基于阴离子交换策略的自供能生物传感平台超灵敏检测肝素

    盖盼盼 孔新珂 赵仕凡 李峰

    

    

    

    摘?要?基于生物燃料电池的自供能生物传感器，目标物浓度直接与生物燃料电池的输出信号成比例关系，因此，自供能生物传感平台具有无需额外电源、装置简单、利于微型化、抗干扰能力强等突出优势。但是，生物燃料电池中常用的生物催化剂易失活，导致自供能生物传感器性能不佳。本研究采用分子印迹多孔金阳极为生物阳极，实现对葡萄糖的选择性催化，以Fe（CN）63/聚咪唑鎓盐（Pim）/还原氧化石墨烯复合物Fe（CN）63/Pim/rGO为生物阴极，构建生物燃料电池，集成阴离子交换策略与分子印迹技术，发展了一种基于生物燃料电池的自供能生物传感方法，实现了肝素（Hep）的超灵敏检测。当无目标分子Hep存在时，基于生物燃料电池的自供能生物传感器可获得较高的开路电压与输出功率;加入Hep后，由于聚合物Pim对Hep的亲和性远大于Fe（CN）63，导致Fe（CN）63从复合物Fe（CN）63/Pim/rGO中释放，致使生物阴极得电子活性物质减少，阴极还原信号明显减弱，此时，开路电压和功率输出显著降低。基于此，可通过检测生物燃料电池输出性能的变化实现Hep的超灵敏检测，检出限低至0.01 pmol/L，低于目前文献中报道的检测方法。

    关键词?生物燃料电池; 分子印迹多孔金; 阴离子交换原理; 肝素; 铁氰化钾/聚咪唑鎓盐/还原氧化石墨烯复合物; 自供能生物传感器

    1?引 言

    基于生物燃料电池（Biofuel cell，BFC）的自供能生物传感器，目标物浓度直接与生物燃料电池的输出信号成比例关系，因此，自供能生物传感平台具有无需额外电源、装置简单、利于微型化、抗干扰能力强等独特优势，在临床诊断、食品分析、环境检测等领域具有广阔的应用前景[1，2]。Dong等[3，4]基于酶活性、位阻效应等实现了重金属离子与生物酶的自供能检测; 也有研究者将生物共轭体与生物燃料电池结合，实现了糖基化产物与抗生素的超灵敏检测[5，6]。上述自供能生物传感平台为生化分析及生物传感提供了新技术。由于自供能生物传感方法是基于BFC生物阴阳极设计，因此，电池输出性能直接影响传感器的灵敏度与稳定性，尤其是生物来源的酶的稳定性是自供能传感器稳定的前提，但天然酶极易失活[7]。研究发现，多种纳米材料（如MnO2纳米片、金纳米粒子（AuNPs））等对葡萄糖具有良好的催化性能，与传统生物酶相比，纳米材料具有合成方法简单、稳定性好、成本低等优势。因此，基于纳米材料构建生物燃料电池在稳定性与成本方面更具优势[8]。例如，Lin等[9]的研究表明，修饰于介孔硅表面裸露的AuNPs表现出两种类酶的性能（葡萄糖氧化酶和過氧化物酶），既能催化葡萄糖氧化，又能催化过氧化氢反应。但是，AuNPs对葡萄糖的催化活性受pH值影响较大。相比之下，多孔纳米金（NPG）具有独特的三维结构，活性几乎不受外界因素干扰，且稳定性更高[10，11]。分子印迹聚合物（MIP）是通过分子印迹技术合成对特定目标分子（模板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物，其中的识别位点可通过氢键作用、静电作用、共价作用等识别目标分子[12]。为增强阳极材料对葡萄糖催化的选择性，Li等[13]将分子印迹聚合在泡沫镍表面，实现了对碱性环境中的葡萄糖选择性检测。本研究将MIP引入到多孔纳米金中，特异性识别葡萄糖，并作为生物燃料电池的阳极。

