松材线虫和拟松材线虫繁殖能力差异研究
徐红梅+王义勋+王勇
摘要：松材线虫作为外来入侵种，逐步取代拟松材线虫占据生态位。初步研究表明这可能与两种线虫的繁殖能力差异关系密切。本研究采取了两种方法，即离体条件竞争试验和体内竞争试验比较二者繁殖力。结果表明，松材线虫的繁殖水平明显高于拟松材线虫。松材线虫和拟松材线虫混合物长时间培养后，松材线虫逐步竞争淘汰拟松材线虫。除此以外，离体培养和体内竞争结果均表明，竞争条件下松材线虫的繁殖力高于非竞争条件。
关键词：松材线蟲；拟松材线虫；繁殖能力
中图分类号：S732文献标识码：A文章编号：1004-3020（2017）05-0027-04Study on the Difference of Offspring Fecundity Between
Bursaphelenchus xylophilus and B.mucronatus Xu Hongmei（1）Wang Yixun（1）Wang Yong（2）
（1.Hubei Forestry AcademyWuhan430075；2.Yingshan County the stataowned forest form WujiashianHuanggang438700）
Abstract： As an alian species Bursaphelenchus xylophilus replaced B.mucronatus gradually.Prelimemary study suggested their fecundity difference was the reason behind. The fecundity of their offspring under competitive and noncompetitive condition was compared. B. xylophilus showed stronger fecundity than B.mucronatus. The mixture of B. xylophilus and B.mucronatus was cultured for a long time， B.xylophilus replaced B.mucronatus gradully.The fecundity of B. xylophilus under competitive condition was stronger than under noncompetitive condition.
Key words：Bursaphelenchus xylophilus；B.mucronatus；fecundity
外来入侵种对当地生物多样性有严重的不良影响，尤其是对于生态系统中占据相同生态位的当地种。松材线虫病在原产地北美地区并未对当地松林资源造成严重危害，但传入日本、中国等亚洲国家后扩展蔓延迅速且形成了严重破坏[13]。拟松材线虫原产地为欧亚地区，在北半球分布极其广泛，包括：中国、芬兰、法国、德国、日本、韩国、俄罗斯和瑞典。拟松材线虫在许多地区并未对松林造成严重危害[4]。
黑松体内同时接种无致病力拟松材线虫和致病性松材线虫与单独接种致病性松材线虫相比，黑松枯萎速度和死亡率都降低，这表明土著种拟松材线虫对外来种松材线虫入侵有一定程度的抑制作用。但是随着松材线虫病不断扩展，外来种松材线虫逐步取代拟松材线虫占据生态位优势[5]。目前关于外来入侵种松材线虫竞争取代本地土著种拟松材线虫的机制仍然不清楚，初步研究表明可能与两种线虫的繁殖能力差异关系密切。
为了研究外来入侵种松材线虫竞争取代本地姊妹种拟松材线虫机制，本研究采取了两种方法研究二者繁殖能力差异：离体条件竞争试验，即在真菌培养基上共培养2种线虫和单独培养2种线虫，然后比较二者繁殖能力；体内竞争试验，2种线虫共同接种到感病寄主上和单独接种到感病寄主上比较二者繁殖能力。
1供试材料与方法
1.1供试线虫来源
虫株来源及编号见表1。各虫株都经过形态学和特异引物扩增详细鉴定，在分类上确认无误。
1.3供试线虫培养
超净工作台上用无菌镊子将保存在冰箱的线虫转移至新鲜的PDA平板-灰葡萄孢上培养，3～5 d后待菌丝被线虫取食完毕放置冰箱备用。将培养好的线虫用无菌水洗出，在10×体视镜下用移液枪挑取线虫。
