蔓荆子、龙胆、何首乌三种植物复合提取物治疗头皮脂溢性皮炎效果研究
卢伊娜 寻伟 田军
[摘要]目的：通过研究由蔓荆子﹑龙胆﹑何首乌根三种植物活性成分组合而成的植物复合提取物（VGP）对头皮脂溢性皮炎的拮抗作用，来探讨天然植物在头皮护理中的作用。方法：角质形成细胞在糠秕马拉色菌、过氧化氢诱导下，加入不同浓度的VGP、木犀草素、白藜蘆醇分别处理24h后，收集上清液ELISA法检测白介素6（IL-6）﹑前列腺素E2（PGE2）的表达。总共招募25例具有头皮脂溢性皮炎患者，使用调理期洗发水测试2周后，再使用含0.5% VGP的测试期洗发水，每周2～3次清洗患处，通过检测头皮油脂含量、经表皮水分流失（TEWL），专家评价或患者主观评价头皮红肿程度、头屑程度，来评价洗发水的功效。结果：在角质形成细胞炎症模型上，VGP在质量分数0.01%～0.125%内能剂量依赖性地抑制IL-6﹑PGE2的表达，且相同浓度下VGP的抗炎效果强于木犀草素和白藜芦醇。对头皮脂溢性皮炎患者，VGP可明显缓解头皮红肿、头屑、头痒问题，降低头皮油脂含量和TEWL值。结论：VGP作为一种天然来源的具有抗炎止痒功效的活性原料，可缓解头皮脂溢性皮炎引起的各种头皮问题。
[关键词]植物复合提取物;头皮脂溢性皮炎;马拉色菌;过氧化脂质;抗炎;白介素6;前列腺素E2
[中图分类号]R758.73+2? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2021）01-0077-05
Effect of Vitex Trifolia，Gentiana Scabra and Polygonum Multiflorum Compound Extracts（VGP） on Seborrheic Dermatitis of Scalp
LU Yi-na，XUN Wei，TIAN Jun
（Shanghai JAKA Biotech. Co.， Ltd.，Shanghai 200241，China）
Abstract： Objective? To study the antagonistic effect of a multi-herb extraction （VGP） on the inflammation of seborrheic scalp which consists of Vitex trifolia，Gentiana scabra and Polygonum multiflorum root extract. Methods? The keratinocytes stimulated by Malassezia furfur and hydrogen peroxide respectively were treated with different concentrations of VGP， luteolin and resveratrol for 24h. The extracellular expressions of interleukin-6 （IL-6） and prostaglandin E2 （PGE2） were detected by ELISA. Total 25 Subjects suffered by seborrheic scalp problems were recruited to test VGPs effect with a two weeks recuperation period using vehicle shampoo， and a four weeks test period using test shampoo containing 0.5% VGP， 2-3 times per week. The sebum content and the trans-epidermal water loss （TEWL） were detected by CK multi-probes. And the degree of dandruff， itching and redness were evaluated by questionnaire survey and experts evaluation. Results? On the model of NHEK cell inflammation induced by M. furfur and H2O2， VGP can inhibit the expression of IL-6 and PGE2 in a dose-dependent manner under 0.01% to 0.125% concentration， stronger than luteolin and resveratrol. During 4 weeks treatment， VGP reduced the sebum content and TEWL， improved the redness， itching and dandruff on human scalp skin. Conclusion? VGP as a natural active ingredient can relieve various scalp problems caused by seborrheic scalp through anti-inflammation.