    将超分子识别与分析检测机理结合，发展新型传感分析方法，利于拓宽分析目标物检测范围; 将超分子识别与荧光法结合，可识别并检测各种阴离子物质[14]; 将超分子识别与电化学方法结合，可实现电化学惰性分子的安培检测。其中，阴离子交换反应是利用配位受体实现阴离子物质的识别与传感[15]。肝素（Hep）作为一种重要的惰性生物分子，在调控各种生理病理等过程中发挥了重要作用，如常见的凝血和炎症反应、细胞生长、免疫防御、脂质转运和代谢等[16]。目前，检测Hep的方法主要有荧光法[17～19]、比色法[20]等，但存在灵敏度较差、步骤繁琐等缺点。电化学检测法灵敏度高、成本低、效果好，但此类研究较少，且强负电性的电化学惰性Hep较难检测。研究者利用正电性聚合物能与很多阴离子形成离子氢键（CH）+···X的属性，实现了惰性分子Hep的检测[21～23]。

    本研究将阴离子交换策略和分子印迹技术结合，构建了基于生物燃料电池的自供能生物传感器，实现了肝素的超灵敏检测。自供能生物传感器由分子印迹纳米多孔金（MIP/NPG）的生物阳极及Fe（CN）63/聚咪唑鎓盐（Pim）/还原氧化石墨烯复合物（Fe（CN）63/Pim/rGO）生物阴极构成。在本研究中，MIP/NPG在中性条件下能实现葡萄糖的有效氧化。MIP/NPG修饰的生物阳极构建过程及肝素自供能检测原理见图1。首先，将纳米多孔金修饰于ITO表面，然后通过电聚合的方式将MIP修饰于NPG上（图1A），洗脱葡萄糖模板分子后，可实现对葡萄糖的选择性检测。对于生物阴极，将带正电荷的Pim固定到rGO/ITO表面，带负电荷的Fe（CN）63通过静电作用吸附到Pim/rGO/ITO表面。对于组装完成的自供能检测体系（图1B），当无Hep存在时，阳极MIP/NPG催化葡萄糖氧化产生电子，经外电路，阴极Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO得电子，产生较强的阴极还原电流与较高的开路电压（EOCV）。当Hep存在时，生物阴极发生阴离子交换反应，Hep吸附到Pim上，导致Fe（CN）63从Pim/rGO/ITO阴极脱离，阻碍了Fe（CN）63的还原过程，导致生物燃料电池的最大功率输出（Pmax）和EOCV都明显降低，从而实现Hep的超灵敏检测。将此自供能生物传感器用于检测实际血清样本，结果令人满意。本研究构建的传感平台在生物体系代谢成分检测方面具有较好的应用前景。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    JSM-7500F扫描电子显微镜（日本电子株式会社）; HT7700 透射电子显微镜、CF15RX Ⅱ 离心机（日本日立公司）; Milli-Q 纯水系统（美国Millipore公司）; Autolab PGSTAT 302N电化学工作站（瑞士万通公司）。

    β-D-葡萄糖（日本东京化学工业株式会社）; 丙烯酰胺、N，N′-亚甲基丙烯酰胺（MBA）、K2SO4、K2S2O8（国药控股（上海）化学试剂有限公司）; 2，2-偶氮异丁腈（AIBN）、Hep、1-乙烯基咪唑和1-氯丁烷（美国Sigma 公司）; 氧化石墨烯（GO，南京先丰纳米材料科技有限公司）。支持电解质为Na2HPO4和NaH2PO4配制的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）。所用试剂均为分析纯，实验前无需纯化或处理。实验用水为超纯水（电阻率>18.2 MΩ cm）。

    2.2?MIP/NPG生物阳极的制备

    按照文献[24]的方法合成NPG，取50 μL NPG滴涂在ITO表面（电极面积为0.5 cm × 0.5 cm），37℃干燥2 h。随后，通过自由基聚合法制备MIP，具体步骤为：将100 μL 0.1 mmol/L葡萄糖，加入含42 μmol/L丙烯酰胺、0.4 mol/L K2SO4、10 mmol/L K2S2O8和8.0 mmol/L交联剂MBA的5 mL水溶液，充氮气1 h后，以NPG/ITO电极为工作电极，采用循环伏安法（CV，电压范围为0.80～1.00 V，扫描速率为100 mV/s）进行电聚合，在甲醇-乙酸（9∶1，V/V）溶液中洗脱20 min，除去葡萄糖模板分子，将电极置于PB（pH 7.4）中浸泡2 min，即制得MIP/NPG/ITO电极，室温干燥，备用。

