纳米金的绿色合成及其在维生素C比色分析中的应用
张源 翟江丽 李繁麟 郭平 闫昕
摘 要 以梨汁为还原剂和保护剂，还原氯金酸一步法合成纳米金（AuNPs），采用透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）对其进行了表征。 与以柠檬酸钠为还原剂制备的AuNPs相比較，梨汁制备的AuNPs稳定性更好。以梨汁绿色合成的AuNPs作为晶种和催化剂，维生素C（Vc）还原AgNO3产生的银沉积在AuNPs表面，形成Ag/AuNPs，导致溶液颜色变化及在432 nm处吸光度变化，基于此实现Vc的定性与定量分析。考察了AgNO3浓度、pH值和反应时间等因素对Vc检测的影响。在最优实验条件下，当Vc浓度为0.8 mg/L时，裸眼观察到溶液颜色明显发生变化，随着Vc浓度的增大，溶液颜色由紫红色变为黄褐色;溶液在432 nm处吸光度（A432）与Vc浓度在0.4～40 mg/L和40～80 mg/L 范围内呈良好的线性关系，检出限为0.17 mg/L（S/N=3），RSD为1.6% （n=8， CVc=8 mg/L），方法的选择性和特异性良好。将此方法用于Vc片中Vc含量的分析，回收率在89.5%～110.0%之间。
关键词 梨汁; 纳米金; 维生素C; 比色分析
1 引 言
维生素C（Vc）即抗坏血酸，是人体必需的营养物质，在维持机体正常代谢方面具有重要作用[1]。缺乏Vc会引起缺铁性贫血、动脉硬化、坏血病等; 而Vc摄入过量，尤其在儿童生长时期，易产生结石、骨骼疾病等，因此检测Vc含量至关重要[2]。目前，检测Vc的方法主要有原子吸收法[3]、电化学分析法[4～6]、色谱法[7]和荧光分析法[8]等。这些检测方法准确度高，灵敏度好，但仍存在一些不足，如需要昂贵的仪器、抗干扰差、前处理操作繁琐等。因此，开发成本低廉、抗干扰能力强、简单、快速检测Vc的方法十分重要。
近年来，基于纳米材料的比色分析法[9～11]成为研究热点。通过观察溶液颜色变化实现分析物的定性及半定量分析，结合紫外-可见吸收光谱的检测实现分析物的定量分析，方法快速，成本低廉且实用性强。金纳米粒子（AuNPs）因具有大的摩尔吸光系数、独特的光学性质而被用于金属离子[12～14]、蛋白质[15～17]和核酸[18～20]等的比色分析。
制备性能良好的AuNPs用于比色分析尤为重要。目前， AuNPs的合成主要采用化学还原法，以柠檬酸钠[21]、NaBH[22]和Vc[23]等为还原剂，但是这些试剂的使用可能对环境及人体产生潜在的危害，且制备的AuNPs耐盐能力有限，用于比色分析抗干扰能力较差，限制了在实际分析中的应用，需要进一步修饰从而改善其稳定性。字琴江等[24]以谷胱甘肽（GSH）为配体，以NaBH为还原剂，室温反应4 h，制备了GSH-AuNPs，并将其用于Vc的可视化检测，检出限低至0.75 μmol/L，抗干扰能力强。但是AuNPs需要进行修饰以增强其稳定性，制备过程耗时较长，制备后需超滤除去过量的GSH。天然植物中含有丰富的蛋白质、脂肪、有机酸等，可作为合成AuNPs的还原剂和保护剂，如茶叶[25]、香蕉皮[26]、甜叶菊[27]、荷叶[28]等，合成方法安全无毒，制备的AuNPs稳定性更好，抗干扰能力更强。目前，关于绿色合成的AuNPs用于Vc比色分析的研究还未见报道。
梨汁中富含蛋白质和多酚类化合物等成分，可作为还原剂和保护剂合成AuNPs。本研究以梨汁为原料合成AuNPs，方法简单快速，成本低，绿色环保。以此AuNPs为催化剂和晶种，利用Vc还原AgNO3生成的Ag单质，并沉积在AuNPs上，形成Ag/AuNPs。随着Vc含量的增加，沉积在AuNPs表面Ag越来越多，溶液颜色发生变化，结合紫外-可见吸收光谱仪检测，可实现Vc的定性与定量分析。实验原理见图1。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
UV-2600紫外-可见光谱仪、CT15RT冷冻离心机（上海天美科学仪器有限公司）; JYL-CO51料理机（山东九阳股份有限公司）;? S-4800型冷场发射扫描电子显微镜（日本日立公司）; TENSOR-37傅里叶红外光谱仪（德国布鲁克科学仪器公司）; ZS90型动态光散射粒度分析仪（英国马尔文仪器公司）; JEM-2010FEF-JEOL型透射电子显微镜（日本电子株式会社）。
三水合四氯金酸（HAuCl4·3H2O）、AgNO3（上海国药试剂公司）; 蔗糖、葡萄糖、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸（上海阿拉丁生化股份有限公司）; 其余试剂均为分析纯; 实验用水均为超纯水。皇冠梨购自当地市场。
2.2 梨汁绿色合成AuNPs