Key words： VGP; seborrheic dermatitis of scalp; M.furfur; lipid peroxide; anti-inflammation; IL-6; PGE2
头皮作为人体皮肤最薄的部分之一，加之毛囊皮脂腺等皮肤附属器官的高密度分布，使得紫外线（UV）﹑污染物（PM 2.5）等易对皮肤结构造成损伤，引发皮肤炎症，如头屑﹑红斑﹑小疙瘩、灼热刺痛、瘙痒等[1-2]。头皮脂溢性皮炎正是由于皮脂腺分泌过多的油脂，导致头皮炎症产生、微环境破坏而发生的一类常见头皮疾病[3]。头皮屑及头皮脂溢性皮炎患者与正常人群相比，其脂质含量显著增加，马拉色菌数量显著增高，且随着炎症程度的加重，检出的马拉色菌孢子数增多[4-5]。
针对头皮脂溢性皮炎，目前的治疗手段包括抗生素类、激素类[6-7]，由于耐药性和依赖性的局限，植物提取物逐渐应用于临床治疗。已有研究表明[8]，很多种植物提取物均对马拉色菌的生长有抑制效果，同时兼有抗氧化的功效，但少有植物提取物抑制馬拉色菌和脂质过氧化物诱导头皮炎症的研究。前期通过筛选30余种植物提取物及20余种按不同比例组合的植物复合提取物，发现由蔓荆子（Vitex trifolia）提取物﹑龙胆（Gentiana scabra）提取物和何首乌（Polygonum multiflorum）根提取物组成的植物复合提取物（VGP）具有显著的抗炎作用。基于此，本研究以马拉色菌灭活培养液和过氧化氢（H2O2）作为刺激物，诱导角质形成细胞产生炎症，同时招募头皮脂溢性皮炎患者来探讨VGP的抗炎、止痒、去屑、控油作用，为植物复合提取物在拮抗头皮脂溢性皮炎中提供新思路。
1? 材料和方法
1.1 实验试剂与仪器
1.1.1 主要试剂：VGP溶液（上海珈凯生物科技有限公司），由蔓荆子（Vitex trifolia）、龙胆（Gentiana scabra）、何首乌（Polygonum multiflorum）根三种提取物依照特殊工艺复配而成，其中主要活性物木犀草素和白藜芦醇的含量经HPLC方法检测后分别为0.15%和0.1%。糠秕马拉色菌（M.furfur，ATCC 44344，北京中科质检公司）﹑Leeming and Nortman（LAN）培养基（北京中科质检公司），人角质形成细胞（NHEK，来源于ATCC，苏州北纳创联公司），DMEM高糖培养基（美国Thermo Fisher公司），胎牛血清（FBS，美国Thermo Fisher公司），青霉素-链霉素（PS，美国Thermo Fisher公司），噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司），H2O2（国药集团），ELISA检测试剂盒（深圳欣博盛公司）。
1.1.2 主要仪器：倒置显微镜（德国Leica公司），生物安全柜（美国Thermo Fisher公司），MultiSkan FC酶标仪（美国Thermo Fisher公司），切片机（英国珊顿公司），SM815油脂测试探头（德国CK公司），VapoMeter皮肤水分散失测试探头（丹麦Delfin公司）。
1.2 方法
1.2.1 炎症刺激物制备：M.furfur用LAN培养基在37℃需氧条件下培养48h，于酶标仪620nm处检测吸光度，根据标准曲线计算菌液终浓度后，再于85℃热灭活30min，即为诱导细胞产生损伤及炎症的初始菌液[9]。此菌液的浓度为5×108～8×108CFU/ml。30%浓度的H2O2用培养基稀释成1mol/L备用。通过测试不同浓度菌液或H2O2（用培养基稀释）处理24h后细胞活性和炎症因子表达量的变化，确定最终的使用浓度。
