食源性致病微生物阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒的研究

    万宇平 马玉华 贾芳芳 王琳琛

    食品安全问题一直是社会各界关注的重点。世界卫生组织曾报道称，食源性疾病是受全球关注的卫生问题，更是影响人类健康的重要因素，而病原微生物感染则是导致食源性疾病发生的主要因素。阪崎肠杆菌在2002年被国际食品微生物标准化委员会（ICMSF）确定为食源性致病菌，如被阪崎肠杆菌感染可能会引起婴幼儿尤其是新生儿患病，如脑膜炎、菌血症及坏死性小肠结肠炎等，更有甚者会引起严重的后遗症或死亡。有数据显示，目前只有婴幼儿奶粉与这一疾病的爆发相关。

    传统的致病微生物检测方法有国标法和纸片法，但因操作复杂且测试周期过长，其已经无法跟上经济发展的步伐，不能满足我国快速发展的食品行业对食品检测工作的需求。因此，建立一种在婴幼儿奶粉中快速、高效、灵敏的检测阪崎肠杆菌的方法至关重要。

    本研究是一种基于环介导等温扩增技术而开发的快速检测食品中阪崎肠杆菌的方法。环介导等温基因扩增技术（Loop Mediated Isothermal Amplification，以下简称“LAMP法”）是日本荣研株式会社研究发明的核酸等温扩增方法，其利用4个特殊的引物特异识别靶基因的6个特定区域，采用具有强链置换活性的BstDNA聚合酶，实现在恒温条件下的体外扩增。本研究根据阪崎肠杆菌的16-23S基因设计了6条引物，并将其与目的基因的6个区域相结合，具有特异性强、灵敏度高的优点。本试剂盒能在60min内完成扩增反应，且技术要求低，具有快速、简便等优点，能有效解决传统检测方法耗时长、结果可靠性差等问题，适合各级实验室及基层单位推广使用。

    1 材料与方法

    1.1 材料与仪器

    引物、DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、Buffer缓冲液、显色剂、DNA提取液。

    PCR扩增仪。

    1.2 环介导等温基因扩增反应体系

    1.2.1 制备环介导等温基因扩增反应体系

    6条引物分别如下：内引物1为5 -TAGCCAACCGATGTTTCTGTATCAAACAATACTACAAAGGTGCTTTCG-3（SEQ ID No.1）；内引物2为5-AGAAGTCATTAGCGAACAGGCTACGCGTAAGATTCTTGCTCAGTAG -3（SEQ ID No.2）；外引物1为5-GTGAGAACGGGACCATCA -3（SEQ ID No.3）；外引物2为5- CTTGTTTTTGTAGGGTTTGGA-3（SEQ ID No.4）；环引物1为5-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG- 3（SEQ ID No.5）；环引物2为5-GATTAGCACGTCCTTCATCG- 3（SEQ ID No.6）。

    DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μL；dNTP：浓度为25mM；MgSO4：浓度为50mM；Buffer缓冲液：10×buffer；显色剂：荧光染料1000×SYBR Green I；DNA提取液。

    1.2.2 鉴定阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌

    本实验所述待检样品为添加阪崎肠杆菌的奶粉样本。

    模板DNA提取：将1mL的样本置于1.5mL离心管；12000r/min离心2min，弃上清；然后加入DNA提取液80μL，煮沸10min；最后离心取上清液转移至另一支离心管中作为模板DNA。

    环介导等温基因扩增反应：在200μL PCR管配制反应体系，外引物终浓度为0.2μM，内引物、环引物终浓度为0.6μM，1×buffer反应缓冲液，3mM MgSO4，0.5mM dNTP，8U Bst DNA聚合酶，样本模板2.5μL，超纯水补足25μL，然后加入30μL的密封液，将上述反应管于65℃反应60min。

    结果判定：在上述反应管中加入1μL 1000×SYBR Green I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为阪崎肠杆菌，橙色则为非阪崎肠杆菌。

    检测结果：PCR管呈现绿色，表明待检样品所感染的致病菌为阪崎肠杆菌。

    1.3特异性与灵敏度

    1.3.1检测材料及方法

    菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 6538、单增李斯特菌CMCC（B） 54002、副溶血性弧菌 ATCC 17802、福氏志贺氏菌CMCC（B） 51572、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、阪崎肠杆菌CMCC 45410、阴沟肠杆菌CMCC45301、赫氏艾希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌O157 H7 ATCC 43888、大肠埃希氏菌25922、威氏李斯特CICC21672、绵羊李斯特CICC21633、格氏李斯特CICC21670。

    食品样本：幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干。

    检测方法：对各个样本的检测严格按照说明书进行操作，同时与国标方法GB 4789.40-2010进行对比。

    2 结果与分析

    2.1 特异性

    对常见食源性致病菌菌株及同源性高的菌株提取基因組DNA（按说明书制备基因组DNA），采用核酸检测试剂盒进行单一和交叉污染检测，每个样品均进行2次重复检测，并同时设立检测试剂盒的阴性和阳性对照。（见表1）

    结果显示，仅含阪崎肠杆菌的样品显示阳性结果，其余样品均为阴性，表明该试剂盒具有高度特异性。

    2.2 灵敏度

    纯菌灵敏度（CFU/mL）：取计数后菌液进行梯度稀释（100μL菌液+900μL超纯水），按说明书提取DNA模板。取不同浓度梯度测试，每个梯度作两个平行。

    实际样本灵敏度[CFU/25g（mL）]：取计数后菌液进行梯度稀释（100μL菌液+900μL超纯水），分别取约≥10CFU、<10CFU稀释液进行样本添加，置于均质袋内，按国标方式培养后，取200μL培养液上清提取模板检测。

    2.2.1纯菌灵敏度（见表2）

    结果显示：纯菌灵敏度数量级为102，但大量实验结果证实，由于模板提取、稀释误差等原因，灵敏度数量级可能为103。因此，纯菌灵敏度约为102～103CFU/mL。

    2.2.2实际样本灵敏度（见表3）

    结果显示，实际样本的灵敏度均可达到≤10CFU/25g，个别样本灵敏度试剂盒方法高于国标方法。

    2.3 批间、批内差（“+”为阳性、“-”为阴性）

    以婴幼儿配方奶粉为样本，进行不同量的阳性菌添加（无添加、≥10CFU、<10CFU）并制备成不同浓度的样品，每个样品作3个平行，3次重复，测试3批检测试剂，同时设立阴阳对照组。（见表4）

    根据实验结果，按照公式计算，试剂盒的批内差为0%，批间差为0%，说明试剂盒稳定性较好。

    2.4 国标符合率

    以婴幼儿配方奶粉、奶片、营养快线、钙奶饼干、米粉为样本，使用不同浓度阳性菌进行样本添加，采用核酸检测试剂盒与国标方法同时进行检测，比较两种方法的检测结果，每个检测样本进行3个重复检测，同时设立试剂盒的阴性对照和阳性对照。（见表5）

    结果显示，不同样本的检测结果与国标一致。因此，试剂盒检测方法与国标检测方法的符合率为100%。

    3 验证评价

    验证实验表明，北京勤邦生物技术有限公司研发的阪崎肠杆菌核酸检测方法简单、快捷，不需要大型仪器设备；纯菌检测灵敏度为102～103CFU/mL，实际样本灵敏度均可达到≤10CFU/25g，试剂盒具有较高特异性，产品批内及批间无明显差异，实际样本检测国标符合率为100%。