皇冠梨去皮切块，经料理机榨汁处理2 min，将汁液进行减压抽滤，滤液以9000 r/min离心5 min，过0.45 μm滤膜。梨汁易被空气氧化[29]，因此于-20℃保存，用前解冻。取100 μL梨汁和25 μL 0.01% HAuCl4溶液混合，加水至2.5 mL，70℃下加热30 min，即制得AuNPs。
2.3 柠檬酸钠为还原剂合成AuNPs
参考文献[30]方法，以柠檬酸钠为还原剂合成AuNPs。50 mL 0.01% （w/V）HAuCl4加热至沸腾后，快速加入1.5 mL 1% （w/V）柠檬酸钠，搅拌加热10 min，冷却至室温，即制得AuNPs，其最大吸收波长为532 nm。
2.4 AuNPs比色检测Vc
于10 mL比色管中依次加入300 μL AuNPs、1450 μL水、500 μL 0.1 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲溶液（pH=8.8）、500 μL 0.01 mol/L AgNO3和500 μL 40 mg/L Vc溶液，室温反应30 min，测定紫外-可见吸收光谱。
2.5 AuNPs比色检测Vc的特异性
为了考察AuNPs比色检测Vc方法的特异性，分别用400 mg/L的甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、硫酸镁、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、碳酸钾、天冬氨酸、蔗糖、混合溶液1（含上述10种干扰物质）、混合溶液2（含上述10種干扰物质和Vc）代替Vc，按照2.4节的方法进行检测，测定紫外-可见吸收光谱，其中Vc浓度为40 mg/L。
2.6 实际样品分析
于当地药店购买两种不同厂家生产的Vc药片（剂量均为100 mg/片），将药片研磨，配制成Vc理论浓度为5 mg/L的样品溶液，按照2.4节所述方法进行检测，并进行加标实验，计算加标回收率。
3 结果与讨论
3.1 AuNPs的合成
梨汁为淡黄色（图2A插图），以其制备的AuNPs溶液为紫红色，由紫外-可见吸收光谱图可知，梨汁吸收峰位于220 nm和277 nm （多酚类化合物）[31]，制备的AuNPs的紫外-可见吸收光谱中，220 nm和277 nm 处吸收峰均消失，536 nm处出现吸收峰，为AuNPs独有的表面等离子体共振（SPR）特征。由红外（IR）谱图（图2B）可见，在梨汁样品中，3371 cm1是多酚类化合物的O-H伸缩振动和蛋白质的NH伸缩振动; 2935 cm1是饱和CH伸缩振动; 2100 cm1是蛋白质中CN的伸缩振动; 1629 cm1是多酚类化合物CC和CO伸缩振动; 1403 cm1是饱和CH变形振动; 1250 cm1是多酚类化合物、酰胺CO伸缩振动; 1079 cm1是OH面内变形振动; 870和779 cm1是芳环上CH面外弯曲振动; 621 cm1是OH面外弯曲振动，表明制备的梨汁中含有蛋白质和多酚类化合物。制备的AuNPs中，3371 cm1移至3412 cm1，且吸收峰减弱，1629和1079 cm1处吸收峰变弱，2100、1250和621 cm1处吸收峰消失。对比梨汁制备AuNPs反应前后IR谱图可知，梨汁中起还原作用的主要是多酚类化合物，这与UV-Vis检测结果一致。Sanchez等[32]测得6种不同品种的梨肉中多酚类化合物的含量在28～81 μg/g范围内。文献[33]表明，没食子酸为天然多酚类化合物，可还原HAuCl4制备AuNPs，但需加热至50℃反应6 h，而梨汁可在室温下快速制备AuNPs，表明在梨汁制备过程中除多酚类化合物起还原作用外，蛋白质也发挥了还原作用。AuNPs的IR谱图中， 3412、3135、1629、1400和1109 cm1处的吸收峰分别对应OH伸缩振动、饱和CH伸缩振动、CO和CC伸缩振动、饱和CH变形振动和COC反对称伸缩振动，表明纳米粒子表面有保护基团，有利于AuNPs的分散性和稳定性。
由SEM图（图2C）可见，制备的AuNPs为球形，分散良好; TEM表征结果（图2D）表明，AuNPs平均
3.2 AuNPs合成条件的优化
梨汁合成AuNPs受多种因素影响，如梨汁用量、NaOH用量、反应温度和反应时间等。对AuNPs的合成条件进行了考察。如图3A所示，随梨汁用量增加，536 nm处的吸收值（A536）先增大后减小，当梨汁用量为80 μL时，A536达最大，表明此条件下AuNPs产量最大。碱性条件对晶核的形成具有重要影响[34，35]，因此，考察了NaOH用量对合成AuNPs的影响，由图3B可知，不加NaOH即可合成AuNPs，随着NaOH用量增加，AuNPs由紫红色变为粉红色，考虑到操作方便，后续实验选择不加碱。从图3C可知，50℃时开始有AuNPs生成，100℃时A536最大，故后续实验温度选择100℃。随着反应时间的延长，A536逐渐增加（图，25 min时达最大，选择合成反应时间为30 min。
3.3 梨汁合成的AuNPs的稳定性
