCA组增加（t=2.87，P<0.05），腹腔IL-10注射可提高mWAT中IL-10的浓度。见图1。

    2.3 各组小鼠mWAT中IL-10Rα表达水平：Western-blot检测结果显示，DIO组mWAT中IL-10Rα的蛋白水平较Control组和+DUCA组高，+DUCA+IL-10组IL-10Rα的蛋白水平较Control组和+DUCA组高，与IL-10含量的变化趋势相似，见图2。

    2.4 各组小鼠mWAT中线粒体产热基因的表达： 以各组小鼠mWAT中UCP1、Cidea、Cox8b、pGC-1α及Pdgfrα基因表达水平作为脂肪产热指标，RT-PCR结果显示，与Control组相比，DIO组中UCP1、Cidea及pGC-1α的表达下调，差异有统计学意义（P<0.01）;与DIO组相比，+UDCA组中UCP1、Cidea、Cox8b及pGC-1α的表达上调，差异有统计学意义（P<0.05）;与+UDCA组相比，+UDCA+IL-10组中UCP1、Cidea、Cox8b及pGC-1α的表达下调，差异有统计学意义（P<0.05）。UDCA干预能提高高脂诱导小鼠mWAT中线粒体UCP1的水平，促进产热相关基因的表达，IL-10干预会减弱这种效应，见图3。

    3 ?讨论

    IL-10是目前公认的炎症与免疫抑制因子，主要通过信号转导及转录活化因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）发挥抗炎与免疫抑制作用[11]。关于IL-10对脂肪和能量稳态作用的观点却不同。Mauer等认为IL-10不具有抵抗肥胖的功能[12-13]。但P Rajbhandari等指出IL-10能参与抑制脂肪细胞产热基因的表达，促进饮食诱导肥胖的发生;IL-10Rα是富集于白色和米色脂肪细胞表面的IL-10受体的亚单位，并随着分化水平和机体肥胖程度逐渐上调[6]。本研究显示高脂诱导能增加小鼠白色脂肪mWAT中IL-10浓度和IL-10Rα的表达，与后者研究结果基本一致。

    在哺乳动物体内，存在3种类型脂肪组织：白色脂肪组织（White adipose tissue，WAT）、棕色脂肪组织（Brown adipose tissue，BAT）和米色脂肪组织。其中，一般情况下WAT以甘油三酯的形式储存能量，线粒体含量少。BAT含有豐富的线粒体，线粒体中存在的UCP1可将部分用于制造ATP的能量转化为热量。然而，人们在WAT中发现了米色脂肪组织与BAT相似，米色脂肪细胞的生成通常伴随着机体的产热作用增强，脂肪代谢增加及体质量减轻[14]。米色脂肪组织可由前体细胞和白色脂肪细胞转分化而来，表达高水平的UCP1[15-16]。因此，将丰富的白色脂肪转化为米色脂肪，促进脂肪细胞线粒体UCP1产热，是对抗肥胖的有效方法。

    研究发现，高脂饮食导致的肥胖大鼠模型体内胆汁酸的水平明显降低[17]，而给予小鼠UDCA后能够改善高脂饮食诱导的肥胖[18]。一方面，是由于胆汁酸会通过激活TGR5依赖型2型碘甲状腺原氨酸脱碘酶（D2）来增加小鼠BAT和人类骨骼肌的能量消耗，D2是负责将甲状腺素（T4）转化为三碘甲状腺原氨酸的主要酶（T3）[19-20]。生物活性T3诱导线粒体生物发生和UCP1的表达，促进游离脂肪酸氧化和增加能量消耗[21-22]。另一方面，本文通过动物实验探索发现，UDCA对限制热量消耗的分子有调节作用。UDCA干预可降低IL-10及IL-10Rα蛋白水平，提高线粒体部分产热基因的表达，缓解IL-10对肥胖小鼠脂肪能量消耗的抑制;但外源性IL-10的输入又会增加小鼠白色脂肪中IL-10和IL-10Rα，逆转UDCA抵抗肥胖风险的作用。

    综上所述，UDCA干预可以降低高脂诱导小鼠白色脂肪中IL-10和IL-10Rα水平，增加脂肪细胞线粒体产热基因的表达，预防小鼠的肥胖风险，该效果可被外源性IL-10削弱。

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    [收稿日期]2019-05-20

    本文引用格式：高黎黎，张昊.熊去氧胆酸通过干扰白介素-10对小鼠肥胖风险的影响[J].中国美容医学，2020，29（1）：68-71.