A型肉毒毒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β/Smad通路和ERK通路表达的影响

    尚念胜 牛燕英

    

    

    

    [摘要]目的：探讨A型肉毒毒素对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（Human keloid fibroblasts，HKF）生物学行为和TGF-β/Smad信号通路和ERK信号通路表达的影响。方法：在HKF培养过程中加入A型肉毒毒素进行干扰，观察A型肉毒毒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β/Smad通路和ERK通路相关分子的变化及细胞增殖、侵袭、凋亡情况。结果：A型肉毒毒素可以抑制HKF增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，并且明显抑制Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、α-SMA和CTGF基因的表达水平，上调IFN-γ、TGF-β3基因的表达水平。上调Smad7基因和蛋白的表达，下调VEGF基因表达，明显抑制p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平，并且抑制P-ERK1/2蛋白表达。以上生物学变化均且呈药物浓度依赖性。结论：A型肉毒毒素可抑制HKF的增殖、侵袭、血管生成和胶原积累，这些效应与TGF-β/Smad和ERK1/2信号通路有关。

    [关键词]瘢痕疙瘩;A型肉毒毒素;人瘢痕疙瘩成纤维细胞;ERK信号通路;TGF-β/Smad通路;细胞增殖;细胞迁移;细胞侵袭

    [中图分类号]R619+.6 ? ?[文献标志码]A ? ?[文章编号]1008-6455（2020）05-0104-06

    Abstract： Objective ?To investigate the effects of botulinum toxin type A on the biological behavior of human keloid fibroblasts （HKF） and the expression of TGF-β/Smad and ERK signaling pathways. Methods ?Botulinum toxin type A was added to HKF culture to interfere with the changes of TGF-β/Smad pathway and ERK pathway related molecules， cell proliferation， invasion and apoptosis of keloid fibroblasts. Results ?Botulinum toxin type A could inhibit the proliferation， migration and invasion of HKF， promote apoptosis， and significantly inhibit the expression levels of collagen type Ⅰ， collagen type Ⅲ， fibronectin， α-SMA and CTGF genes， and up-regulate the expression levels of IFN-γ and TGF-β3 genes. Botulinum toxin type A can significantly up-regulate the expression of Smad7 gene and protein in TGF-β/Smad pathway， down-regulate the expression of VEGF gene， significantly inhibit the expression of p-Smad2 and p-Smad3 protein， and inhibit the expression of P-ERK1/2 protein. The above biological changes were dose-dependent. Conclusion ?Botulinum toxin ?type A can inhibit the proliferation， invasion， angiogenesis and collagen accumulation of HKF in a dose-dependent manner. These effects are related to TGF-β/Smad and ERK1/2 signaling pathways.

    Key words： keloid; botulinum toxin type A; human keloid fibroblasts; ERK signaling pathway; TGF-β/Smad pathway; cell proliferation; cell migration; cell invasion

    瘢痕疙瘩是整形外科难治性疾病之一，既影响了皮肤外观和功能，也给患者带来极大痛苦[1]。目前，瘢痕疙瘩的发病机制尚未明了，临床上多采用局部药物治疗、手术和激光治疗等综合措施，但是效果不甚理想[2]。A型肉毒毒素治疗增生性瘢痕的效果较好，但是其治疗机制尚未明确，可能与抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和促进凋亡有关[3-5]。TGF-β/Smad信号通路可参与瘢痕疙瘩的形成[6]。细胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）是傳递丝裂原信号的信号转导蛋白，可参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建等多种生物学反应[7]。ERK信号通路同样在调节瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学行为中有重要作用[8]。本研究以人瘢痕疙瘩成纤维细胞（Human keloid fibroblasts，HKF）为研究对象，检测了A型肉毒毒素干预后HKF的增殖、凋亡、迁移和TGF-β/Smad信号通路及ERK信号通路表达水平的变化，旨在探讨A型肉毒毒素治疗瘢痕疙瘩的机制。

    1 ?材料和方法

    1.1 细胞及培养：HKF购于上海雅吉生物科技有限公司，含10%胎牛血清的DMEM-1640培养液（上海恒斐生物科技有限公司）进行培养，条件为37℃、5% CO2。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞活力测定：细胞计数试剂盒购于上海新睿生物有限公司。HKF（1×104个/ml）接种于96孔板中，培养24h。不同剂量（1×106/ml细胞分别加入肉毒毒素0μl、1.0μl和2.5μl）A型肉毒毒素（使用时稀释为50U/ml，兰州生物制品研究所）干预1d、2d、3d、4d和5d后，每孔加入10μl CCK-8，培养2.5h。微孔板阅读器（芬兰雷勃公司）450nm处读取吸光度。

    1.2.2 流式细胞术检测凋亡：Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于艾美捷科技有限公司。HKF（2×105个/孔）接种于6孔板中，培养24h。不同剂量A型肉毒毒素干预72h后，300×g室温离心5min，收集各孔HKF，冷PBS洗涤两次。将细胞重悬在500μl缓冲液中，加入10μl碘化丙啶，反应10min;冰浴冷却终止反应。流式细胞仪（美国BD公司）检测细胞凋亡情况，CellQuest软件定量分析细胞凋亡率。

