PTEN与CyclinG1蛋白在婴幼儿血管瘤组织中的表达及意义

    余咸静 郑腾飞

    

    

    

    [摘要]目的：探究血管瘤組织第10号染色体丢失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）与细胞周期素G1（Cyclin G1）的表达。方法：回顾性分析142例血管瘤患儿临床资料，比较血管瘤瘤体组织与瘤旁组织、增殖期与消退期血管瘤组织、术后6个月内复发与未复发血管瘤组织PTEN、Cyclin G1蛋白表达情况，以受试者工作特征（ROC）曲线评估上述指标对血管瘤复发的预测效能，通过Pearson相关系数模型分析上述指标与血管瘤表面积、深度、微血管密度（MVD）的相关性。结果：PTEN蛋白表达情况比较显示，血管瘤瘤体组织明显低于瘤旁组织，增殖期血管瘤组织明显低于消退期血管瘤组织，预后复发血管瘤组织明显低于预后未复发血管瘤组织（P<0.05）;Cyclin G1蛋白表达情况比较显示，血管瘤瘤体组织明显高于瘤旁组织，增殖期血管瘤组织明显高于消退期血管瘤组织，预后复发血管瘤组织明显高于预后未复发血管瘤组织（P<0.05）。且PTEN、Cyclin G1蛋白表达水平联合预测复发的灵敏度与特异度可达64.10%、78.64%。血管瘤组织PTEN蛋白表达与病灶表面积、深度、MVD均呈显著负相关性（r<0，P0，P<0.05）。结论：血管瘤组织存在PTEN蛋白低表达与Cyclin G1蛋白过表达情况，且表达水平与病情、预后均联系紧密，可为疾病发生、发展的机制研究及临床预后评估提供指导。

    [关键词]第10号染色体丢失的磷酸酶及张力蛋白同源物;细胞周期素G1;血管瘤组织;蛋白表达;相关性

    Abstract： Objective? To explore the significance of phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten （PTEN） and cyclin G1 （Cyclin G1） in hemangioma tissues. Methods? The clinical data of 142 children patients with hemangiomas were retrospectively analyzed. The protein expressions of PTEN and Cyclin G1 were compared between hemangioma tissues and para-tumor tissues， between proliferative and regressive hemangioma tissues and between recurrent and non-recurrent hemangiomas within 6 months after surgery. The receiver operating characteristic （ROC） curve was used to evaluate the predictive efficacy of the above indexes on recurrence of hemangiomas. The correlation between the above indexes and the surface area， depth and microvessel density （MVD） of hemangiomas was analyzed by Pearson correlation coefficient model. Results? The expression of PTEN protein in hemangioma tissues was significantly lower than that in para-tumor tissues， and the expression in proliferative hemangioma tissues was significantly lower than that in regressive hemangioma tissues， and the expression in tissues with prognosis of recurrent hemangioma was significantly lower than that in tissues with prognosis of non-recurrence （P<0.05）. The expression of Cyclin G1 protein in hemangioma tissues was significantly higher than that in para-tumor tissues， and the expression in proliferative hemangioma tissues was significantly higher than that in regressive hemangioma tissues， and the? expression in tissues with prognosis of recurrent hemangioma was significantly higher than that in tissues with prognosis of non-recurrence （P<0.05）. The sensitivity and specificity of combined detection of PTEN and Cyclin G1 proteins were 64.10% and 78.64% in predicting recurrence. The PTEN protein expression in hemangioma tissues was significantly negatively correlated with surface area， depth and MVD of lesions （r<0， P0， P<0.05）. Conclusion? There is a low expression of PTEN protein and overexpression of Cyclin G1 protein in hemangioma tissues， and the expression levels are closely related to the disease condition and prognosis. They can provide guidance for the mechanism study of disease occurrence and development and the evaluation of clinical prognosis.