考察了温度、离子强度和pH值对AuNPs稳定性的影响，与柠檬酸钠合成的AuNPs相比，在所制得的AuNPs的浓度和粒径保持一致的条件下，梨汁合成的AuNPs稳定性有所提高。图4A比较了两种AuNPs的热稳定性，在20、37、50、70和100℃下，AuNPs的A536均保持不变，说明两种方法制备的AuNPs具有良好的稳定性。如图4B所示，当NaCl浓度低于0.3 mol/L时，梨汁制备的AuNPs的A536基本不变，而柠檬酸钠合成的AuNPs的A536明显下降，说明AuNPs发生了团聚。图4C比较了在pH 3～12范围内AuNPs的稳定性，梨汁制备的AuNPs的A536没有发生变化，在pH10时，柠檬酸钠合成的AuNPs的A536明显下降，表明AuNPs发生了团聚。因此梨汁合成的AuNPs稳定性更佳，这可能与梨汁中多成分充当保护剂有关。
3.4 Vc的检测
AuNPs 比色检测Vc的原理是Vc还原AgNO3产生Ag， 并沉积在AuNPs表面，形成Ag/AuNPs，随着Vc浓度增大，沉积在AuNPs表面的银增多，裸露的AuNPs减少，金信号越来越弱，银信号越来越强，根据溶液颜色变化以及A432，实现Vc的定性和定量分析。采用UV-Vis、SEM、TEM和DLS表征验证，如图5A所示，与对照组相比（纯水取代Vc），加入Vc后溶液颜色发生变化，最大吸收波长由536 nm蓝移至432 nm; 随着Vc的浓度由10 mg/L增大至40 mg/L，溶液颜色加深，最大吸收波长发生红移，而且吸光度增大。SEM结果（图5B）表明， Ag/AuNPs粒径比AuNPs粒径明显增大; TEM结果（图5C）表明，Ag/AuNPs平均粒径约为56.9 nm; DLS结果表明，与制备的AuNPs相比，Ag/AuNPs粒子的水合粒径变大，粒径分布范围变宽。这些结果均表明， AuNPs比色检测Vc方法是可行的。
3.5 检测条件的优化
考察了AgNO3浓度、pH值和反应时间等因素对Vc检测的影响，结果如图6所示。AgNO3作为反应物，其浓度增加会使反应速度加快。AgNO3终浓度在0.30～2.15 mmol/L范围内（图6A），随浓度增加，A432逐漸增大，当超过1.54 mmol/L时，A432稍有下降。选择AgNO3终浓度为1.54 mmol/L。溶液pH值的影响见图6B，当pH=8.8时，A432最大。当反应6 min时，A432最大，此后趋于平衡（图6C）。因此后续实验选择AgNO3浓度为1.54 mmol/L，甘氨酸-NaOH缓冲溶液pH=8.8，反应时间为10 min。
3.6 方法的特异性
选取干扰物质甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、硫酸镁、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、碳酸钾、天冬氨酸、蔗糖、混合溶液1（含10种干扰物质）、混合溶液2（含10种干扰物质和Vc）进行实验，其中干扰物质浓度均为Vc浓度的10倍，结果如图7所示，只有加入Vc和混合溶液2时，溶液颜色发生变化，并能产生明显的A432信号。因此，本方法检测Vc具有较好的特异性。
3.7 方法的分析性能
在最优的实验条件下，考察了方法的分析性能。由图8A插图可知，Vc浓度为0.8 mg/L时，裸眼观察溶液颜色发生明显变化，随Vc浓度增大，溶液颜色由紫红色变为黄褐色，根据颜色变化可实现Vc可视化半定量检测。
由图8A可知，随着Vc浓度增大，A432增大。如图8B所示，Vc浓度在0.4～40 mg/L和40～80 mg/L范围内，A432和Vc浓度呈良好的线性关系，线性方程分别为y=0.0124x+0.0695（R2=0.9918）和y=0.0285x-0.5544（R2=0.9939）。方法的相对标准偏差RSD为1.6% （n=8，CVc=8 mg/L），检出限（LOD）为0.17 mg/L。与其它方法相比（表1），本方法线性范围宽，检出限低; 与NaBH4还原制备GSH-AuNPs比色检测Vc方法相比，检出限相当，但本方法制备AuNPs的时间短，无需修饰，绿色环保。
3.8 实际样品中Vc的分析
采用本方法测定了Vc药片中Vc的含量，加标回收率（表2）在89.5%～110.0%之间，表明本方法可用于实际样品分析。
4 结 论
本研究以梨汁为还原剂和保护剂合成了AuNPs，方法快速简便，绿色环保，与传统方法制备的AuNPs相比，本方法制备的AuNPs具有更好的稳定性。将制备的AuNPs用于Vc的检测，裸眼比色实现了Vc的定性分析，结合紫外-可见吸收光谱检测实现了Vc的定量分析。本方法特异性和选择性良好，可用于药品中Vc的检测，具有较好的应用前景。
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Green Synthesis of Gold Nanoparticles and Their