1.2.2 NHEK细胞活性和炎症因子表达量检测：木犀草素（Lut）或白藜芦醇（Res）分别用二甲亚砜（DMSO）配置成0.15%或0.1%的浓度。参照文献[10]，将含10% FBS﹑1% PS的DMEM高糖培养基培养至指数增长期的NHEK细胞以2×104个/孔接种于96孔板中培养24h，弃去培养液后再加入180μl用培养基稀释成不同质量分数的VGP溶液、Lut溶液或Res溶液，同时设置DMEM培养基为阴性对照。加入或不加入20μl菌液（终浓度为0.75×108CFU/ml）或H2O2（终浓度为0.5mmol/L），于37℃继续孵育24h。下层细胞用MTT法检测细胞活力，上层培养液收集至96孔板中，按照ELISA试剂盒的说明书分别检测IL-6和PGE2的表达量（E），抑制率=（1-EVGP溶液/E刺激物）×100%。
1.2.3 重组皮肤模型细胞活性和炎症因子表达量检测：参照文献[11]，取10μl用培养基稀释成不同质量分数的VGP溶液均匀涂抹于Episkin重组皮肤模型表面，同时设置DMEM培养基为阴性对照。30min后，再取10μl菌液（终浓度为5×108CFU/ml）或H2O2（终浓度为100mmol/L）涂抹于皮肤模型表面，于37℃继续孵育42h。用MTT法检测细胞活力，同时皮肤组织切片用HE染色观察结构变化。上层培养液收集至96孔板中，按照ELISA试剂盒的说明书分别检测PGE2、IL-8和LTB-4的表达量（E），抑制率=（1-EVGP溶液/E刺激物）×100%。
1.2.4 头皮脂溢性皮炎患者筛选：招募25例头皮脂溢性皮炎患者，其中头皮屑症状严重者5例，头皮红肿症状严重者8例，头痒症状严重者12例，年龄25～60岁，其中男性8例，女性17例。入选标准包括：①患者过去至少3个月内连续出现中度及以上程度的头皮瘙痒、头皮屑、头皮红肿等症状;②头发长度≥3cm，无严重脱发，发根生长覆盖至少70%头皮;③招募期和调理期结束头皮屑等级≥3级或红肿等级≥3;④身体健康、无疾病。
1.2.5 调理期及测试期检测：整体周期为6周，检测期间温度为（22±1）℃，相对湿度为（50±5）%。前调理期两周使用不含VGP的调理期洗发水，测试期4周使用含0.5% VGP的测试期洗发水，每周洗3次，每次按摩头皮至少1min后冲洗干净。分别在调理期、测试期定期追踪，记录患者头屑程度、头皮红肿程度、头皮瘙痒程度和头皮出油程度，使用前、调理期、测试期第2周、测试期第4周分别计为T0、T2、T4、T6。将头皮分为12个区域，专家评价员在每个时间点选择头屑最严重的4个区域采用“ASFS评分标准”进行评估，选择红肿、出油最严重的4个区域采用0～5分的评分标准进行评估，患者通过问卷调查的形式主观评价头皮瘙痒症状的改善情况。同时，采用VapoMeter检测TEWL值，Sebumeter SM815检测油脂含量，并采集照片进行对比分析[12-13]。
1.2.6 统计学分析：采用GraphPad Prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析。P<0.05认定为差异有统计学意义，以“*”标记;P<0.01认定为差异极其显著，以“**”标记。
2? 结果