    Key words： phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten（PTEN）; Cyclin G1; hemangioma tissues; protein expression; correlation

    血管瘤是内皮细胞与周细胞异常增殖引起的常见良性肿瘤，婴幼儿较为常见，发病率可达4%～5%[1]，由于病灶位置浅表，可观察到红色丘疹、结节或斑块等症状，严重影响患儿外观，不利于其心身健康发育[2]。血管瘤具体发病机制目前尚未获得共识，可能与女性、早产、低出生体重、多胎妊娠、高龄产妇及父母毒性物质接触等因素有关[3]，尽管部分患儿能在数月后自行消退，但临床仍推荐开展早期治疗，以确保良好疗效与外观恢复[4]。近年来，肿瘤生物学行为分析已成为研究热点，第10号染色体丢失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）属于典型的抑癌基因表达蛋白，已证实能抑制肝癌细胞增殖[5];细胞周期素G1（Cyclin G1）则是典型的细胞周期负调控蛋白，能提高肝癌细胞放射线敏感度[6]。猜测血管瘤细胞编码PTEN也可能具有阻碍肿瘤浸润作用，对细胞周期异常激进状态可造成一定负面影响，导致Cyclin G1表达受到反馈抑制，猜想两者联合检测可对血管瘤生物学行为进行早期评估，从而对患儿病情作出及早判断，可为临床诊疗与病理基础研究提供一定参考。基于此，本研究旨在分析血管瘤组织表达PTEN、Cyclin G1蛋白与其疾病特征的关系，取得一定成果，现作如下报道。

    1? 资料和方法

    1.1 临床资料：回顾性分析2017年1月-2018年12月，于笔者医院接受治疗的142例血管瘤患儿临床资料。纳入标准：①临床表现与组织学病理检查结果均符合血管瘤相关诊断标准[7];②月龄≤24个月;③家长同意采集标本用作研究。排除标准：①术前已接受任何抗肿瘤措施;②身体条件无法耐受手术;③术中未能获得完整肿瘤病理组织与瘤旁组织。其中男32例，女110例;月龄为1～24个月，平均（11.57±8.26）个月;病灶位于颌面部74例，肩颈部29例，胸背部20例，腹部7例，四肢12例;病灶表面积为（11.83±3.64）cm2;病灶深度为（10.51±3.07）mm;病程为（9.74±3.25）个月;增殖期肿瘤79例，消退期肿瘤63例;术后随访6个月内复发39例（术后6个月内瘤体增大≥20%，或颜色加深程度≥20%可确诊为血管瘤复发），未复发103例。

    1.2 检测方法：组织采集后置于4%多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋，切片厚度4μm，72℃烘箱烤片1h，依次浸入二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇5～15min不等，进行脱蜡与水化处理;蒸馏水浸泡5min×3次，磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡5min×1次，以pH=6.0柠檬酸盐抗原修复液高压锅内处理3min，自然冷却2h至室温;PBS浸泡5min×3次，滴加3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，37℃下孵育30min;PBS浸泡5min×3次，滴加羊血清工作液封闭，37℃下孵育30 min;倾去血清不予洗涤，分别向不同标本加入兔抗人PTEN单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology有限公司提供）、兔抗人Cyclin G1单克隆抗体（上海优宁维生物科技有限公司提供），向空白对照标本滴加等体积PBS，4℃下孵育过夜;PBS浸泡5min×3次，滴加生物素化二抗，37℃下孵育30min;PBS浸泡5min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素工作液，37℃下孵育30min;PBS浸泡5min×3次，加入二氨基联苯胺（DAB）显色，低倍镜下观察组织显色情况后迅速以自来水冲洗5min终止反应;滴加苏木素染色液进行核染色1min，1%盐酸酒精分化液处理5s×3次，自来水冲洗5min反蓝;依次浸入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇1～5min不等，进行脱水处理，并以中性树胶固封，晾干并置于高倍镜下观察;随机选取5个视野，图像采集后拷贝至Image-Pro Plus 6.0图像处理软件，分别测算PTEN、Cyclin G1蛋白阳性产物积分光密度（IOD）值。

    1.3 统计学分析：研究数据均录入统计学软件SPSS 20.0进行处理，计数资料以例数表示，计量资料以均数±标准差（x?±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，不同组织之间比较采用配对t检验;将各指标同时纳入二元Logistic回归模型作为协变量，采用前进法，以返回概率作为联合预测指标;预后预测效能评估采用受试者工作特征（ROC）曲线，获取曲线下面积（95%CI）、靈敏度、特异度、截断值等统计参数;相关性分析采用Pearson相关系数模型，双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

    2? 结果

    2.1 瘤体组织与瘤旁组织蛋白表达情况比较：瘤体组织PTEN蛋白阳性产物IOD值明显低于瘤旁组织，Cyclin G1蛋白阳性产物IOD值明显高于瘤旁组织，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1、图1～2。