Application in Colorimetric Detection of Vitamin C
ZHANG Yuan*， ZHAI Jiang-Li， LI Fan-Lin， GUO Ping， YAN Xin
（Tangshan Normal University， Tangshan Key Laboratory of Green Specialty Chemicals， Tangshan 063000， China）
Abstract Gold nanoparticles （AuNPs） were prepared by reducing HAuCl4 with pear juice as reducing and protecting agent， which was rapid and environmentally friendly. AuNPs were characterized by scanning electron microscopy （SEM）， Fourier Transform Infra-Red （FT-IR） and ultraviolet-visible （UV-Vis） spectroscopy. Compared with AuNPs prepared using citrate sodium as reducing agent， AuNPs synthesized by pear juice were more stable. AuNPs were used for colorimetric detection of vitamin C. When this as-prepared AuNPs mixed with AgNO3 and vitamin C， AgNO3 was reduced to Ag by vitamin C and deposited on the surface of AuNPs to form Ag/AuNPs， which was accompanied by a color change， as well as the increase of the Ag/AuNPs peak absorbance at 432 nm monitored by UV-Vis detection. Vitamin C could be analyzed qualitatively by the naked eyes according to the color change and quantitatively by UV-Vis detection. The main factors influencing detection of vitamin C were investigated in detail， including the volume of AgNO3， the pH value and the incubate time. When the concentration of vitamin C was 0.8 mg/L， the solution could be observed from red to brown with naked eyes. The linear range of vitamin C was from 0.4 mg/L to 40 mg/L and from 40 mg/L to 80 mg/L， the relative standard deviation （R was 1.6% （n=8， CVc=8 mg/L） and the limit of detection （LOD） was 0.17 mg/L. This method had good selectivity and specificity and was applied to detect vitamin C in vitamin C tablets with recoveries ranging from 89.5% to 110.0%.
Keywords Pear juice; Gold nanoparticles; Vitamin C; Colorimetric detection
（Received 21 January 2020; accepted 29 April 2020）
This work was supported by the Science Foundation of Tangshan Normal University （Nos. 2017A02， 2017C05）.
2020-01-21收稿; 2020-04-29接受
本文系唐山師范学院科学研究基金项目（Nos. 2017A02， 2017C05）资助
* E-mail： 26769209@163.com