2.1 NHEK细胞活性及炎症因子的变化：不同质量分数的VGP处理NHEK细胞24h后，MTT法检测细胞活性发现，0.25%的VGP使NHEK的细胞活性降为30.58%，具有细胞毒性，而0.125%以下浓度的VGP并未对细胞活性产生影响。在M.furfur诱导下，NHEK细胞炎症因子表达量的变化如图1A～B所示，IL-6的表达量从20.57?g/ml升至36.77?g/ml，PGE2的表达量从945.85?g/ml升至1 228.35?g/ml。而VGP处理组，IL-6和PGE2的表达量呈现剂量依赖性的下降趋势，抑制率在0.125%浓度时达到最大，显著强于同等浓度的Lut或Res。0.5mmol/L的H2O2溶液刺激NHEK细胞后，IL-6和PGE2的表达量与M.furfur相比更多，可分别达到53.4?g/ml和3 589.3?g/ml（见图1C～D）。同样，VGP处理组IL-6和PGE2的表达量也显著性下降，0.125%浓度的下降幅度也强于同等浓度的Lut或Res。
2.2 重组皮肤模型表皮结构及炎症因子的变化：高浓度M.furfur对3D重组皮肤模型Episkin的细胞活性和炎症因子表达量基本无影响。100mmol/L的H2O2处理Episkin皮肤模型42h后，MTT法检测的细胞活性与对照组相比降至82.66%，HE染色的结果也显示表皮基底层的细胞间隙变大，细胞数量也减少（见图2A～B）。与H2O2组相比，0.5%和2%的VGP处理皮肤模型后，基底层细胞间间隙和细胞数量明显改善（见图2C～D）。
对各种炎症因子进行检测，发现H2O2处理组LTB-4的表达量从9.71?g/ml上升至53.7?g/ml，PGE2的表达量从83.98?g/ml上升至184.0?g/ml。质量分数为0.25%～2.0%的VGP同时处理皮肤模型42h后，LTB-4和PGE2的表达量与H2O2组相比，呈现剂量依赖性的下降趋势（见图3）。
2.3 头皮脂溢性皮炎患者油脂含量和TEWL变化：招募25例头皮脂溢性皮炎患者，经过调理期筛选，最终测试者17例，其中头皮屑症状严重者5例，头皮红肿症状严重者8例，头痒症状严重者10例。首先通过仪器分析头皮油脂含量（见图4A）和TEWL（见图4B）的变化情况。调理期（T2）与使用前（T0）相比，TEWL值变化不明显，油脂含量稍有增加，与T0比较差异无统计学意义（P>0.05）。而经过4周的测试期（T4、T6），油脂含量从71.91?g/cm2降至43.54?g/cm2，减少了39.45%，具有显著性差异（P<0.05）。TEWL也从18.6g/hm2降至16.14g/hm2，减少了13.23%。
2.4 头皮脂溢性皮炎患者主观评价指标变化：结果如表1所示，调理期（T2）与使用前（T0）相比，头皮红肿、头屑、瘙痒评分均无明显改善，而经过4周的测试期（T4、T6）后，头皮红肿、头屑、瘙痒评分均呈现下降趋势，特别是使用4周后，红肿、头屑、瘙痒评分分别从2.31、1.98、3.20降至0.75、0.47和1.75，从轻微到中度症状缓解至不明显症状。整个测试期间，患者均未出现不适症状。满意度调查（1～7分）结果显示，产品的温和性评分达到6.0±1.0，用完后愉悦感评分达到5.7±1.1，同时对头屑、头痒、炎症的缓解评分为5.5±0.9。
2.5 头皮脂溢性皮炎患者的外观变化：如图5所示，使用前患者头皮B区可见多数头屑，调理期仍可见多数头屑，使用含0.5% VGP的洗发水2周后，头屑变少，从大片头屑变成细小头屑，使用4周后头屑基本消失。测试结束后2周再次随访，患者头屑症状并无反复。
如图6所示，使用前患者头皮Ⅰ区可见明显红肿，调理期红肿未有改善，使用含0.5% VGP的洗发水2周后，红肿逐渐消退，炎症缓解，使用4周后红肿基本消失。且在之后的随访中，红肿现象也未反复。
3? 讨论
头皮的特殊解剖结构，包括大量的终毛毛囊，以及毛囊漏斗部衍生结构大大增加了头皮表皮的面积，这也贡献了比其他皮肤部位更高速的角质层剥脱速率和头皮油脂含量。由此头皮常会出现头屑、头油、头皮瘙痒、发红等问题[14]。头皮脂溢性皮炎的病因与雄激素相关的皮脂分泌增多、马拉色菌的定植以及炎症反应有关。目前的临床治疗方式主要是外用抗真菌药物、皮质类固醇激素药物，含中草药的洗发产品由于来源天然、刺激性较小、无激素依赖性，也逐渐应用于脂溢性皮炎的辅助治疗[15-16]。