    1.2.3 RT-PCR法检测mRNA相对表达量：Trizol法提取细胞总RNA，逆转录后进行RT-PCR检测。引物序列来自上海生物工程有限公司。RT-PCR反应条件为：预变性95℃ 30s;95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。以GAPDH为内参，-△△CT法计算mRNA相对表达量。

    1.2.4 细胞划痕试验：HKF接种于6孔板中，当细胞融合100%时，移液枪头沿板底划一字型划痕，换无血清培养基培养24h、48h。显微镜下拍摄图片，Image Pro Plus 6.0软件分析细胞迁移情况。细胞迁移率=（1-测量时划痕宽度/初始划痕宽度）×100%。

    1.2.5 免疫荧光染色法检测I型胶原、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ki-67：HKF接种于6孔板中，培养24h。A型肉毒毒素干预72h后，4%多聚甲醛固定，4℃过夜。0.3% Triton X-100室温处理1h，山羊血清（美国Sigma）37℃阻断非特异性结合位点30min。HKF与兔抗人抗体4℃孵育过夜，抗体稀释浓度为I型胶原（1：500）、α-SMA（1：100）和Ki-67（1：1 000）（美国ABCAM）。加入荧光山羊抗兔抗体（美国Sigma）孵育1h，DAPI染色，荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）拍摄图像。

    1.2.6 Western-bolt检测蛋白表达水平：取细胞上清液，加入蛋白裂解液，冰上裂解25min，15 000r/min离心15min。加入SDS缓冲液煮沸5min使蛋白变性。经SDS-PAGE后蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h，孵育一抗，4℃过夜，弃去一抗，TBST洗膜3次，每次5min。室温孵育二抗2h，弃去二抗，TBST洗膜3次，每次5min。ECL显色，以GAPDH作为内参，计算目标蛋白条带与GAPDH灰度比值。

    1.2.7 Transwell小室检测细胞侵袭能力：用无血清培养液将HKF调整至2×105个/ml，取0.2ml到Transwell小室（上海生工），室下加入10%胎牛血清0.5ml，培养4h。待贴壁后更换上室培养液，培养24h，拭去小室滤膜上的细胞，PBS洗涤，甲醛固定15min，HE染色，统计膜背面侵袭的细胞数。细胞侵袭能力=穿膜细胞穿过滤膜的细胞数/相应孔细胞数。

    1.3 统计学分析：采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。正态计量数据用“x?±s”表示，组间比较采用单因素方差分析;重复测量资料采用重复测量资料方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

    2 ?结果

    2.1 A型肉毒毒素抑制HKF增殖：CCK-8检测结果表明，1.0μl组和2.5μl组均可抑制HKF增殖能力，且2.5μl组较1.0μl组强，差异有统计学意义（P<0.05），见图1A。免疫荧光染色结果表明，1.0μl组和2.5μl组Ki-67表达水平明显低于0μl组，且2.5μl组较1.0μl组水平更低，差异均有统计学意义（P<0.05），见图1B、D。用1.0μl和2.5μl A型肉毒毒素干预后，HKF密度明显降低，且2.5μl组更低（P<0.05），见图1C。说明A型肉毒毒素可以明显抑制HKF增殖，且浓度越高，抑制作用越強。

    2.2 A型肉毒毒素促进HKF凋亡：流式细胞术检测结果，A型肉毒毒素可明显促进HKF凋亡，且药物浓度越高促进凋亡的能力越强（P<0.05）。见图2。

    2.3 A型肉毒毒素减少胶原蛋白和细胞外基质积累：A型肉毒毒素可以明显抑制Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、α-SMA和CTGF基因的表达，上调IFN-γ、TGF-β3基因的表达，且2.5μl的作用比1.0μl强（P<0.05），见图3A。免疫荧光检测结果显示，A型肉毒毒素干预后表达水平下降，且2.5μl组最为明显（见图3B）。Western-blot法检测结果表明，2.5μl组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白表达明显低于1.0μl组（见图3C）。

    2.4 A型肉毒毒素抑制HKF迁移：A型肉毒毒素可以抑制HKF迁移，且药物浓度越高，抑制作用越强（P<0.05）。见图4。

    2.5 A型肉毒毒素抑制HKF侵袭：A型肉毒毒素可以明显抑制HKF侵袭，且药物浓度越高，抑制作用越强（P<0.05），见图5A、C。RT-PCR检测发现，A型肉毒毒素可以抑制MMP-1和MMP-3的mRNA表达水平，且2.5μl组比1.0μl更低（P<0.05），见图5B。

    2.6 A型肉毒毒素对TGF-β/Smad通路和ERK通路的影响：A型肉毒毒素可以抑制TGF-β1、VEGF、PAI-1基因表达，上调Smad7，且呈药物浓度依赖性。Western-blot检测结果表明，A型肉毒毒素可以明显抑制p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平，并且抑制了p-ERK1/2蛋白表达，Smad7蛋白表达上调，三组Smad 2/3总蛋白和T-ERK 1/2总蛋白的比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。