湖北林业科技第46卷第5期徐红梅，等：松材线虫和拟松材线虫繁殖能力差异研究1.4线虫数量检测
无菌水洗出线虫后，将线虫液稀释至10 mL，充分摇匀后用微量移液器吸取025 mL放置在凹玻片上，在显微镜下计数每个液滴中的线虫数量，重复4次，根据平均值计算10 mL分离液线虫的数量。
1.5离体条件竞争试验
为了确定松材线虫和拟松材线虫在离体条件下的竞争力，在真菌培养基上共培养2种线虫和单独培养2种线虫，然后比较二者繁殖能力。本研究采用中国马鞍山松材线虫（MASBx）和法国拟松材线虫（FrBm）两个虫株开展试验，每个培养组合重复5次。
1.5.1两种线虫混合培养
从培养好的线虫液中挑取50头松材线虫与50头拟松材线虫（雌雄比为1∶1）放置在长满灰葡萄孢的PDA培养基上，25 ℃下培养。10 d后，无菌水洗出各培养皿的线虫，显微镜下检查并计算出线虫总数、雌虫数量、雄虫数量和幼虫数量。
为了观察松材线虫和拟松材线虫的种间竞争长期效果，对混合培养组合进行连续继代培养。培养10 d后，用50 mL无菌水洗出每个培养皿中的线虫得到线虫悬浮液。悬浮液充分混匀后，用100 μL移液枪吸取50 μL线虫悬浮液至新的灰葡萄孢平板上。10 d后重复以上步骤2次直至培养至4代（总共约40 d）。继代培养过程中在显微镜下检查并计算每一代线虫总数、雌虫数量、雄虫数量和幼虫数量。
1.5.2两种线虫单独培养
从培养好的线虫液中挑取100头松材线虫与拟松材线虫（雌雄比为1∶1）分别放置在长满灰葡萄孢的PDA培养基上，25 ℃下培养。10 d后，无菌水洗出各培养皿的线虫，显微镜下检查并计算出线虫总数、雌虫数量、雄虫数量和幼虫数量。
1.6寄主体内竞争试验
为了确定松材线虫和拟松材线虫在寄主植物体内的竞争力，将两种线虫单独和混合接种到感病寄主植物体内观察二者之间的竞争情况。本研究采用中国浙江松材线虫（ZJBx）和中国拟松材线虫（CBm）两个虫株开展试验。感病寄主植物选用2年生马尾松幼苗体。接种采用皮接法：用无菌解剖刀片在2 a生马尾松苗茎中部一侧切开长约05 cm的伤口，伤口深达木质部，在伤口处夹入一小团无菌脱脂棉球，用封口膜将马尾松苗与脱脂棉包扎起来，封口膜外再用透明胶带包成一个小漏斗，将线虫悬浮液0.5 mL滴入脱脂棉，线虫接种量约为3 000条·mL-1，每个处理接种5株，同时以蒸馏水为对照。在接种后的24 h内每隔3 h给脱脂棉滴加适量蒸馏水保湿。接种后，室内温度保持25～30 ℃。观察马尾松幼苗的变化，大约20 d后，接种幼苗产生萎蔫症状后，将马尾松苗从土中拔出，洗净根部后将整株剪碎，用无菌水浸泡洗出线虫，离心收集线虫，显微镜下检查线虫分离情况，计数分离线虫数量。
2结果与分析
2.1离体条件下线虫繁殖力
松材线虫和拟松材线虫在真菌培养基上的繁殖数量见表1。总体来说，无论是单独培养还是混合培养条件下，松材线虫的繁殖数量都显著大于拟松材线虫。混合培养条件下，松材线虫竞争优势十分显著，繁殖数量远远大于拟松材线虫。随着繁殖代数的增加，松材线虫的竞争优势逐步增强，混合培养物中，松材线虫数量逐步增多，而拟松材线虫数量逐步减少。
图5为连续混合培养松材线虫和拟松材线虫40 d时，两种线虫繁殖总数对比图。从中可以看出，随着培养时间的增长，松材线虫的繁殖数量逐步增加，而拟松材线虫则相反，繁殖数量随着混合培养时间的增长逐步递减。从种群竞争角度来看，随着共培养时间的增加，占据竞争优势地位的松材线虫数量逐步增加，而占据劣势地位的拟松材线虫数量逐步减少，直到松材线虫占据了整个生态位。
2.2寄主植物中线虫繁殖力
松材线虫和拟松材线虫在寄主植物中的繁殖数量（见表2）。总体说来，松材线虫和拟松材线虫在寄主植物中的繁殖数量都小于在真菌培养基上。对比松材线虫和拟松材线虫在寄主植物中的繁殖数量可以看出，单独接种条件下拟松材线虫繁殖数量稍微高于松材线虫；混合接种条件下，松材线虫繁殖数量远大于拟松材线虫。由此可以看出，拟松材线虫作为土著种，在松树寄主植物中的繁殖能力并不比外来种松材线虫差；但是随着外来种松材线虫的入侵，拟松材线虫的繁殖数量逐步减少，而松材线虫的繁殖数量逐步增多。
3讨论
本研究通过离体条件竞争试验和体内竞争试验比较竞争和非竞争条件下两种线虫的繁殖能力差异，结果表明，松材线虫的繁殖水平高于拟松材线虫。松材线虫和拟松材线虫混合物长时间培养后，松材线虫逐步竞争淘汰拟松材线虫。除此之外，室内培养和寄主接种结果均表明，竞争条件下松材线虫的繁殖力高于非竞争条件。