引发头皮炎症的物质主要有两类，一是皮脂中的角鲨烯﹑甘油三酯﹑不饱和脂肪酸本身过氧化后产生的各种过氧化物，如角鲨烯过氧化物、丙二醛等;二是马拉色菌分解脂质产生的促炎性不饱和脂肪酸，包括油酸﹑亚油酸等[17]。这些物质渗透入角质形成细胞﹑单核细胞﹑肥大细胞等产生细胞毒性，并激活下游信号途径，促进炎症因子如花生四烯酸（LTB-4）﹑白介素（IL）-1α﹑前列腺素E2（PGE2）﹑IL-6﹑IL-8﹑肿瘤坏死因子（TNF）-α﹑IL-10等的表达[18-19]，导致皮肤屏障功能改变，最终产生各种头皮问题。
本研究选择M.furfur培养液[20]和H2O2溶液[21]作为头皮炎症的刺激物，来诱导角质形成细胞和3D重组皮肤模型产生炎症。结果发现M.furfur培养液和H2O2均能促进角质形成细胞、Episkin皮肤模型炎症介质IL-6、PGE2、LTB-4的表达，证实了马拉色菌和过氧化物可对皮肤表皮层造成损伤。而IL-6﹑PGE2﹑IL-8﹑LTB-4等炎症因子又可作用于皮肤C类神经纤维上的各类受体，传导痒觉﹑痛觉[22]，造成脂溢性頭皮过度感知瘙痒、疼痛。植物复合提取物VGP主要成分为蔓荆子、龙胆、何首乌根，现代药理学研究表明蔓荆子、龙胆有抗氧化、抗炎、解热镇痛等作用[23-24]，何首乌根具有抗衰老、抗炎、抗氧化、乌发黑发等作用[25]。在体外的炎症模型上，结果显示VGP可显著降低M.furfur诱导的角质形成细胞IL-6﹑PGE2炎症因子的表达量，改善高浓度过氧化物诱导的表皮层细胞间隙增大、细胞活性下降，并抑制LTB-4、PGE2等炎症因子的表达，发挥良好的抗炎功效。较高浓度的木犀草素对角质形成细胞的炎症有一定抑制效果，而白藜芦醇的主要作用为抗氧化，抗炎效果不强。同等浓度下，VGP的抗炎效果要强于木犀草素和白藜芦醇，说明复合植物可针对不同的靶点，覆盖更广的信号通路，来发挥更强的生物学功效。
临床测试初期，招募25例头皮脂溢性皮炎患者，通过2周调理期排除了8例临床症状不明显且不持久的患者。综合数据来看，与使用前相比，调理期除油脂含量稍有增加外，17例患者的其余指标都未发生明显改变，说明入选患者的炎症、头屑、微环境改变是长期存在的。进一步分析不同年龄段、不同性别患者的油脂含量发现，25～40岁患者调理期的油脂含量从53.43?g/cm2上升至67.39?g/cm2，而41～55岁的患者油脂含量基本无变化，说明此阶段油脂含量的升高可能与生活习惯、洗发水等有关。在使用含0.5% VGP的洗发水测试2周后，患者的油脂含量、TEWL值与调理期相比，均有显著降低，头皮炎症症状包括红肿、头屑、瘙痒的主观评分也有显著下降。在使用4周后，患者的头皮状态基本恢复正常，其中红肿评分降低幅度最大，头屑评分、油脂含量、瘙痒评分次之。头皮照片显示，患者的头屑程度、红肿程度，在使用产品两周后就有显著降低，使用4周后进一步改善，且未复发。整个测试过程中，无1例不良反应发生。产品的温和性、清洗能力、使用后感受、整体使用感均达到5分以上，为正面态度。
综上所述，VGP作为一种新型的植物复配组合物，具有良好的体外抗炎、抗氧化功效，较低量添加入洗发水即可抗炎止痒、修复头皮屏障，能很好地改善脂溢性皮炎的头皮瘙痒、头屑和皮脂溢出，而且耐受性良好，可应用于头皮护理及护肤类产品中。
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