    2.3?Pim/rGO/ITO电极的制备

    通过自由基聚合法制备得到Pim[21]，具体步骤为：将[Vbim][Cl]（3.0 g）、AIBN（0.015 g）、氯仿（30 mL）加入到三口烧瓶中，氮气氛围下，60℃油浴中混合搅拌反应18 h，冷却到室温，随后加入乙醚，形成沉淀，在45℃进行旋蒸，获得的产物在50℃下真空干燥过夜，于4℃保存，备用。依照文献[25]的方法采用电化学方法制备rGO，取60 μL GO溶液（0.38 mg/mL）涂敷在ITO表面（电极面积为0.5 cm × 0.5 cm），37℃干燥1.5 h，采用电化学还原法制得rGO，电压范围为1.5～0.5 V，聚合速率为100 mV/s，电解质溶液为0.10 mol/L PB（pH 7.4）。最后，取60 μL制备的Pim溶液滴涂在上述制得的rGO/ITO电极表面，37℃干燥后，制得Pim/rGO/ITO电极。

    2.4?Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物阴极的构建

    将制得的Pim/rGO/ITO电极置于含1 mmol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L PB缓冲溶液中进行CV电聚合，电压范围为0.2～0.6 V，扫描速率为50 mV/s。 将电极取出，在0.10 mol/L PB溶液中，按照上述CV参数继续扫描，直至获得稳定的氧化还原峰，即得到Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物阴极，干燥后备用。

    2.5?Hep的自供能生物传感检测

    基于MIP/NPG生物阳极与Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物阴极，构建基于生物燃料电池的自供能传感平台。电解质为含5 mmol/L葡萄糖的0.10 mol/L PB（pH 7.4）。首先，测定BFC的最大EOCV和Pmax。随后，将Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物阴极浸泡在Hep溶液中，孵育一定时间后，取出电极，用水冲洗，测量BFC的开路电压和输出功率。

    3?结果与讨论

    3.1?阳极材料形貌及催化性能表征

    NPG形貌对葡萄糖催化性能有很大影响。采用扫描电子显微镜（SEM）对NPG与MIP/NPG的形貌进行表征。NPG具有多孔网状结构（图2A），去除模板后的MIP/NPG形貌均一（图2B）。MIP具有较多活性位点和均一的孔结构，有利于识别并催化葡萄糖分子。

    MIP的存在提高了NPG对燃料葡萄糖的选择性，相比于NPG，MIP/NPG是一种更理想的催化剂。本研究考察了MIP/NPG在中性环境下对葡萄糖的催化效果。如图3所示，葡萄糖氧化的初始电位值为0.3 V，随着葡萄糖浓度递增，催化电流也逐渐增加。

    当葡萄糖浓度为0.6 mmol/L、电压为0.4 V时，催化电流达到110 mA，表明阳极材料MIP/NPG对葡萄糖具有優异的催化氧化性能。与之前报道的多孔金纳米粒子的催化性能相比[24]，催化电流明显增大。

    3.2?生物阴极材料形貌表征

    生物阴极Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO的设计是自供能生物传感检测Hep的关键。还原氧化石墨烯（rGO）具有优异的导电性、大的比较面积，不仅可用于固定大量聚合物Pim，还可增强电极的导电性[25]。采用透射电子扫描显微镜（TEM）与SEM对氧化石墨烯（GO）、rGO的形貌进行了表征（图4A和4C），GO与rGO均为均匀的薄膜状态，分散性好。在TEM图中，合成的Pim呈片状结构（图4B），表明成功合成受体Pim。同时，对Pim/rGO的形貌进行了SEM表征（图4D），Pim/rGO呈现较好的均匀连续的褶皱结构，此结构利于Fe（CN）63吸附。