参考文献
[1]Khan F A，Gbadegesin R A.On the occurrence of nematode induecd pine wilt disease in Nigeria[J].Pakistan Journal of Nematology，1991（9）：5758.
[2]Mota M M，Braash H，Bravo M A，et a1.First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe[J].Nematology，1999（l）：727734.
[3]葉建仁，黄麟.松材线虫病病原学研究的几个问题[J].中国森林病虫，2012，31（5）：1321.
[4]Kulinich， O.， P.Orlinski.Distribution of conifer beetles （Scolitydae， Curculionidae， Cerambycidae）and wood nematodes （Bursaphenchus） species in the European and Asian Russia[J].EPPO Bulletin， 1998，28：3952.
[5]SiMi LIAO，Satomi KASUGA，Katsumi ToGASHI.Suppressive effects of Bursaphelechun mucronatus on pine wilt disease development and mortality of B.xylophilus-inoculated pine sdddlings[J].Nematology， 2011，13（6）：701712.
（责任编辑：夏剑萍）第46卷第5期
摘要：松材线虫作为外来入侵种，逐步取代拟松材线虫占据生态位。初步研究表明这可能与两种线虫的繁殖能力差异关系密切。本研究采取了两种方法，即离体条件竞争试验和体内竞争试验比较二者繁殖力。结果表明，松材线虫的繁殖水平明显高于拟松材线虫。松材线虫和拟松材线虫混合物长时间培养后，松材线虫逐步竞争淘汰拟松材线虫。除此以外，离体培养和体内竞争结果均表明，竞争条件下松材线虫的繁殖力高于非竞争条件。
关键词：松材线蟲；拟松材线虫；繁殖能力
中图分类号：S732文献标识码：A文章编号：1004-3020（2017）05-0027-04Study on the Difference of Offspring Fecundity Between
Bursaphelenchus xylophilus and B.mucronatus Xu Hongmei（1）Wang Yixun（1）Wang Yong（2）
（1.Hubei Forestry AcademyWuhan430075；2.Yingshan County the stataowned forest form WujiashianHuanggang438700）
Abstract： As an alian species Bursaphelenchus xylophilus replaced B.mucronatus gradually.Prelimemary study suggested their fecundity difference was the reason behind. The fecundity of their offspring under competitive and noncompetitive condition was compared. B. xylophilus showed stronger fecundity than B.mucronatus. The mixture of B. xylophilus and B.mucronatus was cultured for a long time， B.xylophilus replaced B.mucronatus gradully.The fecundity of B. xylophilus under competitive condition was stronger than under noncompetitive condition.