    2.2 增殖期与消退期血管瘤组织蛋白表达情况比较：增殖期血管瘤组织PTEN蛋白阳性产物IOD值明显低于消退期血管瘤组织，Cyclin G1蛋白阳性产物IOD值明显高于消退期血管瘤组织，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

    2.3 预后复发与未复发血管瘤组织蛋白表达情况比较：术后6个月内，预后复发患儿血管瘤组织PTEN蛋白阳性产物IOD值明显低于未复发患儿血管瘤组织，Cyclin G1蛋白阳性产物IOD值明显高于预后未复发患儿血管瘤组织，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

    2.4 预测效能评估结果：瘤体组织PTEN、Cyclin G1蛋白阳性产物IOD值预测血管瘤复发的截断值分别为0.3816、0.3005，联合预测灵敏度与特异度为64.10%、78.64%，见图3、表4。

    2.5 相关性分析结果：Pearson相关系数模型显示，血管瘤组织PTEN蛋白表达与病灶表面积、深度、MVD均呈显著负相关性（r<0，P0，P<0.05），见表5。

    3? 讨论

    PTEN基因定位于人10号染色体q23上，含有9个外显子与8个内含子，可编码出PTEN含有403个氨基酸，分子量为47kDa，蛋白N端有磷脂酰肌醇特异性结合域，是调控磷酸化酶的关键序列[8]。与其他抑癌基因蛋白不同，PTEN同时对脂质磷酸酶与蛋白磷酸酶具有双重活性，对磷脂酰肌醇3-蛋白激酶（PI3K-Akt/PKB）通路可产生较强拮抗作用，促使细胞周期停止在G1期，并令蛋白激酶从胞質向胞膜上转移，改变构象并向核内传递凋亡信号，导致细胞增殖停滞并走向凋亡[9-10]。本研究结果显示，血管瘤组织PTEN蛋白表达显著较瘤旁组织更低，增殖期血管瘤组织PTEN蛋白表达显著较消退期血管瘤组织更低，预后复发患儿血管瘤组织PTEN蛋白表达显著较预后未复发患儿血管瘤组织更低，且该指标与血管瘤表面积、深度、MVD均表现出明显负相关性，这表明血管瘤组织与其他肿瘤相似，PTEN呈现出低表达状态，增殖期瘤体内表达尤其活跃，可反映在病灶表面积、深度与MVD等浸润性指标上，表达水平越低，浸润行为越明显，手术有更大风险遗留微小癌灶，预后则有更大几率复发，因此可预测患儿预后情况，具有较高临床检测价值。相关专家表示，PTEN还能抑制肿瘤细胞中细胞外信号调节激酶-丝裂原活化蛋白激酶（ERK-MAPK）上游途径接头蛋白的磷酸化过程，进而产生负性调节，阻碍有丝分裂信号传递，并降低黏附斑激酶（FAK）的整合素活性，上调细胞黏附能力，抑制细胞骨架形成并阻碍其扩散，对肿瘤浸润与转移有较强拦截作用[11]。

    Cyclin G最初发现于小鼠成纤维细胞中，含有Cyclin G1、Cyclin G2、Cyclin G3三种亚型，其中Cyclin G1基因定位于5号染色体q32-q34上，含有6个外显子[12]。据相关文献报道，泛素蛋白连接酶、Cyclin G1均是抑癌基因p53的转录激活靶点，可将细胞周期锁定在G前期与G-S期，但由于反馈作用机制，野生型p53表达代偿性上调的同时，泛素蛋白连接酶与Cyclin G1表达水平随之增加，前者在细胞核内结合p53使其失活后失去生理病理效应，而Cyclin G1则呈现过表达状态[13-14]。本研究发现，血管瘤组织Cyclin G1蛋白表达显著较瘤旁组织更高，增殖期血管瘤组织Cyclin G1蛋白表达显著较消退期更高，预后复发患儿血管瘤组织Cyclin G1蛋白表达显著较预后未复发患儿血管瘤组织更高，且该指标与血管瘤表面积、深度、MVD均表现出明显正相关性，提示血管瘤组织可发生Cyclin G1过表达状态，表达量越高可反映肿瘤处于增殖期，由于抑制p53活性，细胞周期控制失效，肿瘤扩张更快，预后效果更差，但具体影响机制仍有待进一步基础试验研究确证。本研究还发现，PTEN联合Cyclin G1蛋白联合检测，可较为准确预测血管瘤患儿预后复发情况，究其原因可能与两种蛋白从不同路径共同影响血管瘤细胞周期与生物学行为有关，因而联合检测对病理机制研究与预后判断有重要意义。Li等[15]认为，Cyclin G1蛋白能借助与蛋白磷酸酶2A结合，促使泛素蛋白连接酶去磷酸化，从而加剧p53泛素化作用，肿瘤细胞失去负性调节而走向恶变，蛋白磷酸酶2A受到PTEN负性控制，因此同时检测PTEN、Cyclin G1对早期辨识肿瘤恶变行为尤其关键。