    3.3?阴极催化性能表征

    采用CVs测试了阴极的电化学性能。如图5A所示，相比于裸ITO电极，Pim/rGO/ITO电极充电电流明显增加，表明rGO和Pim具有更大的比表面积。

    相比之下，Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO電极有一对明显的氧化还原峰，归因于吸附到电极上的Fe（CN）63在电极表面良好的电子转移过程。采用微分脉冲伏安法（DPV）对不同浓度的Hep进行检测。在含有不同浓度Hep的0.1 mol/L PB缓冲溶液（pH 7.4）中，随着Hep浓度增大，Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO电极电流逐渐降低，表明Fe（CN）63在电极表面上的还原反应逐渐减弱。这说明加入Hep，置换了吸附在Pim膜表面的Fe（CN）63，Fe（CN）63浓度降低，生物阴极还原性能明显减弱。

    考察了Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO电极在Hep溶液中的浸泡时间对生物阴极还原电流的影响，如图6所示，当Hep浓度为20 pmol/L时，随浸泡时间延长，电流降低，浸泡时间为0.6 min时，即可以观察到电流信号的明显变化，表明Hep与K3Fe（CN）6之间阴离子交换反应速度较快。因此，阴离子交换诱导生物阴极还原电流变化为Hep的定量分析奠定了基础，同时证实了自供能生物传感检测Hep的可行性。

    3.4?BFC性能表征

    以Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO为生物阴极，MIP/NPG/ITO为生物阳极，构建了无隔膜BFC。在常温常压条件下，BFC在含5 mmol/L葡萄糖的PB缓冲液（pH 7.4）中稳定运行。如图7A所示，BFC最高EOCV可达0.78 V，最大电流密度为0.35 mA/cm2，Pmax达到120 μW/cm2，BFC的功率输出在20天内几乎保持不变（图7B），表明所构建的BFC具有优异的稳定性，为构建性能优异的自供能生物传感器奠定了基础。

    3.5?基于BFC的自供能生物传感器对Hep的检测

    基于所构建的生物燃料电池，发展了自供能生物传感检测平台，实现了Hep的检测。随着Hep浓度增大，负电性更强的Hep置换Fe（CN）63，使其从Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物阴极上脱离，导致生物阴极得电子物质减少，信号减弱，从而影响BFC功率，输出Pmax随之降低（图8A）。当Hep浓度在0.1～100 pmol/L之间时，Pmax与Hep浓度的对数呈线性关系（图8B），线性方程为Pmax=52.12-13.87lgCHep（R2=0.9953），检出限（LOD）为0.01 pmol/L（S/N=3），完全满足术后与长期护理中临床相关监测的要求（1.7～10 μmol/L）[26]。与目前报道的检测Hep的方法相比（表1），本方法具有较低的检出限与较宽的线性范围。

    3.6?实际样品分析

    将此自供能生物传感器用于实际血清样品中Hep的检测。如表2所示，3个加标水平下的回收率在925%～102.5%之间，相对标准偏差（RSDs）低于3.2%，表明此传感器具有较好的重现性。更重要的是，此自供能生物传感器对Hep的检出限低至0.01 pmol/L，有望应用于临床诊断中Hep的生物测定。

    4?结 论

    将阴离子交换策略与分子印迹技术结合，构建了基于生物燃料电池的自供能生物传感器，实现了Hep的高灵敏检测。Fe（CN）63/Pim/rGO/ITO生物阴极中，Pim与Hep之间具有强的亲和力，置换出生物阴极中Fe（CN）63，使其脱离电极，生物阴极活性降低，导致BFC输出功率降低。根据Pmax信号的变化实现对Hep的高灵敏检测，检出限低至0.01 pmol/L，优于目前报道的检测方法。此外，此装置不需要外部电源供电，传感设备简单、易于携带，便于现场实时监测。本研究所构建的超灵敏、简易的自供能生物传感系统在医学和生物体系的现场实时监测中具有良好的应用前景。

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