Key words：Bursaphelenchus xylophilus；B.mucronatus；fecundity
外来入侵种对当地生物多样性有严重的不良影响，尤其是对于生态系统中占据相同生态位的当地种。松材线虫病在原产地北美地区并未对当地松林资源造成严重危害，但传入日本、中国等亚洲国家后扩展蔓延迅速且形成了严重破坏[13]。拟松材线虫原产地为欧亚地区，在北半球分布极其广泛，包括：中国、芬兰、法国、德国、日本、韩国、俄罗斯和瑞典。拟松材线虫在许多地区并未对松林造成严重危害[4]。
黑松体内同时接种无致病力拟松材线虫和致病性松材线虫与单独接种致病性松材线虫相比，黑松枯萎速度和死亡率都降低，这表明土著种拟松材线虫对外来种松材线虫入侵有一定程度的抑制作用。但是随着松材线虫病不断扩展，外来种松材线虫逐步取代拟松材线虫占据生态位优势[5]。目前关于外来入侵种松材线虫竞争取代本地土著种拟松材线虫的机制仍然不清楚，初步研究表明可能与两种线虫的繁殖能力差异关系密切。
为了研究外来入侵种松材线虫竞争取代本地姊妹种拟松材线虫机制，本研究采取了两种方法研究二者繁殖能力差异：离体条件竞争试验，即在真菌培养基上共培养2种线虫和单独培养2种线虫，然后比较二者繁殖能力；体内竞争试验，2种线虫共同接种到感病寄主上和单独接种到感病寄主上比较二者繁殖能力。
1供试材料与方法
1.1供试线虫来源
虫株来源及编号见表1。各虫株都经过形态学和特异引物扩增详细鉴定，在分类上确认无误。
1.3供试线虫培养
超净工作台上用无菌镊子将保存在冰箱的线虫转移至新鲜的PDA平板-灰葡萄孢上培养，3～5 d后待菌丝被线虫取食完毕放置冰箱备用。将培养好的线虫用无菌水洗出，在10×体视镜下用移液枪挑取线虫。
湖北林业科技第46卷第5期徐红梅，等：松材线虫和拟松材线虫繁殖能力差异研究1.4线虫数量检测
无菌水洗出线虫后，将线虫液稀释至10 mL，充分摇匀后用微量移液器吸取025 mL放置在凹玻片上，在显微镜下计数每个液滴中的线虫数量，重复4次，根据平均值计算10 mL分离液线虫的数量。
1.5离体条件竞争试验
为了确定松材线虫和拟松材线虫在离体条件下的竞争力，在真菌培养基上共培养2种线虫和单独培养2种线虫，然后比较二者繁殖能力。本研究采用中国马鞍山松材线虫（MASBx）和法国拟松材线虫（FrBm）两个虫株开展试验，每个培养组合重复5次。
1.5.1两种线虫混合培养
从培养好的线虫液中挑取50头松材线虫与50头拟松材线虫（雌雄比为1∶1）放置在长满灰葡萄孢的PDA培养基上，25 ℃下培养。10 d后，无菌水洗出各培养皿的线虫，显微镜下检查并计算出线虫总数、雌虫数量、雄虫数量和幼虫数量。
为了观察松材线虫和拟松材线虫的种间竞争长期效果，对混合培养组合进行连续继代培养。培养10 d后，用50 mL无菌水洗出每个培养皿中的线虫得到线虫悬浮液。悬浮液充分混匀后，用100 μL移液枪吸取50 μL线虫悬浮液至新的灰葡萄孢平板上。10 d后重复以上步骤2次直至培养至4代（总共约40 d）。继代培养过程中在显微镜下检查并计算每一代线虫总数、雌虫数量、雄虫数量和幼虫数量。
1.5.2两种线虫单独培养
从培养好的线虫液中挑取100头松材线虫与拟松材线虫（雌雄比为1∶1）分别放置在长满灰葡萄孢的PDA培养基上，25 ℃下培养。10 d后，无菌水洗出各培养皿的线虫，显微镜下检查并计算出线虫总数、雌虫数量、雄虫数量和幼虫数量。
1.6寄主体内竞争试验
为了确定松材线虫和拟松材线虫在寄主植物体内的竞争力，将两种线虫单独和混合接种到感病寄主植物体内观察二者之间的竞争情况。本研究采用中国浙江松材线虫（ZJBx）和中国拟松材线虫（CBm）两个虫株开展试验。感病寄主植物选用2年生马尾松幼苗体。接种采用皮接法：用无菌解剖刀片在2 a生马尾松苗茎中部一侧切开长约05 cm的伤口，伤口深达木质部，在伤口处夹入一小团无菌脱脂棉球，用封口膜将马尾松苗与脱脂棉包扎起来，封口膜外再用透明胶带包成一个小漏斗，将线虫悬浮液0.5 mL滴入脱脂棉，线虫接种量约为3 000条·mL-1，每个处理接种5株，同时以蒸馏水为对照。在接种后的24 h内每隔3 h给脱脂棉滴加适量蒸馏水保湿。接种后，室内温度保持25～30 ℃。观察马尾松幼苗的变化，大约20 d后，接种幼苗产生萎蔫症状后，将马尾松苗从土中拔出，洗净根部后将整株剪碎，用无菌水浸泡洗出线虫，离心收集线虫，显微镜下检查线虫分离情况，计数分离线虫数量。