    血管瘤组织表达PTEN蛋白较为沉默，表达Cyclin G1蛋白较为活跃，尤其增殖期与预后复发病灶组织含量偏离明显，两者表达水平与肿瘤细胞周期运行、细胞增殖等行为均存在一定关系，免疫组织化学检测可帮助临床了解血管瘤发生、发展相关病理机制，并对患儿预后作出较为准确的预测，为早期预防性干预措施提供参考。

    [参考文献]

    [1]Léauté-Labrèze C，Harper JI，Hoeger PH.Infantile haemangioma[J].Lancet，2017，390（10089）：85-94.

    [2]金玲琴，罗宏宾，曹毅.婴幼儿血管瘤药物治疗进展[J].中国皮肤性病学杂志，2016，30（5）：520-523.

    [3]王静，赵卓，王艳红，等.辽宁省婴幼儿血管瘤及其相关因素的Logistic回归分析[J].中国皮肤性病学杂志，2017，31（6）：619-622，626.

    [4]谭红梅，吴炜，赵居艳，等.婴幼儿血管瘤治疗进展[J].中国美容医学，2019，28（5）：163-166.

    [5]王文耀，张鸿飞，唐淼，等.miR-21在肝癌中的表达及其与PTEN的关系[J].中国普通外科杂志，2017，26（3）：395-400.

    [6]许刚，王燕，吴立广，等.Cyclin G1对肝癌细胞HepG2放射敏感度的影响及其机制[J].肿瘤防治研究，2017，44（9）：590-595.

    [7]中华医学会整形外科分会血管瘤和脉管畸形学组.血管瘤和脉管畸形诊断和治疗指南（2016版）[J].组织工程与重建外科，2016，12（2）：63-93.

    [8]Liu JL，Zhang WQ，Huang MY.Transcription start site-associated small RNAs in the PTEN gene[J].Proc Natl Acad Sci USA，2017，114（49）：E10510-E10511.

    [9]Wise HM，Hermida MA，Leslie NR.Prostate cancer， PI3K， PTEN and prognosis[J].Clin Sci （Lond），2017，131（3）：197-210.

    [10]Wang LL，Hao S，Zhang S，et al.PTEN/PI3K/AKT protein expression is related to clinicopathological features and prognosis in breast cancer with axillary lymph node metastases[J].Human Pathol，2017，61（5）：49-57.

    [11]Dragoj M，Bankovic J，Sereti E，et al.Anti-invasive effects of CXCR4 and FAK inhibitors in non-small cell lung carcinomas with mutually inactivated p53 and PTEN tumor suppressors[J].Invest New Drugs，2017，35（6）：718-732.

    [12]Dolly SO，Gurden MD，Drosopoulos K，et al.RNAi screen reveals synthetic lethality between cyclin G-associated kinase and FBXW7 by inducing aberrant mitoses[J].Br J Cancer，2017，117（7）：954-964.

    [13]Liu L，Michowski W，Inuzuka H，et al.G1 cyclins link proliferation， pluripotency and differentiation of embryonic stem cells[J].Nat Cell Biol，2017，19（3）：177-188.

    [14]Yan J，Jiang JY，Meng XN，et al.MiR-23b targets cyclin G1 and suppresses ovarian cancer tumorigenesis and progression[J].J Exp Clin Cancer Res，2016，35（1）：31.

    [15]Li G，Song Y，Li G，et al.Downregulation of microRNA?21 expression inhibits proliferation， and induces G1 arrest and apoptosis via the PTEN/AKT pathway in SKM?1 cells[J].Mol Med Rep，2018，18（3）：2771-2779.