2结果与分析
2.1离体条件下线虫繁殖力
松材线虫和拟松材线虫在真菌培养基上的繁殖数量见表1。总体来说，无论是单独培养还是混合培养条件下，松材线虫的繁殖数量都显著大于拟松材线虫。混合培养条件下，松材线虫竞争优势十分显著，繁殖数量远远大于拟松材线虫。随着繁殖代数的增加，松材线虫的竞争优势逐步增强，混合培养物中，松材线虫数量逐步增多，而拟松材线虫数量逐步减少。
图5为连续混合培养松材线虫和拟松材线虫40 d时，两种线虫繁殖总数对比图。从中可以看出，随着培养时间的增长，松材线虫的繁殖数量逐步增加，而拟松材线虫则相反，繁殖数量随着混合培养时间的增长逐步递减。从种群竞争角度来看，随着共培养时间的增加，占据竞争优势地位的松材线虫数量逐步增加，而占据劣势地位的拟松材线虫数量逐步减少，直到松材线虫占据了整个生态位。
2.2寄主植物中线虫繁殖力
松材线虫和拟松材线虫在寄主植物中的繁殖数量（见表2）。总体说来，松材线虫和拟松材线虫在寄主植物中的繁殖数量都小于在真菌培养基上。对比松材线虫和拟松材线虫在寄主植物中的繁殖数量可以看出，单独接种条件下拟松材线虫繁殖数量稍微高于松材线虫；混合接种条件下，松材线虫繁殖数量远大于拟松材线虫。由此可以看出，拟松材线虫作为土著种，在松树寄主植物中的繁殖能力并不比外来种松材线虫差；但是随着外来种松材线虫的入侵，拟松材线虫的繁殖数量逐步减少，而松材线虫的繁殖数量逐步增多。
3讨论
本研究通过离体条件竞争试验和体内竞争试验比较竞争和非竞争条件下两种线虫的繁殖能力差异，结果表明，松材线虫的繁殖水平高于拟松材线虫。松材线虫和拟松材线虫混合物长时间培养后，松材线虫逐步竞争淘汰拟松材线虫。除此之外，室内培养和寄主接种结果均表明，竞争条件下松材线虫的繁殖力高于非竞争条件。
参考文献
[1]Khan F A，Gbadegesin R A.On the occurrence of nematode induecd pine wilt disease in Nigeria[J].Pakistan Journal of Nematology，1991（9）：5758.
[2]Mota M M，Braash H，Bravo M A，et a1.First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe[J].Nematology，1999（l）：727734.
[3]葉建仁，黄麟.松材线虫病病原学研究的几个问题[J].中国森林病虫，2012，31（5）：1321.
[4]Kulinich， O.， P.Orlinski.Distribution of conifer beetles （Scolitydae， Curculionidae， Cerambycidae）and wood nematodes （Bursaphenchus） species in the European and Asian Russia[J].EPPO Bulletin， 1998，28：3952.
[5]SiMi LIAO，Satomi KASUGA，Katsumi ToGASHI.Suppressive effects of Bursaphelechun mucronatus on pine wilt disease development and mortality of B.xylophilus-inoculated pine sdddlings[J].Nematology， 2011，13（6）：701712.
（责任编辑：夏剑萍）第46卷第5期
